專利名稱：：用于多肽的雙標(biāo)記以容許質(zhì)譜分析中的多通道化的化合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了通過(guò)質(zhì)譜方法篩選目標(biāo)(targets)的方法和工具。更特別地，本發(fā)明的方法和工具容許利用同位素和同量異序肽標(biāo)記(isotopicandisobaricpeptidelabelling)過(guò)程的組合利用液相色譜質(zhì)鐠法平行篩選多個(gè)樣品。
背景技術(shù)：
：來(lái)自高度復(fù)雜的混合物的蛋白質(zhì)的分析和鑒定需要巨大的分辨能力。通常用于分辨這樣的混合物的兩種方法是2-維凝膠電泳(2D-GE)和(2維的)液相色譜法((2D)-LC)。高分辨率2D誦GE由Klose(1975)7/ww""ge"";l26,231-243和0'Farre11(1975),J.Ao/.CTzem.250,4007-40021引進(jìn)。2D國(guó)GE在分辨率上是非常卓越的(>5000蛋白質(zhì))，但是受到缺乏自動(dòng)化和重現(xiàn)性的困擾。此外，蛋白質(zhì)例如疏水膜蛋白、堿性蛋白、酸性蛋白、非常大的或非常小的蛋白質(zhì)是難以分辨的。對(duì)于逃避使用凝膠電泳鑒定的許多有前景的疾病標(biāo)志物，2D-LC提供了很好的選擇，容許復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物的高分辨率分離[HanashWa/.(2003)A^/w廠e422,226-232;LiptonWa/.(2002)尸roc.AAaf/.」cadSc/.L/"&499,11049-11054]。2D-LC方法比2D-GE更適合于分離較小的蛋白質(zhì)，并且自動(dòng)化性和處理量顯著地更好。已經(jīng)描述了通過(guò)液相色鐠法分離蛋白質(zhì)/肽消化物的幾種技術(shù)，包括毛細(xì)管電泳(CE)、反相(RP)HPLC、和2-維液相色譜法。一般地，2D-GE或2D-LC分離的肽和蛋白質(zhì)通過(guò)質(zhì)譜法或通過(guò)測(cè)定氨基酸組成和/或氨基酸序列來(lái)鑒定。在通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定不同樣品(例如，疾病對(duì)比對(duì)照)之間統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的蛋白質(zhì)表達(dá)差異方面最相關(guān)的難題是來(lái)自不同樣品的MS信號(hào)的相對(duì)定量。因而，高度希望的是開(kāi)發(fā)一些方法，其容許平行地加工多個(gè)樣品來(lái)盡可能降低不同樣品之間的技術(shù)上的變化性。近來(lái)，已經(jīng)引入了兩種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。第一種技術(shù)被稱為同位素編碼的親和標(biāo)簽(Isotope-CodedAffinityTag,ICAT)技術(shù)，容許基于相關(guān)蛋白質(zhì)混合物的差異化同位素標(biāo)簽化進(jìn)行定量的蛋白質(zhì)組學(xué)分析[GygiWa/.(1999)A^.Ao&c/mo/.17,994-999]。描述的ICAT試劑利用了三種功能元件用于還原的半胱氨酸殘基的選擇性標(biāo)記的硫醇反應(yīng)基團(tuán)(thiol-reactivegroup),生物素親和標(biāo)簽以容許半胱氨酸標(biāo)記的肽的選擇性分離，以及同位素標(biāo)簽，其以兩種同位素形式合成，"輕"(非同位素)或"重"(利用2H或"C)形式。由于僅中度數(shù)量的產(chǎn)生的肽在它的原始序列中含有半胱氨酸，所以消化的親和純化的樣品的復(fù)雜度顯著降低。兩種獨(dú)立標(biāo)記的肽樣品("輕，，對(duì)比"重，，)在它們進(jìn)行分離技術(shù)如液相色鐠之前被組合(附圖1),隨后是MS筌定。一種可選擇的方法利用同量異序標(biāo)記的試劑，稱為用于相對(duì)和絕對(duì)定量的同量異序標(biāo)簽(IsobaricTagforRelativeandAbsoluteQuantitation,iTRAQ)。Ross等人(2004,A/o/.Ce〃./Vo&omz"3,1154-1169)描述的這種技術(shù)提供了四種不同的iTRAQ試劑，各自含有報(bào)告基團(tuán)、平衡基團(tuán)和與伯胺基團(tuán)反應(yīng)的肽反應(yīng)基團(tuán)(附圖3)。報(bào)告基團(tuán)是具有114、115、116或117Da的質(zhì)量的基團(tuán)，取決于每種試劑中12C/13C和160/180的差異化的同位素組合。平衡基團(tuán)在質(zhì)量上從31到28Da變化，以確保對(duì)于所述四種試劑，報(bào)告基團(tuán)和平衡基團(tuán)的組合的質(zhì)量保持恒定(145Da)。因此，用這些試劑的每一種(包含報(bào)告基團(tuán)和平衡基團(tuán)中不同同位素的特定組合)標(biāo)記相同的肽產(chǎn)生了同量異序的并在液相色譜中共同洗脫從而是色譜分析不能區(qū)分的肽。在MS/MS分析期間，來(lái)自所述肽的報(bào)告基團(tuán)離子碎片顯示114到117Da的不同的質(zhì)量。這些碎片的強(qiáng)度可以用于定量單獨(dú)的肽。因而，在四種不同的樣品中特定肽的存在可以通過(guò)用不同的iTRAQ試劑標(biāo)記每一種樣品來(lái)差異化地測(cè)定。iTRAQ標(biāo)記物被用于從MS/MS譜定量相對(duì)和絕對(duì)肽豐度，并容許在單次實(shí)驗(yàn)中標(biāo)記多達(dá)四種不同的樣品。此外，標(biāo)記的肽是同量異序的并且都產(chǎn)生一種離子物種，其在MS中觀察到并被用于CID。這產(chǎn)生了提高的信號(hào)強(qiáng)度以及正確的肽鑒定的提高的可能性，特別是對(duì)于具有低豐度的分子而言，其是許多生物學(xué)上有意義的蛋白質(zhì)的特征。近來(lái)，商業(yè)上可獲得的ITRAQ試劑的組已經(jīng)變成八種，包括具有113、118、119和121的質(zhì)量的4艮告基團(tuán)。MS信號(hào)的絕對(duì)和相對(duì)定量在通過(guò)基于質(zhì)語(yǔ)方法的技術(shù)的生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)方面是未解決的問(wèn)題。然而，不同的樣品，例如(不同的疾病組，疾病的不同發(fā)展階段、疾病對(duì)比對(duì)照/健康)之間的相關(guān)表達(dá)差異的鑒定需要高度可重現(xiàn)的技術(shù)，因?yàn)橄嚓P(guān)的生物標(biāo)記物僅能來(lái)自大量的測(cè)量。以上描述的ICAT和iTRAQ技術(shù)容許2個(gè)(ICAT)或多達(dá)4或8個(gè)(iTRAQ)單獨(dú)的樣品的多通道化，并容許同時(shí)地處理它們從而最小化技術(shù)變化性。盡管如此，這兩種方法都具有顯著的局限性。ICAT方法僅容許研究?jī)煞N不同的樣品或兩個(gè)疾病組，其通常不能代表疾病相關(guān)群組的全部系歹'J(例如，疾病的不同發(fā)展階段)。因此，非常有益的是擁有可用的技術(shù)，其容許研究超過(guò)2個(gè)群組。雖然容許多個(gè)樣品的分析，iTRAQ技術(shù)具有明顯的缺點(diǎn)，它需要對(duì)每個(gè)MS信號(hào)(對(duì)于未標(biāo)記的和標(biāo)記的肽)進(jìn)行MS/MS用于報(bào)告信號(hào)的相對(duì)定量。實(shí)際上，當(dāng)起始材料具有高度復(fù)雜性，例如在人類血清或其他體液中時(shí)，這是不可行的，因?yàn)榉治鰧⑹欠浅：臅r(shí)的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明通過(guò)在一種單一標(biāo)記試劑中組合同位素標(biāo)記物組件(isotopiclabelcomponent)和同量異序才示i己物纟且4牛(isobariclabelcomponent)克服了現(xiàn)有技術(shù)的有限的多通道化。通過(guò)產(chǎn)生可以使用的更大數(shù)量的差異化標(biāo)記試劑，組合的樣品檢測(cè)的多通道性被提高。根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)記工具和方法具有的優(yōu)點(diǎn)是，差異化標(biāo)記的肽可以在MS上容易地鑒定，從而將分析限制到感興趣的肽上。本發(fā)明的雙標(biāo)記方法的使用具有的優(yōu)點(diǎn)是，質(zhì)譜法的分析時(shí)間被顯著降低，因?yàn)橹挥性诓煌瑯悠分g觀察到肽的差異化表達(dá)的那些肽才需要通過(guò)MS/MS來(lái)分析。利用本發(fā)明的標(biāo)記方法的工具和方法對(duì)于蛋白質(zhì)樣品的多重篩選(multiplescreening)是有興趣的。更特別地，它們使得同時(shí)測(cè)定不同蛋白質(zhì)樣品中蛋白質(zhì)的定量和/或定性差異成為可能。這可以用于測(cè)定表達(dá)水平方面的差異，以及還容許測(cè)定不同的蛋白質(zhì)樣品之間蛋白水解力口工(proteolyticprocessing)方面的差異，例如，在疾病的情境中。就此來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供了可以被直接比較的用于不同樣品的多重篩選的方法，例如，在比較疾病的不同階段和/或不同的疾病形式方面。本發(fā)明的標(biāo)記試劑容許進(jìn)行多通道標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，其中僅使用一個(gè)標(biāo)記步驟。雖然所有差異化標(biāo)記的蛋白質(zhì)的最終鑒定是由MS/MS保證的，但是蛋白質(zhì)或肽上同位素標(biāo)記物的存在容許在MS譜中鑒定所有差異化標(biāo)記的肽，因?yàn)樗鼈儗⒆鳛椴煌莫?dú)立的峰出現(xiàn)，具有與同位素標(biāo)記物中的差異相應(yīng)的質(zhì)量差異。這容許了將進(jìn)一步的MS/MS分析限制到在MS步驟中已經(jīng)被鑒定為被差異化表達(dá)的那些肽上。此外，親和標(biāo)記物的存在容許進(jìn)一步將第一MS分析限制到被有效地標(biāo)記的肽上。本發(fā)明的特別的和優(yōu)選的方面在附隨的獨(dú)立和從屬權(quán)利要求中列出。從屬權(quán)利要求的特征可以視情況與獨(dú)立權(quán)利要求的特征以及與其他從屬權(quán)利要求的特征組合，而不僅僅是如權(quán)利要求中明確闡述的那樣。本發(fā)明的第一方面涉及用于多肽的質(zhì)譜分析的一組標(biāo)記試劑，每種標(biāo)記試劑包含異重標(biāo)記物組件(allobariclabelcomponent)、蛋白質(zhì)/肽反應(yīng)基團(tuán)、以及包含報(bào)告基團(tuán)(RP)和平衡基團(tuán)(BG)的同量異序標(biāo)記物組件(isobariclabelcomponent)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述異重標(biāo)記物組件是同位素標(biāo)記物組件，其不被包含在所述標(biāo)記試劑的同量異序標(biāo)記物組件之內(nèi)。做為選擇，異重標(biāo)記物組件:故包含在標(biāo)記試劑的同量異序標(biāo)記物的報(bào)告基團(tuán)和/或平衡基團(tuán)之內(nèi)。在本發(fā)明的標(biāo)記試劑的一個(gè)實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)/肽反應(yīng)基團(tuán)與蛋白質(zhì)或多肽中的半胱氨酸殘基反應(yīng)。本發(fā)明的特定的實(shí)施方式提供了如上所述的標(biāo)記試劑，進(jìn)一步包含親和標(biāo)簽，其任選地是可裂解的(cleavable)。在一個(gè)進(jìn)一步的特定實(shí)施方式中，所述親和標(biāo)簽是生物素，或由其衍生的分子。本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面提供了同時(shí)分析不同的樣品中包含官能團(tuán)的一種或多種多肽的存在的方法，其包括標(biāo)記步驟，其中每種樣品用才艮據(jù)本發(fā)明的一組差異化雙標(biāo)記試劑中的一種來(lái)標(biāo)記，所述標(biāo)記試劑具有相同的或基本上相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)并包含異重的和同量異序的標(biāo)記物組件。該標(biāo)記步驟通過(guò)容許標(biāo)記試劑的蛋白質(zhì)反應(yīng)基團(tuán)與樣品中一種或多種多肽或由其產(chǎn)生的肽(作為例如蛋白水解裂解的結(jié)果)的官能團(tuán)反應(yīng)來(lái)確保。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面的方法的進(jìn)一步的步驟包括，但不限于(2)集中不同的樣品來(lái)獲得多肽樣品混合物，(3)從所述多肽樣品混合物選擇性分離雙標(biāo)記的多肽或肽，和(4)通過(guò)質(zhì)譜法分析分離的標(biāo)記的多肽或肽的相對(duì)出現(xiàn)(relativeoccurrence)。本發(fā)明的方法中使用的這組標(biāo)記試劑一般包括異重和同量異序標(biāo)記物組件的獨(dú)特的組合。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，異重標(biāo)記組件是同位素標(biāo)記組件。根據(jù)一個(gè)特定的實(shí)施方式，在以上描述的方法中使用的標(biāo)記試劑包含親和標(biāo)簽。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明的方法進(jìn)一步在步驟(a)之后包括裂解步驟，從而所述樣品中的蛋白質(zhì)或多肽被裂解成肽。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，這種裂解用胰蛋白酶進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面的一個(gè)特定的實(shí)施方式，步驟c)包括根據(jù)標(biāo)記的多肽或肽上存在的親和標(biāo)簽選擇性地分離所述多肽或肽。在這種方法的一個(gè)特定的實(shí)施方式中，所述樣品中多肽或肽上存在的、與標(biāo)記試劑的蛋白質(zhì)反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán)是硫醇(thiol)。根據(jù)這種方法的另一個(gè)實(shí)施方式，所述樣品中多肽或肽上存在的、與標(biāo)記試劑的蛋白質(zhì)反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán)作為另一種官能團(tuán)的修飾結(jié)果存在。因此本發(fā)明的方法任選地包括另外的修飾步驟，其中樣品中的多肽或肽被修飾，以獲得適合于與在此描述的一組標(biāo)記試劑的蛋白質(zhì)反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán)。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面的方法的一個(gè)實(shí)施方式，步驟(c)另外地或可選擇地包含通過(guò)電泳或?qū)游鰪倪@些集中的多肽中分離標(biāo)記的多肽或肽級(jí)分的步驟。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面的方法的一個(gè)實(shí)施方式，步驟(d)包含用MS測(cè)定步驟(c)中獲得的分離的標(biāo)記的多肽或肽級(jí)分中不同質(zhì)量的相對(duì)數(shù)量的步驟。任選地，在本發(fā)明的這個(gè)方面的方法中，步驟(d)進(jìn)一步包括使這種分離的標(biāo)記的多肽級(jí)分經(jīng)歷碰撞誘導(dǎo)的解離(CID)并測(cè)定其中不同的同量異序標(biāo)記的多肽的相對(duì)數(shù)量的步驟。在特定的實(shí)施方式中，不同的同量異序標(biāo)記的多肽的相對(duì)數(shù)量通過(guò)測(cè)定CID之后從同量異序標(biāo)記物釋放的報(bào)告基團(tuán)的相對(duì)數(shù)量來(lái)測(cè)定。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明的這個(gè)方面的方法進(jìn)一步包括測(cè)定這種多肽的序列的步驟。本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面涉及用本發(fā)明的第一方面描述的具有同量異序和異重標(biāo)記物組件的標(biāo)記試劑來(lái)標(biāo)記多肽樣品的方法，包括使這種標(biāo)記試劑與樣品中多肽上的官能團(tuán)反應(yīng)的步驟。本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面涉及如上所述的方法的用途，用于鑒定在不同的生物或?qū)嶒?yàn)蛋白質(zhì)樣品中差異化表達(dá)的蛋白質(zhì)，例如，對(duì)照個(gè)體和不同疾病狀況、不同疾病階段、患有或懷疑患有相同疾病的不同受試者的一種或多種蛋白質(zhì)樣品等等。本發(fā)明的再進(jìn)一步的一個(gè)方面提供了來(lái)自不同的樣品的多肽或肽的混合物，其中來(lái)自特定樣品的每種多肽或肽包含標(biāo)記物，所述標(biāo)記物包含同位素標(biāo)記物組件和同量異序標(biāo)記物組件，所述標(biāo)記物已經(jīng)通過(guò)所述多肽或肽中的官能團(tuán)與所述多肽或肽連接。在一個(gè)實(shí)施方式中，其上已經(jīng)連接了標(biāo)記物的本發(fā)明混合物的多肽或肽的官能團(tuán)是選自由N-末端上或賴氨酸上的伯胺、天冬氨酸、谷氨酸或C-末端上的羧基基團(tuán)、以及半胱氨酸上的硫醇基團(tuán)組成的組的官能團(tuán)。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，這種肽的混合物是來(lái)自蛋白質(zhì)樣品的胰蛋白酶消化的生物蛋白質(zhì)的胰蛋白酶肽(trypticpeptides)的混合物。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，在本發(fā)明這個(gè)方面的混合物中的肽或多肽上存在的不同標(biāo)記物的數(shù)量至少是4。本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面提供了包含四種或更多種標(biāo)記試劑的試劑盒，所述標(biāo)記試劑包含同量異序標(biāo)記物組件、異重標(biāo)記物組件和蛋白質(zhì)/肽反應(yīng)基團(tuán)，其中這種試劑盒中的每種標(biāo)記試劑具有相同的或基本上相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及其中每種標(biāo)記試劑包含所述異重和同量異序標(biāo)記物組件的獨(dú)特的組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，這種試劑盒中的所述標(biāo)記試劑包含親和標(biāo)簽。本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面提供了在這些多肽或肽的集中的混合物之內(nèi)，測(cè)定具有相同氨基酸序列的不同樣品的單獨(dú)的多肽或肽的相對(duì)數(shù)量的方法，其中，在集中之前，來(lái)自不同樣品的每種多肽或肽用一組差異化雙標(biāo)記試劑中的一種來(lái)標(biāo)記，其中使用的這一組差異化雙標(biāo)記試劑具有相同的或基本上相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)并帶有同位素和同量異序標(biāo)記物組件，每種標(biāo)記試劑包含不同的同位素和同量異序標(biāo)記物組件的獨(dú)特組合，包括步驟a)任選地，通過(guò)液相色譜分離所有標(biāo)記的多肽或肽，以獲得包含具有相同氨基酸序列的所述單獨(dú)的多肽或肽的分離的級(jí)分b)通過(guò)第一MS將步驟(a)中獲得的多肽或肽的分離的級(jí)分分離成進(jìn)一步的各自具有不同質(zhì)量的多肽或肽的級(jí)分，并測(cè)定具有不同質(zhì)量的每種級(jí)分的相對(duì)數(shù)量，c)使步驟(b)中獲得的肽級(jí)分在一定條件下進(jìn)行第二MS,在所述條件下其中所述同量異序標(biāo)記物組件(和任選地所述多肽或肽)被碎裂(fragmented),并測(cè)定每種碎裂的同量異序標(biāo)記物組件的數(shù)量，d)從步驟(c)中測(cè)定的每種同量異序標(biāo)記物組件的相對(duì)數(shù)量，確定步驟(b)中獲得的多肽或肽級(jí)分內(nèi)單獨(dú)的肽的相對(duì)數(shù)量，和e)從步驟(b)中測(cè)定的具有不同質(zhì)量的每種多肽或肽級(jí)分的相對(duì)數(shù)量以及從步驟(d)中獲得的肽級(jí)分內(nèi)單獨(dú)的肽的相對(duì)數(shù)量，計(jì)算所述集中的混合物中具有相同氨基酸序列的每種標(biāo)記的單獨(dú)的多肽的相對(duì)數(shù)量。本發(fā)明的一個(gè)再進(jìn)一步的方面涉及用于蛋白質(zhì)樣品的多通道標(biāo)記和分析的設(shè)備(IOO),包括至少兩個(gè)樣品源(IOI)、標(biāo)記單元(103)和各自包含標(biāo)記試劑的相應(yīng)的標(biāo)記物源(104),所述標(biāo)記試劑包含異重標(biāo)記物組件、蛋白/肽反應(yīng)基團(tuán)和包含報(bào)告基團(tuán)(RG)和平衡基團(tuán)(BG)的同量異序標(biāo)記物組件，并進(jìn)一步包括分離單元(107)、質(zhì)譜儀單元(108)和數(shù)據(jù)分析單元(109)。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，這種設(shè)備進(jìn)一步包括選自由樣品制備單元(102)、蛋白質(zhì)裂解單元(105)和親和純化單元(106)構(gòu)成的組的一種或多種元件。從以下詳細(xì)說(shuō)明，結(jié)合附圖，本發(fā)明的上述和其他特征、特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將變得明顯；附圖通過(guò)舉例的方式說(shuō)明了本發(fā)明的原理。給出這種描述僅是為了舉例說(shuō)明，而不是限制本發(fā)明的范圍。以下引用的參考圖是指附圖。附圖1顯示了利用可裂解的ICAT試劑用于蛋白分布(proteinprofiles)的定量分析的蛋白質(zhì)組學(xué)流程圖(取自Li"a/.(2003)Mo/.Ce/.Proteom.2,1198-1204)。附圖2顯示了現(xiàn)有技術(shù)的可裂解ICAT試劑的示意性結(jié)構(gòu)。附圖3顯示了iTRAQ標(biāo)記物(A)和用它標(biāo)記的肽(B)的示范性的結(jié)構(gòu)。標(biāo)記物由質(zhì)量范圍為從114到117Da的報(bào)告基團(tuán)和質(zhì)量范圍為從31到28Da的平衡基團(tuán)組成。附圖4根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方式顯示了標(biāo)記物，從而同位素標(biāo)記物組件^皮導(dǎo)入同量異序標(biāo)記物組件之內(nèi)，即，通過(guò)用石危(附圖4B)替換平衡基團(tuán)中的氧原子(附圖4A)。在附圖4C中，同位素標(biāo)記物組件被導(dǎo)入在同量異序標(biāo)記物組件的報(bào)告基團(tuán)的哌嗪基團(tuán)的丙基側(cè)鏈上。的非限制性實(shí)例組。附圖6展現(xiàn)了根據(jù)本發(fā)明的特定的實(shí)施方式，利用包含同位素和同量異序標(biāo)記物組件的標(biāo)記試劑的多個(gè)樣品的同時(shí)分析。附圖7顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方式，用于8種蛋白質(zhì)樣品的多通道分析的設(shè)備(IOO),包括至少兩個(gè)樣品源(IOI)、樣品制備單元(102)、具有標(biāo)記試劑源(104)的標(biāo)記單元(103)、蛋白質(zhì)裂解單元(105)、親和純化單元(106)(例如，抗生物素蛋白親和層析系統(tǒng))、包含兩個(gè)連續(xù)連接的分離系統(tǒng)(1107)和(2107)的分離單元(107)、質(zhì)譜儀單元(108),以及與讀出系統(tǒng)(110)連接的控制和分析電路及數(shù)據(jù)分析單元(109)。在不同的附圖中，相同的附圖標(biāo)記是指相同的或類似的元件。具體實(shí)施例方式將針對(duì)特定的實(shí)施方式和參考某些附圖描述本發(fā)明，但是本發(fā)明并不受此限制而僅由權(quán)利要求限制。權(quán)利要求中的任何附圖標(biāo)記應(yīng)不被看做限制范圍。描述的附圖僅是示意性的而非限制性的。在附圖中，為了說(shuō)明性的目的，某些元件的大小可以被夸大并且沒(méi)有按比例描繪。當(dāng)術(shù)語(yǔ)"包括，，在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中使用時(shí)，它不排除其他要素或步驟。在使用不定冠詞或冠詞時(shí)當(dāng)涉及單數(shù)名詞例如"a"、或"an"、"the"時(shí)，這包括該名詞的復(fù)數(shù)，除非另有其它特別聲明。此外，在說(shuō)明書(shū)中和在權(quán)利要求中,術(shù)語(yǔ)第一、第二、第三等等，是用于區(qū)分相似的要素，而不必然描述次序或時(shí)間順序。要理解的是，這樣使用的術(shù)語(yǔ)在合適的狀況下是可互換的，在此描述的本發(fā)明的實(shí)施方式能夠以不同于在此描述或說(shuō)明的順序的其他順序來(lái)操作。提供以下術(shù)語(yǔ)或定義僅僅用來(lái)幫助理解本發(fā)明。這些定義不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為具有小于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的范圍的范圍。如在此使用的那樣，術(shù)語(yǔ)"多肽"或"蛋白質(zhì)"是指經(jīng)由肽鍵連接的多個(gè)天然的或修飾的氨基酸。多肽的長(zhǎng)度可以從2個(gè)到數(shù)千個(gè)氨基酸變化(因而該術(shù)語(yǔ)還包括通常稱作寡肽的物質(zhì))。包括在這個(gè)范圍內(nèi)的是多肽，其包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸，所述氨基酸通過(guò)體內(nèi)轉(zhuǎn)譯后<奮飾(posttranslationalmodifications)例如糖基化、石癢酸化(phosphorylation)等等被修飾，和/或包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸，所述氨基酸已經(jīng)被蛋白質(zhì)修飾劑(例如，烷基化劑或乙酰化劑)體外修飾。在此使用的術(shù)語(yǔ)"多肽片段，，或"肽"被用于指在蛋白質(zhì)或多肽的裂解之后獲得的氨基酸序列。多肽片段或肽不受大小或性質(zhì)的限制。術(shù)語(yǔ)"內(nèi)部(internal)"、"氨基末端"和"羧基末端"當(dāng)涉及肽時(shí)，在此使用是指肽在蛋白質(zhì)或多肽中的相應(yīng)位置。例如，在蛋白NH2-Xi-K-X2-R-X3-K-X4-COOH(其中X!、X2、乂3和乂4是沒(méi)有賴氨酸(K)或精氨酸(R)的長(zhǎng)度不重要的肽序列(peptidesequencesofindifferentlength))的胰蛋白酶裂解中，氨基末端肽是NH2-X廣K-COOH,內(nèi)部肽是NH2-X2-R-COOH和NH2-X3-K-COOH，和羧基末端肽是NH2-X4-COOH。在此使用的術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)裂解"涉及多肽中兩個(gè)氨基酸之間的肽鍵的水解。這包括化學(xué)水解或酶水解。此使用的術(shù)語(yǔ)"碎裂(fmgmentation)"是指破壞一個(gè)或多個(gè)化學(xué)鍵和隨后釋放分子的一個(gè)或多個(gè)部分，如通過(guò)例如在串聯(lián)質(zhì)譜法(MS)或MS/MS分析中的碰撞誘導(dǎo)的解離(CID)實(shí)現(xiàn)。在某些實(shí)施方式中，所述鍵是肽鍵，但不限于此。在此使用的術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記物"是指化合物，其共價(jià)連接到肽或多肽并且基于它的特定性質(zhì)，它是在質(zhì)譜儀上可檢測(cè)到的。在標(biāo)記物可共價(jià)連接到肽或多肽的情況下，這通過(guò)蛋白質(zhì)/肽反應(yīng)基團(tuán)(PRG)來(lái)保證。根據(jù)本發(fā)明，一種標(biāo)記物可以包含超過(guò)一種"標(biāo)記物組件(labelcomponent)",即，超過(guò)一個(gè)基于其特定的性質(zhì)可差異化地檢測(cè)到的組件。一般地，術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記物"將用于指多肽或肽上存在的分子，術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記試劑"用于指與蛋白質(zhì)或肽反應(yīng)之前的、未結(jié)合的標(biāo)記物(或用于保證蛋白質(zhì)或肽上標(biāo)記物存在的化合物的組合)，即，仍然包含游離的蛋白質(zhì)/肽反應(yīng)基團(tuán)。在此使用的術(shù)語(yǔ)"雙標(biāo)記物"和"雙標(biāo)記試劑"是指包含異重(例如，同位素)和同量異序標(biāo)記物組件兩者的標(biāo)記物或試劑。因此，術(shù)語(yǔ)"雙標(biāo)記的"當(dāng)涉及肽或蛋白質(zhì)時(shí)是指在所述肽或蛋白上包含兩種標(biāo)記物組件的標(biāo)記物的存在。在此使用的術(shù)語(yǔ)"同位素標(biāo)記物"是指包含原子的一種或多種同位素的標(biāo)記物。在此使用的術(shù)語(yǔ)"異重標(biāo)記物組件"是指一組分子，其具有基本上相同的結(jié)構(gòu)并且在電泳和層析中表現(xiàn)出同樣的行為，但是在一個(gè)或多個(gè)原子上不同以在質(zhì)量上產(chǎn)生差異，其可以用作標(biāo)記物(的一部分)。因而，包含一組異重標(biāo)記物組件的一組標(biāo)記試劑或標(biāo)記物將在質(zhì)量上具有不同。當(dāng)一個(gè)或多個(gè)原子的不同相應(yīng)于標(biāo)記物組件包含相同原子的不同的同位素的事實(shí)時(shí)，指的是"同位素標(biāo)記物組件"。在此使用的術(shù)語(yǔ)"同位素標(biāo)記物組件"是指一組分子，其具有基本上相同的結(jié)構(gòu)并且在電泳和層析中具有同樣的行為，但是在一個(gè)或多個(gè)同位素上不同以在質(zhì)量上產(chǎn)生差異，其可以用作標(biāo)記物(的部分)。各自用包含標(biāo)記物組件的標(biāo)記物標(biāo)記的相同的肽可以在MS中相互區(qū)分，其中所述標(biāo)記物組件具有相同的或基本上相同的化學(xué)式，但是基于相同原子的不同同位素(在數(shù)量上或類型上)的存在而在質(zhì)量上不同。在此使用的術(shù)語(yǔ)"同量異序標(biāo)記物組件"是指一組分子，其具有相同的結(jié)構(gòu)和相同的質(zhì)量，其在碎裂時(shí)釋放具有相同結(jié)構(gòu)的特定碎片，由于所述同量異序標(biāo)記物組件內(nèi)同位素的差異化分布，所述特定碎片在所述組的不同同量異序標(biāo)記物組件之間在質(zhì)量上不同。同量異序標(biāo)記物組件一般地包含報(bào)告基團(tuán)(RG)和平衡基團(tuán)(BG),其在碎裂時(shí)分離并且其顯示同位素的差異化分布。一組同量異序標(biāo)記物組件的"組合的質(zhì)量"是指該組同量異序標(biāo)記物組件的報(bào)告基團(tuán)和平衡基團(tuán)的總質(zhì)量。術(shù)語(yǔ)"報(bào)告基團(tuán)(RG)"是指同量異序標(biāo)記物組件的在CID時(shí)產(chǎn)生碎片離子的部分，作為一個(gè)或多個(gè)同位素的差異化出現(xiàn)的結(jié)果，其在一組同量異序標(biāo)記物組件內(nèi)在質(zhì)量上分別不同。例如，一組同量異序標(biāo)記物組件內(nèi)不同的報(bào)告基團(tuán)的特征在于在所述報(bào)告基團(tuán)中12c/13c和/或160/180的差異化出現(xiàn)。在釋放報(bào)告基團(tuán)時(shí)產(chǎn)生的典型碎片被用于定量用包含同量異序標(biāo)記物組件的標(biāo)記物標(biāo)記的多肽或肽。一般地，報(bào)告基團(tuán)的碎片離子在MS語(yǔ)的低質(zhì)量區(qū)域出現(xiàn)，在這里一般發(fā)現(xiàn)不了其他碎片離子。在此使用的術(shù)語(yǔ)"平衡基團(tuán)(BG)"是指同量異序標(biāo)記物組件的一.部分，其含有特定補(bǔ)償數(shù)量的同位素，以確保所述報(bào)告基團(tuán)和平衡基團(tuán)的組合質(zhì)量對(duì)于不同同量異序標(biāo)記物組件是恒定的。在CID時(shí)平衡基團(tuán)可以從標(biāo)記物上釋放或可以不從標(biāo)記物上釋方文。在此使用的術(shù)語(yǔ)"官能團(tuán)，，是指氨基酸上的化學(xué)官能，其可以用于與化學(xué)化合物結(jié)合(一般地，共價(jià)結(jié)合)。官能團(tuán)可以存在于氨基酸的側(cè)鏈上，或多肽或肽的氨基末端或羧基末端上。該術(shù)語(yǔ)涵蓋天然存在于肽或多肽上的官能團(tuán)和通過(guò)例如使用蛋白修飾試劑的化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)入的那些。在此使用的術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)/肽反應(yīng)基團(tuán)(PRG)"是指化合物(例如，標(biāo)記試劑)上的化學(xué)官能，其能夠與蛋白質(zhì)或肽的氨基酸上的官能團(tuán)反應(yīng)，引起這種化合物與氨基酸的結(jié)合(非共價(jià)的或共價(jià)的)。本發(fā)明涉及標(biāo)記試劑，包含同位素和同量異序標(biāo)記物組件，用于不同蛋白質(zhì)樣品的比較，從而容許產(chǎn)生更大數(shù)量的差異化的標(biāo)記物，用于一個(gè)集中的多肽或肽混合物中不同來(lái)源的相似的肽的區(qū)分。使用本發(fā)明的差異化標(biāo)記試劑，此外可以鑒定集中的樣品中蛋白質(zhì)或肽的存在和相對(duì)數(shù)量。因此，本發(fā)明的方法和工具在其中對(duì)比分析令人感興趣的一組樣品的分析中是特別令人感興趣的。這樣的一組樣品可以是，但不限于，在不同時(shí)間點(diǎn)采集的來(lái)自患者的樣品、來(lái)自疾病的不同臨床變型的樣品、來(lái)自不同患者的樣品等等。本發(fā)明因而提供了用于鑒定疾病發(fā)展的標(biāo)志物、用于鑒別診斷、和此外用于生物化學(xué)或生理分析中的多通道分析的方法和工具。本發(fā)明的方法和工具涉及蛋白質(zhì)樣品的分析。在此使用的術(shù)語(yǔ)"樣品，，不是意圖必然地包括或排除在實(shí)施本發(fā)明的方法之前的任何加工步驟。樣品可以是粗的未加工的樣品、提取的蛋白質(zhì)級(jí)分、純化的蛋白質(zhì)級(jí)分等等。如以上所指出的，蛋白質(zhì)存在于所述樣品中。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，所述蛋白質(zhì)樣品通過(guò)豐量蛋白質(zhì)的免疫耗竭(immunodepletionofabundantproteins)來(lái)預(yù)先力口工。適合于用本發(fā)明的標(biāo)記試劑和方法分析的蛋白質(zhì)樣品包括病毒、原核生物、細(xì)菌、真核生物、真菌、酵母、植物、無(wú)脊推動(dòng)物、脊推動(dòng)物、哺乳動(dòng)物和人類來(lái)源的樣品。樣品的制備取決于所研究的生物體、組織或器官而不同，但是標(biāo)準(zhǔn)方法通常是可獲得的并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。對(duì)于哺乳動(dòng)物和人蛋白質(zhì)樣品，它涵蓋培養(yǎng)的細(xì)胞、激光微解剖的細(xì)胞、身體組織、體液或其他感興趣的相關(guān)樣品的分離。對(duì)于樣品中蛋白質(zhì)的分級(jí)，細(xì)胞裂解(lysis)是細(xì)胞分級(jí)和蛋白質(zhì)純化中的第一步驟。許多技術(shù)可用于破壞細(xì)胞，包括基于物理、酶和洗滌劑的方法。歷史上，物理裂解是所選擇的用于細(xì)胞破壞的方法；(勻質(zhì)化、滲透裂解、超聲細(xì)胞破壞)；然而，它通常需要昂貴的、笨重的設(shè)備，并且由于儀器中的變化性(例如，松散裝配的與緊密裝配的勻質(zhì)化缽錘的比較)而涉及有時(shí)難以重復(fù)的方案。近年來(lái)，洗滌劑基裂解由于容易使用、低成本和高效的方案變得非常受歡迎的。哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有質(zhì)膜，一種形成分隔細(xì)胞內(nèi)含物和細(xì)胞外環(huán)境的屏障的蛋白-脂質(zhì)雙分子層(protein-lipidbilayer)。構(gòu)成質(zhì)膜的脂質(zhì)是兩親性的，具有親水性和疏水性部分，其自發(fā)地締合來(lái)形成閉合的雙分子片層。膜蛋白包埋在所述脂質(zhì)雙分子層中，通過(guò)跨越疏水核心的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域(domains)保持就位。此外，外周蛋白(peripheralprotein)通過(guò)與整合月莫蛋白(integralmembraneprotein)或與才及性月旨質(zhì)質(zhì)內(nèi)容物的性質(zhì)根據(jù)細(xì)胞類型而變化。明顯地，選擇用于破壞細(xì)胞的技術(shù)，無(wú)論是基于物理的還是基于洗滌劑的，都必需考慮被檢查的細(xì)胞或組織的來(lái)源，以及在破壞它們的外層方面的固有的容易度或難度。此外，所述方法必需與要加工的材料的數(shù)量和預(yù)期的下游應(yīng)用相適合。在特定的實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)提取還包括來(lái)源于不同區(qū)室的細(xì)胞蛋白質(zhì)(例如，細(xì)胞外蛋白、膜蛋白、細(xì)胞胞漿蛋白(cytosolicproteins)、核蛋白(nuclearproteins)、線粒體蛋白(mitochondrialproteins))的預(yù)分級(jí)。其他預(yù)分級(jí)方法根據(jù)物理性質(zhì)例如等電點(diǎn)、電荷和分子量來(lái)分離蛋白質(zhì)。根據(jù)一個(gè)特定的實(shí)施方式，利用合適的試劑(例如，鹽酸胍鹽(guanidiniumchloride)、尿素、酸(例如，0.1%trifluoricacid)、堿(例如，50%吡咬)和離子或非離子洗涂劑)在標(biāo)記或裂解之前預(yù)處理所述樣品，以便使蛋白質(zhì)變性以實(shí)現(xiàn)優(yōu)化試劑或蛋白酶接近。此外，如下文將詳述的，取決于標(biāo)記試劑中蛋白質(zhì)反應(yīng)基團(tuán)的類型，本發(fā)明的方法設(shè)想在本發(fā)明的標(biāo)記方法之前，所述官能團(tuán)被不可逆或可逆地用蛋白質(zhì)修飾試劑來(lái)修飾。實(shí)例是封閉的氨基末端的釋放、胱氨酸向半胱氨酸的還原、封閉半胱氨酸的官能硫醇基團(tuán)、將賴氨酸的胺基團(tuán)乙酰化，等等。因而本發(fā)明的方法任選地包括樣品的預(yù)處理，其可以在包含上文列出的一種或多種樣品制備方法的預(yù)處理步驟中進(jìn)行。因此，適合于本發(fā)明的方法的設(shè)備任選地包含樣品制備單元，其包含適合于樣品制備的一個(gè)或多個(gè)設(shè)備，例如超聲處理設(shè)備，層析系統(tǒng)(親和、凝膠過(guò)濾)，超濾單元，離心機(jī)，具有緩沖液、酶、洗滌劑等的輸送系統(tǒng)的控制溫度的反應(yīng)小瓶。根據(jù)本發(fā)明，提供了工具和方法，其容許僅用一個(gè)標(biāo)記步驟而實(shí)現(xiàn)多標(biāo)記。根據(jù)本發(fā)明，這通過(guò)將適合于MS中差異檢測(cè)的兩種類型的標(biāo)記物組件組合到一種標(biāo)記試劑中，從而實(shí)現(xiàn)基于標(biāo)記物組件的組合的一組差異化標(biāo)記試劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明的標(biāo)記試劑包含一個(gè)來(lái)自一組同量異序(相同質(zhì)量)標(biāo)記物組件的標(biāo)記物組件，和一個(gè)來(lái)自一組異重(不同質(zhì)量)標(biāo)記物組件的標(biāo)記物組件。根據(jù)本發(fā)明，所述標(biāo)記試劑的異重標(biāo)記物組件是質(zhì)量上相互不同的組件，作為其結(jié)果，包含它們的標(biāo)記試劑將在質(zhì)量上具有不同。因此，這些組件為它們所結(jié)合的肽/蛋白質(zhì)帶來(lái)不同的質(zhì)量。盡管如此，本發(fā)明的異重標(biāo)記物組件對(duì)它們所結(jié)合的肽或蛋白質(zhì)的層析或電泳行為具有基本上相同的影響。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，所述異重標(biāo)記物組件是這樣的組件，其具有基本上相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但是其中一個(gè)原子被另一個(gè)原子以所述標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)被最低限度地改變的方式取代。因此，用包含這種異重標(biāo)記物組件的一組標(biāo)記試劑標(biāo)記相同的肽將產(chǎn)生在質(zhì)量上具有輕微的(預(yù)定)差異(其因而可以在MS中被鑒定)，但是其在MS分析之前的例如層析或電泳行為方面沒(méi)有不同的肽。根據(jù)一個(gè)可選擇的實(shí)施方式，本發(fā)明的標(biāo)記試劑的異重標(biāo)記物組件是同位素標(biāo)記物組件，即，通過(guò)差異化的同位素組成確保一組的不同試劑之間質(zhì)量上的差異。因此，在這個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的標(biāo)記試劑包括同位素標(biāo)記物組件、同量異序標(biāo)記物組件和蛋白質(zhì)反應(yīng)基團(tuán)。任選地，所述標(biāo)記試劑進(jìn)一步包含親和標(biāo)簽。一般地，所述同位素標(biāo)記物組件和所述同量異序標(biāo)記物組件構(gòu)成標(biāo)記試劑的兩個(gè)獨(dú)立的部分。然而，如以下描述的那樣，同位素標(biāo)記物組件也可以^^皮包括在同量異序標(biāo)記物組件之內(nèi)。在本發(fā)明的標(biāo)記試劑中不同的同位素和同量異序標(biāo)記物組件的組合容許在一個(gè)組中有更多數(shù)量的差異化標(biāo)記試劑，即，用于樣品的差異化標(biāo)記，從而在樣品集中之后，可以鑒定樣品的來(lái)源。例如，當(dāng)不同的同位素標(biāo)記物組件的數(shù)目是2、同量異序標(biāo)記物試劑的數(shù)目是4時(shí)，總共可以產(chǎn)生2x4=8種標(biāo)記物組件組合，因而可以產(chǎn)生8種差異化標(biāo)記試劑。在這個(gè)實(shí)例中，標(biāo)記試劑組將包含4種標(biāo)記試劑的2個(gè)小組，其中這2個(gè)小組在質(zhì)量上相互不同(由于差異化同位素標(biāo)記)，而在每個(gè)小組內(nèi)，4種標(biāo)記試劑將是同量異序的，即，具有相同的質(zhì)量，但是在MS/MS中產(chǎn)生具有不同質(zhì)量的報(bào)告基團(tuán)。因此，用這組標(biāo)記試劑標(biāo)記的不同來(lái)源的相同的肽可以被鑒定為，首先在MS中，相應(yīng)于同位素標(biāo)記的肽的兩個(gè)小組的兩個(gè)峰，其當(dāng)在MS/MS中進(jìn)一步分析，將各自進(jìn)一步產(chǎn)生4個(gè)峰，相應(yīng)于同量異序標(biāo)記物組件的不同的報(bào)告基團(tuán)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，在本發(fā)明的組合的同位素/同量異序標(biāo)記試劑中使用的同位素標(biāo)記物組件包括這樣的結(jié)構(gòu)，其中在所述同位素標(biāo)記物組件中的一個(gè)或多個(gè)原子被穩(wěn)定的同位素替代，以產(chǎn)生具有相同化學(xué)式的，但是其根據(jù)它們?cè)谫|(zhì)量上的差異是同位素可區(qū)別的一種或多種化合物。例如，同位素標(biāo)記物組件中的氪、氮、氧或>5危原子的任何一個(gè)或多個(gè)都可以用它們的同位素穩(wěn)定的同位素2H、13C、15N、170、"0或"S分別替換。例如，氫用氘替代，或碳"C用"C替代。利用多于一個(gè)的上述同位素，可以產(chǎn)生2、3、4、5、6、7、8或更高數(shù)量的同位素標(biāo)記物組件，各自具有相同的結(jié)構(gòu)但是具有不同的分子量。如以上所指出的，這些標(biāo)記物組件之間的分子量的差異，在每種標(biāo)記試劑在不同樣品中的相同多肽上結(jié)合時(shí)，反映在由此產(chǎn)生的多肽或肽的所得到的分子量上。可以通過(guò)一個(gè)或多個(gè)同位素的差異化導(dǎo)入而可以作為同位素標(biāo)記物組件的基團(tuán)的實(shí)例包括但不限于醚、聚醚、醚二胺、聚醚二胺、二胺、酰胺、聚酰胺、聚硫醚、二硫化物、甲硅烷基醚、烷基或烯基鏈(直鏈、支鏈或具有環(huán)狀的部分)、芳基、二芳基或烷基-芳基基團(tuán)。在特定的實(shí)施方式中，在本發(fā)明的標(biāo)記試劑的同位素組件中存在的芳基基團(tuán)含有一個(gè)或多個(gè)雜原子(例如，N、O或S原子)。根據(jù)一個(gè)特定的實(shí)施方式，所述標(biāo)記試劑的同位素標(biāo)記物組件是這樣的-它在(MS)11分析期間不經(jīng)歷類似肽的碎裂。為了促進(jìn)電離(ionization),同位素標(biāo)記物組件，更特別地是其中的同位素基團(tuán)，可以含有這樣的基團(tuán)或部分，例如酸性或堿性基團(tuán)，例如，COOH、S03H、伯、仲或叔氨基、氮-雜環(huán)、醚，或這些基團(tuán)的組合。在特定的實(shí)施方式中，所述同位素標(biāo)記物組件含有具有永久電荷的基團(tuán)，例如，磷镥基團(tuán)、季銨基團(tuán)、锍基團(tuán)、螯合的金屬離子、四烷基或四芳基硼酸鹽(tetralkylortetrarylborate)或穩(wěn)定的負(fù)碳離子(carbanions)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明的標(biāo)記試劑的同位素標(biāo)記物組件的結(jié)構(gòu)相應(yīng)于通式-BLxL(CH2)n-[X2-(CH2V]x-X3-(CH2)p-X4-B2-其中國(guó)X1、X2、X3和X4相互獨(dú)立地選自O(shè)、S、NH、NR、NRR'+、CO、COO、COS、S國(guó)S、SO、S02、CO國(guó)NR'、CS畫NR'、Si畫O、芳基或二芳基基團(tuán)。(R是烷基、烯基、炔基、烷氧基或芳基基團(tuán)，R'是氫、烷基、烯基、炔基、烷氧基或芳基基團(tuán))。在特定的實(shí)施方式中，X^X4不存在，但一般存在X^X"的至少一個(gè)。-n、m、p和q是值為從0到約100的整數(shù)。在特定的實(shí)施方式中，n、m、p或q之一不是0,x也是從0到約100的整數(shù)，其中n+xm+p+q的和低于約100,在更特定的實(shí)施方式中，低于約20;以及-8〗和B卩相互獨(dú)立地是任選的部分，其有助于標(biāo)記試劑中的其他部分(例如，親和標(biāo)簽，或如下所述的蛋白/肽反應(yīng)基團(tuán))與同位素標(biāo)記物組件的結(jié)合，或防止那些連接體(linkers)從同位素標(biāo)記物組件的非期望的裂解，并且，選自例如COO、CO、CO-NR'、CS-NR',以及任選地單獨(dú)地或與其他基團(tuán)組合含有一個(gè)或多個(gè)CH2基團(tuán)，例如(CH2)q-CONR'、(CH2)q國(guó)CS陽(yáng)NR'或(CH2)q,在特定的實(shí)施方式中，具有如上所述的結(jié)構(gòu)的同位素標(biāo)記物組件的CH2基團(tuán)的一個(gè)或多個(gè)，任選地被小(d-C6)烷基、烯基或烷氧基、20芳基基團(tuán)取代，或被促進(jìn)電離的官能團(tuán)取代，例如，酸性或堿性基團(tuán)，或帶有永久正或負(fù)電荷的基團(tuán)。在特定的實(shí)施方式中，在連接體中連接CH2基團(tuán)的一個(gè)或多個(gè)單鍵被雙鍵或三鍵替換。在特定的實(shí)施方式中，R和R'烷基、烯基、炔基或烷氧基是小的，具有1到約6個(gè)碳原子。根據(jù)一個(gè)特定的實(shí)施方式，本發(fā)明的同位素標(biāo)記物組件由一個(gè)或兩個(gè)原子組成，其被摻入標(biāo)記試劑的另一部分的側(cè)鏈中或是所述側(cè)鏈，最特別地是所述同量異序標(biāo)記物組件。以下將更詳細(xì)地描述這個(gè)實(shí)施方式。本發(fā)明的標(biāo)記試劑，除了以上描述的異重或同位素標(biāo)記物組件之外，進(jìn)一步包含同量異序標(biāo)記物組件。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，所述同量異序標(biāo)記物組件包括報(bào)告基團(tuán)(RP)和平衡基團(tuán)(BG)，其中報(bào)告基團(tuán)的質(zhì)量對(duì)于每個(gè)同量異序標(biāo)記物組件(在一組標(biāo)記試劑之內(nèi))是特定的，并且不同的同量異序標(biāo)記物組件的報(bào)告基團(tuán)和平衡基團(tuán)的總質(zhì)量保持恒定。根據(jù)一個(gè)特定的實(shí)施方式，所述同量異序標(biāo)記物組件的一般結(jié)構(gòu)可由通式RP-X'-BG-Y'-代表，其中報(bào)告基團(tuán)(RP)是同量異序標(biāo)記物組件的末端部分，一般也是標(biāo)記試劑的末端部分(見(jiàn)下文)。X'和Y'都代表鍵或連接。根據(jù)一個(gè)可選擇的實(shí)施方式，所述報(bào)告基團(tuán)是在同量異序標(biāo)記物組件的內(nèi)部，所述標(biāo)記試劑內(nèi)的同量異序標(biāo)記物組件的一般結(jié)構(gòu)可由通式-X'-RP-X'-BG-Y'-表示。同量異序標(biāo)記的概念在附圖3中舉例說(shuō)明。附圖3A提供了同量異序標(biāo)記物組件的實(shí)例。在這個(gè)實(shí)施方式中，同量異序標(biāo)記物組件由基于N-甲基哌溱的報(bào)告基團(tuán)和其是羰基的質(zhì)量平衡基團(tuán)組成。在附圖3B中，同量異序標(biāo)記物組件通過(guò)是NHS酯的肽-反應(yīng)基團(tuán)直接結(jié)合到肽。雖然報(bào)告基團(tuán)的質(zhì)量對(duì)于組內(nèi)的每個(gè)同量異序標(biāo)記物組件是特定的，但是不同的同量異序標(biāo)記物組件的報(bào)告基團(tuán)和平衡基團(tuán)的總質(zhì)量保持恒定。根據(jù)一個(gè)特定的實(shí)施方式，一組標(biāo)記試劑的不同的同量異序標(biāo)記物組件中報(bào)告基團(tuán)的差異質(zhì)量，如所示出的那樣通過(guò)使用13C、"N和180原子的差異化同位素富集來(lái)實(shí)現(xiàn)，以避免涉及氘替換的富集所觀察到的層析分離問(wèn)題。鑒于不同的同量異序標(biāo)記物組件的相同的結(jié)構(gòu)，21在環(huán)中富集的中心(centers)的數(shù)量和位置對(duì)于層析或MS行為沒(méi)有影響。因而同量異序標(biāo)記物組件可以通過(guò)酰胺鍵直接結(jié)合到肽或同位素基團(tuán)。在附圖3中，同量異序標(biāo)記物組件的側(cè)面連接有蛋白質(zhì)反應(yīng)基團(tuán)，其是胺特異性反應(yīng)基團(tuán)。這種標(biāo)記試劑的胺特異性反應(yīng)基團(tuán)與肽反應(yīng)之后，標(biāo)記物就變得經(jīng)由酰胺鍵與胺官能團(tuán)(N-末端或賴氨酸的胺基團(tuán))連接。這些酰胺鍵當(dāng)經(jīng)歷CID時(shí)以與主鏈肽鍵類似的方式碎裂。來(lái)碎裂肽的其他適合的方法包括CAD(碰撞激活的解離)、ETD(電子傳遞解離)、ECD(電子俘獲解離)、IRMPD(紅外線多光子解離)和BIRD(黑體紅外線輻射離解)。在經(jīng)歷CID時(shí)在酰胺鍵的碎裂之后，平衡(羰基)部分丟失(中性丟失)，而電荷被報(bào)告基團(tuán)碎片保留。在附圖3A中，括號(hào)中的數(shù)字表明分子的每個(gè)部分中富集的中心的數(shù)量。附圖3的部分B說(shuō)明了使用包含四種不同的報(bào)告基團(tuán)質(zhì)量的四種同量異序組合的標(biāo)記。各自用多通道組中的一個(gè)成員標(biāo)記的四種相同肽的混合物在MS中表現(xiàn)為單一的、不可分辨的前體離子(相同的m/z)。在CID之后，四種報(bào)告基團(tuán)離子表現(xiàn)為不同的質(zhì)量(114-117Da)。所有其他的序列情報(bào)性碎片離子(b-,y-,等等)保持同量異序，并且它們的單度的離子電流信號(hào)(信號(hào)強(qiáng)度)是加和的。肽的相對(duì)濃度因而可以從相應(yīng)的報(bào)告離子的相對(duì)強(qiáng)度推出。當(dāng)使用本發(fā)明的標(biāo)記試劑時(shí)，因此在MS/MS階段進(jìn)行定量，而不是在MS中。如以上所指出的，同量異序標(biāo)記物組件的報(bào)告基團(tuán)RP是具有可以被測(cè)定的獨(dú)特質(zhì)量(或質(zhì)量與電荷比)的基團(tuán)。因此，一組同量異序標(biāo)記物組件(或相應(yīng)的標(biāo)記試劑)的每個(gè)報(bào)告基團(tuán)具有獨(dú)特的質(zhì)量。在特定的實(shí)施方式中，一組同量異序標(biāo)記物組件的每個(gè)報(bào)告基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)重原子同位素以實(shí)現(xiàn)獨(dú)特的質(zhì)量。舉例來(lái)說(shuō)，碳(12〇、13C和14C)、氮("N和"N)、氧(160和180)或氫(氬、氛和氚)的同位素可以用于制備不同的報(bào)告基團(tuán)。適用于報(bào)告基團(tuán)中的穩(wěn)定"重"原子同位素的實(shí)例包括"C、15N、180和氖。這些不是限制性的，因?yàn)槠渌p和重原子同位素也適合于摻入報(bào)告基團(tuán)中。適合用于制備包含輕和重原子同位素的報(bào)告基團(tuán)的基礎(chǔ)起始材料可以從各種商業(yè)的來(lái)源，例如CambridgeIsotopeLaboratories和Isotec獲得。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，報(bào)告基團(tuán)質(zhì)量范圍是從w/z114.1到117.1,而平衡基團(tuán)質(zhì)量范圍是從28到31Da,從而對(duì)于四種試劑的每一種組合質(zhì)量保持恒定(145.1Da)。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的標(biāo)記試劑的同量異序標(biāo)記物組件的獨(dú)特報(bào)告基團(tuán)被用于鑒定和定量不同樣品中的肽。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，所述獨(dú)特報(bào)告基團(tuán)作為樣品的一種或多種多肽上的標(biāo)記物的部分保持存在。這樣，關(guān)于報(bào)告基團(tuán)的信息與關(guān)于樣品的標(biāo)記的多肽的信息關(guān)聯(lián)起來(lái)。做為選擇，然而，如在上文描述的實(shí)例中，在其鑒定之前，報(bào)告基團(tuán)被從標(biāo)記的多肽上除去。因而，在測(cè)定報(bào)告物(reporter)的時(shí)候，報(bào)告基團(tuán)不必物理連接到(多)肽。實(shí)際上，根據(jù)這個(gè)實(shí)施方式，報(bào)告物的獨(dú)特質(zhì)量是，例如，在串聯(lián)的質(zhì)量分析器的第二質(zhì)量分析中測(cè)定的，在標(biāo)記的(多)肽的離子被碎裂以產(chǎn)生(多)肽的子碎片離子和可檢測(cè)的報(bào)告基團(tuán)之后。特定的報(bào)告基團(tuán)被用于鑒定特定(多)肽所來(lái)源的樣品。進(jìn)一步的，測(cè)定的獨(dú)特報(bào)告基團(tuán)的量，相對(duì)于其他報(bào)告基團(tuán)的數(shù)量或相對(duì)于校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)(例如，用特定報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記的多肽)，任選地被用于確定一個(gè)或多個(gè)所述樣品中多肽的相對(duì)或絕對(duì)數(shù)量(通常表示為濃度和/或量)。因此，在用于標(biāo)記每個(gè)特定樣品的每種標(biāo)記試劑的同量異序組件中存在的報(bào)告基團(tuán)提供了不同類型的信息，例如，特定樣品中一種或多種多肽的數(shù)量。報(bào)告基團(tuán)包含固定的電荷，或者能夠被電離。因此，包含同量異序標(biāo)記物組件的標(biāo)記試劑被用于標(biāo)記鹽或兩性離子形式的反應(yīng)性多肽。報(bào)告物的電離便于它在質(zhì)譜儀中的測(cè)定。因此，在特定的實(shí)施方式中，所述報(bào)告基團(tuán)被測(cè)定為離子，有時(shí)稱為"標(biāo)志離子(signatureion)"。當(dāng)電離后，報(bào)告物包含一個(gè)或多個(gè)凈正電荷或負(fù)電荷。舉例來(lái)說(shuō)，報(bào)告基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)堿性氮原子(正電荷)或一個(gè)或多個(gè)可離子化的酸性基團(tuán)例如羧酸基團(tuán)、磺酸基團(tuán)或磷酸基團(tuán)(負(fù)電荷)。包括堿性氮的報(bào)告基團(tuán)的非限制性的實(shí)例包括取代的或未取代的嗎啉、旅咬或旅。秦。在特定的實(shí)施方式中，報(bào)告基團(tuán)是5、6或7元雜環(huán)，包含用取代的或未取代的乙酸部分N-烷基化的環(huán)氮原子，多肽通過(guò)N-烷基乙酸部分的羰基碳連接到其上，其中每種不同的同量異序標(biāo)記物包含一個(gè)或多個(gè)重原子同位素。這種雜環(huán)是被取代的或未取代的。雜環(huán)是脂肪族或芳香族的。雜環(huán)部分的可能的取代基包括烷基、烷氧基和芳基基團(tuán)。取代基包括被保護(hù)的或未被保護(hù)的基團(tuán)，例如，胺、羥基或硫醇基團(tuán)，適合于將多肽連接到支持物(support)。在特定的實(shí)施方式中，所述雜環(huán)包含另外的雜原子，例如一個(gè)或多個(gè)氮、氧或硫原子。在特定的實(shí)施方式中，選擇所述報(bào)告基團(tuán)，從而它在用于多肽的分析例如電泳或?qū)游龅牡湫蜅l件下基本上不發(fā)生副碎裂(sub-fmgment)。在其他特定的實(shí)施方式中，選擇報(bào)告基團(tuán)，從而它在解離能量的條件下基本上不發(fā)生副碎裂，其中所述解離能量被施加以在質(zhì)譜儀中引起標(biāo)記的多肽的至少一部分選定的離子的鍵X'和Y'碎裂。任選地，選擇報(bào)告基團(tuán)，使得報(bào)告基團(tuán)的最后的碎片利用MS分析在背景噪聲之上難以或不可能檢測(cè)。在特定的實(shí)施方式中，報(bào)告基團(tuán)的質(zhì)量被有意地選擇，從而與要測(cè)定的多肽的質(zhì)量或多肽的任意預(yù)期碎片的質(zhì)量相比是不同的。例如，選擇報(bào)告物的質(zhì)量，以與任何天然存在的氨基酸或肽、或其預(yù)期的碎片相比是不同的。這便于多肽鑒別，因?yàn)槿Q于多肽，具有同樣的一致質(zhì)量的樣品的任何可能組分的缺乏，為任何分析結(jié)果都增加了置信度。在本發(fā)明的標(biāo)記試劑的特定實(shí)施方式中，所述同量異序標(biāo)記物組件的報(bào)告基團(tuán)是非聚合的小分子。在進(jìn)一步特定的實(shí)施方式中，報(bào)告物的質(zhì)量是低于250道爾頓。這種小分子在第二質(zhì)量分析中容易測(cè)定，沒(méi)有第一質(zhì)量分析中具有相同的一致質(zhì)量的樣品的其他組分。在這方面，第二質(zhì)量分析一般地在串聯(lián)質(zhì)譜儀中、對(duì)在第一質(zhì)量分析中測(cè)定的選定離子實(shí)施。由于特定的質(zhì)量電荷比的離子被從第一質(zhì)量分析中特別地選擇出來(lái)以進(jìn)行可能的碎裂和進(jìn)一步的質(zhì)量分析，所以來(lái)自第一質(zhì)量分析的未選擇的離子不被帶向笫二質(zhì)量分析并因而不會(huì)污染第二質(zhì)量分析的譜系。此外，質(zhì)譜儀的敏感性和檢測(cè)器的線性度(對(duì)于定量來(lái)說(shuō))在這種低質(zhì)量范圍上是非常穩(wěn)固的(robust)。另外，質(zhì)譜儀技術(shù)的當(dāng)前狀態(tài)在這個(gè)質(zhì)量范圍內(nèi)容許低于一個(gè)道爾頓的基線質(zhì)量分辨率。在本發(fā)明的標(biāo)記試劑的同量異序標(biāo)記物組件中，平衡基團(tuán)(BG)將報(bào)告基團(tuán)連接到同位素標(biāo)記物組件上或蛋白質(zhì)反應(yīng)基團(tuán)上。在特定的實(shí)施方式中，選擇平衡基團(tuán)以當(dāng)鍵X'和Y'被碎裂時(shí)產(chǎn)生中性物種(即，當(dāng)鍵X'和Y'碎裂時(shí)經(jīng)歷中性損失)。在特定的實(shí)施方式中，所述平衡基團(tuán)是非常小的部分，例如羰基或硫代羰基基團(tuán)。例如，平衡基團(tuán)包含至少一個(gè)重原子同位素并包含式_CH2-CO-CH2-、CH2-CS-CH2-、ch2-CNH-ch2-或CH2-CHRLcH2-,其中W是相同的或不同的，并且是任選地含有雜原子的包含一到八個(gè)碳原子的烷基或取代的或未取代的芳基基團(tuán)，其中所述烷基和芳基基團(tuán)的碳原子獨(dú)立地包含連接的氫、氘和/或氟原子。在特定的實(shí)施方式中，所述平衡基團(tuán)是更大的部分。舉例來(lái)說(shuō)，所述平衡基團(tuán)是聚合物或生物聚合物。在特定的實(shí)施方式中，所述平衡基團(tuán)被設(shè)計(jì)成當(dāng)經(jīng)歷解離能量水平時(shí)發(fā)生副碎裂，包括副碎裂來(lái)借此只產(chǎn)生平衡基團(tuán)的中性碎片。一般地，在本發(fā)明的標(biāo)記試劑中同量異序標(biāo)記物組件的平衡基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)重原子同位素，從而它的質(zhì)量補(bǔ)償報(bào)告基團(tuán)之間的質(zhì)量差異，以獲得該組中每個(gè)同量異序標(biāo)記物組件具有相同的質(zhì)量。報(bào)告基團(tuán)/平衡基團(tuán)組合的集合質(zhì)量(即，作為一個(gè)整體的質(zhì)量)對(duì)于每種同量異序標(biāo)記物組件是相同的，因而來(lái)自不同的樣品、并用包含同量異序標(biāo)記物組件的才艮據(jù)本發(fā)明的一組不同標(biāo)記試劑來(lái)標(biāo)記的相同的多肽或肽的質(zhì)量將是相同的。用包含相同的同位素標(biāo)記物組件、^旦不同的同量異序標(biāo)記物組件的相同組的標(biāo)記試劑標(biāo)記的相同的肽或多肽是等重體(isobars),即，具有相同的重量。因此，在質(zhì)譜儀中如果從集中的樣品混合物的初始質(zhì)量分析選擇具有特定的質(zhì)量電荷比的離子，那么這種選擇的離子含有來(lái)自所述集中的樣品混合物中那些樣品的相同的多肽，其是用包含相同的同位素標(biāo)記物的標(biāo)記試劑標(biāo)記的，其比例相應(yīng)于樣品混合物中它們各自的濃度和/或數(shù)量。由于平衡基團(tuán)用作同量異序標(biāo)記物組件中報(bào)告物的質(zhì)量平衡，所以報(bào)告基團(tuán)/平衡基團(tuán)組合的集合質(zhì)量對(duì)于一個(gè)組的或試劑盒的所有標(biāo)記試劑都是相同的，平衡(和報(bào)告)基團(tuán)中的原子數(shù)量越多，可以產(chǎn)生的不同的同分異構(gòu)/同量異序標(biāo)記物組件的可能數(shù)量就越大，即，可以獲得的與同位素標(biāo)記物組件的組合數(shù)目越大，導(dǎo)致了一組之內(nèi)或試劑盒之內(nèi)提高的標(biāo)記試劑數(shù)目。一般地，報(bào)告基團(tuán)不是限制性因素，平衡基團(tuán)包含的原子的數(shù)量越大，則存在的潛在報(bào)告/平衡基團(tuán)組合的數(shù)目越大，因?yàn)橥凰刂炼嗫梢源嫫胶饣鶊F(tuán)中的任何位置，從而產(chǎn)生平4軒基團(tuán)部分的一組同分異構(gòu)體或等重體，其中平衡基團(tuán)部分被用于補(bǔ)償報(bào)告物部分的不同質(zhì)量，從而產(chǎn)生一組報(bào)告/平衡基團(tuán)同分異構(gòu)體或等重體。這樣的標(biāo)記試劑組分的各種組特別適合于相同和/或不同樣品中多肽的多通道分析?？梢杂糜诋a(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的同位素/同量異序標(biāo)記試劑的組合的不同的同量異序標(biāo)記物組件的總數(shù)是兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)或更多。由于本發(fā)明的雙標(biāo)記試劑包含同量異序和同位素(或異重)標(biāo)記物組件的不同組合，一組中的標(biāo)記試劑的總數(shù)將由組內(nèi)不同的標(biāo)記物組件的數(shù)目的乘積來(lái)決定。同位素標(biāo)記物組件的數(shù)目通常是有限的，一般是2，因而導(dǎo)致一組內(nèi)雙標(biāo)記試劑的總數(shù)是同量異序標(biāo)記物組件的數(shù)目的兩倍。同量異序標(biāo)記物組件的多樣性由報(bào)告基團(tuán)和平衡基團(tuán)部分的原子數(shù)目、能夠代替輕同位素的重原子同位素、以及其中可以合成同位素的各種合成配制(syntheticconfigurations)來(lái)決定。如所提及的那樣，許多同位素富集的基礎(chǔ)起始材料可以容易地從生產(chǎn)商例如CambridgeIsotopeLaboratories和Isotec獲得。這種同位素富集的基礎(chǔ)起始材料被用于合成過(guò)程，所述合成過(guò)程用來(lái)生產(chǎn)同量異序的和同分異構(gòu)的標(biāo)記物組件的組，或用來(lái)生產(chǎn)同位素富集的起始材料，所述起始材料被用在用于生產(chǎn)同量異序的和同分異構(gòu)的標(biāo)記物組件的組的合成過(guò)程中。根據(jù)本發(fā)明的同量異序標(biāo)記物組件的制備至少部分地相應(yīng)于在WO2004070352的實(shí)施例中公開(kāi)的同量異序標(biāo)記試劑的制備。在本發(fā)明的組合的同量異序/同位素標(biāo)記試劑中，同量異序標(biāo)記物組件的報(bào)告基團(tuán)和平衡基團(tuán)通過(guò)稱為X'和Y'的鍵相互連接并任選地連接到同位素標(biāo)記物組件和/或蛋白質(zhì)/肽反應(yīng)基團(tuán)，其中X'是報(bào)告基團(tuán)的原子與平衡基團(tuán)的原子之間的鍵，Y'是平衡基團(tuán)的原子與同位素標(biāo)記物組件和/或標(biāo)記試劑的蛋白質(zhì)/肽反應(yīng)基團(tuán)的原子之間的鍵。在特定的實(shí)施方式中，當(dāng)經(jīng)歷解離能量水平時(shí)，各種同量異序標(biāo)記試劑的鍵X'和Y'被解離。因此，在本發(fā)明的方法的特定的實(shí)施方式中，調(diào)整質(zhì)譜儀中的解離能量水平，從而鍵X'和Y'在同量異序標(biāo)記的多肽或肽的選定離子的至少一部分中被離解。當(dāng)報(bào)告基團(tuán)位于標(biāo)記試劑的末尾時(shí)，鍵X'的碎裂從多肽上釋放報(bào)告基團(tuán)，從而報(bào)告物獨(dú)立于所述肽或多肽是可檢測(cè)的。當(dāng)平衡基團(tuán)通過(guò)鍵Y'連接到多肽或肽時(shí)，鍵Y'的碎裂將報(bào)告基團(tuán)/平衡基團(tuán)組合從多肽或肽上釋放，或?qū)⑵胶饣鶊F(tuán)從所述多肽上釋放，取決于鍵X'是否已經(jīng)被碎裂。同量異序標(biāo)記物的報(bào)告基團(tuán)一般作為本發(fā)明的雙標(biāo)記試劑的末端部分存在。在這種情況下，只需要破壞報(bào)告基團(tuán)和平衡基團(tuán)之間的一個(gè)鍵(X')來(lái)釋放報(bào)告物。然而在特定的實(shí)施方式中，報(bào)告基團(tuán)是本發(fā)明的雙標(biāo)記試劑中的內(nèi)部分子，從而側(cè)面鍵(flankingbonds)是這樣的-它們?nèi)菰S在CID之后從標(biāo)記試劑釋放報(bào)告基團(tuán)。按照相同的方式，在本發(fā)明的雙標(biāo)記試劑的特定實(shí)施方式中同量異序標(biāo)記物組件的分布被設(shè)想相應(yīng)于同量異序標(biāo)記試劑的經(jīng)典設(shè)計(jì)，從而報(bào)告基團(tuán)和平衡基團(tuán)相互鄰近地設(shè)置。本發(fā)明的雙標(biāo)記試劑的可選擇的實(shí)施方式包括通過(guò)雙標(biāo)記試劑的其他部分相互分離的報(bào)告物和平衡基團(tuán)，例如，通過(guò)同位素標(biāo)記物組件。然而在所有的實(shí)施方式中，平衡基團(tuán)的質(zhì)量都補(bǔ)償報(bào)告基團(tuán)的質(zhì)量。在特定的實(shí)施方式中，鍵Y'比鍵X'更不穩(wěn)定。在其他特定的實(shí)施方式中，鍵X'可以比鍵Y'更不穩(wěn)定。在又其他的特定實(shí)施方式中，鍵X'和Y'具有相同的相對(duì)不穩(wěn)定性。在特定的實(shí)施方式中，鍵X'和Y'的相對(duì)不穩(wěn)定性是關(guān)于酰胺(肽)鍵來(lái)調(diào)整的。鍵X'、鍵Y'、或鍵X'和Y'兩者，與典型的酰胺(肽)鍵相比，在這樣的情況下是更不穩(wěn)定的、等同不穩(wěn)定的或更穩(wěn)定的。舉例來(lái)說(shuō)，在解離能量的條件下，與Z-Pro二聚體或Z-Asp二聚體的肽鍵相比，鍵X'和/或鍵Y'較少傾向于碎裂，其中Z是任何天然氨基酸，Pro和Asp分別是脯氨酸和天冬氨酸。在某些實(shí)施方式中，鍵X'和Y'將在與典型的酰胺鍵大約相同的解離能量水平下斷裂。在某些實(shí)施方式中，與典型的酰胺鍵相比，鍵X'和Y'將在更高的解離能量水平下斷裂。在其他特定的實(shí)施方式中，選擇鍵X'和Y',從而鍵Y'的碎裂誘導(dǎo)鍵X'的碎裂，反之亦然。這樣，鍵X'和Y'基本上同時(shí)碎裂，從而在笫二質(zhì)量分析中，沒(méi)有實(shí)質(zhì)數(shù)量的多肽或肽、或其子碎片離子包含部分標(biāo)記物。實(shí)質(zhì)數(shù)量的多肽是指在MS/MS鐠中測(cè)定的、低于25°/0、甚至低于10%的部分標(biāo)記的多肽。由于在笫二質(zhì)量分析(MS/MS)譜中多肽的標(biāo)記的和未標(biāo)記的碎片之間可以有清楚的界限，所以這個(gè)特征簡(jiǎn)化了基于子碎片離子譜的計(jì)算機(jī)輔助分析的多肽鑒定。此外，在某些實(shí)施方式中，由于多肽的碎片離子是用報(bào)告/平衡基團(tuán)部分完全標(biāo)記的或是未標(biāo)記的(但不是部分標(biāo)記)，因此只有;f艮少的或沒(méi)有由跨斷裂的鍵的同位素分布所引起的子碎片離子質(zhì)量的分散，例如，當(dāng)同位素存在于在27第二質(zhì)量分析中通常測(cè)定的部分標(biāo)記的多肽的單個(gè)不穩(wěn)定鍵的每一側(cè)時(shí)就是這種情況。本發(fā)明的標(biāo)記試劑和要標(biāo)記的蛋白質(zhì)或肽之間的反應(yīng)由蛋白質(zhì)/肽反應(yīng)基團(tuán)的存在來(lái)確保。標(biāo)記試劑上的蛋白質(zhì)/肽反應(yīng)基團(tuán)(PRG)是與某些蛋白質(zhì)或肽官能團(tuán)選擇性反應(yīng)的基團(tuán)，或是感興趣的酶的底物(substrate)。適合的蛋白質(zhì)/肽反應(yīng)基團(tuán)和它們與之反應(yīng)的官能團(tuán)的實(shí)例在以下提供-硫醇反應(yīng)基團(tuán)與半胱氨酸的側(cè)鏈反應(yīng)。硫醇反應(yīng)基團(tuán)包括環(huán)氧化物、a-卣素酰基基團(tuán)、腈、磺化的烷基或芳基硫醇、卣代烷、芳基酰胺和馬來(lái)酰亞胺類。特定的實(shí)例是碘乙酰胺或其衍生物。-氨基-反應(yīng)基團(tuán)與賴氨酸的側(cè)鏈的s胺基團(tuán)反應(yīng)，或與在多肽的N-末端處的胺反應(yīng)。氨基反應(yīng)基團(tuán)結(jié)合蛋白質(zhì)中的氨基，包括磺酰卣、異氰酸酯、異硫氰酸酯、活性酯，包括四氟苯基酯、五氟苯基酯、N-羥基琥珀酰亞胺基酯、N-羥基磺基琥珀酰亞胺基酯、2-硝基苯基酯、4-硝基苯基酯、2,4-二硝基苯基酯和2,4-二鹵代苯基酯、?；u、和酸酐和混合酸酐。此外，氨基反應(yīng)基團(tuán)包括醛或酮，在存在或不存在NaBEU或NaCNBH3的情況下。-羧酸反應(yīng)基團(tuán)與天冬氨酸和谷氨酸的側(cè)鏈反應(yīng)，或與多肽的C-末端反應(yīng)。羧酸反應(yīng)基團(tuán)包括胺或醇，在存在偶聯(lián)劑例如二環(huán)己基碳二亞胺、或三氟乙酸2,3,5,6-四氟苯基酯的情況下，以及在存在或不存在偶聯(lián)催化劑例如4-二曱基氨基吡啶的情況下；和過(guò)渡金屬-二胺絡(luò)合物，包括Cu(II)菲咯啉。-咪唑類反應(yīng)基團(tuán)與組氨酸反應(yīng)。-酯反應(yīng)基團(tuán)包括胺，例如，其與高絲氨酸內(nèi)酯反應(yīng)。曱疏氨酸在CNBr裂解期間轉(zhuǎn)化成高絲氨酸內(nèi)酯。畫石岸酸酯反應(yīng)基團(tuán)(phosphatereactivegroup)與石奔酸化的氨基酸例如磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸和磷酸酪氨酸反應(yīng)。磷酸酯反應(yīng)基團(tuán)包括螯合的金屬，其中金屬是例如Fe(III)或Ga(III),螯合到例如次氮基三乙酸(nitrilotriacetiacacid)或亞氨基二乙酸。這些試劑與磷酸化的氨基酸反應(yīng)(例如，磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸和磷酸酪氨酸)。畫醛或酮反應(yīng)基團(tuán)包括胺加NaBH4或NaCNBH3，或首先用高碘酸鹽處理碳水化合物之后產(chǎn)生醛或酮的這些試劑。-羥基反應(yīng)基團(tuán)與絲氨酸和蘇氨酸反應(yīng)。羥基反應(yīng)基團(tuán)包括三苯甲基卣化物或曱硅烷基卣化物反應(yīng)部分，其是被取代的或未被取代的。本發(fā)明的雙標(biāo)記物通過(guò)標(biāo)記試劑的蛋白質(zhì)/肽反應(yīng)基團(tuán)與所述蛋白質(zhì)或肽內(nèi)存在的官能團(tuán)之間的相互作用連接到蛋白質(zhì)或肽。這種官能團(tuán)可以由于存在于樣品中而預(yù)先存在于多肽中，或可以在其上產(chǎn)生，任選在所述多肽的分離之后。例如，羧酸基團(tuán)可以用水溶性的碳二亞胺(例如，l-(3-二曱基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；EDC)修飾從而來(lái)獲得與親核試劑例如胺基團(tuán)反應(yīng)的親電子基團(tuán)。使用EDC的標(biāo)記試劑的羧酸基團(tuán)的活化可以在存在胺的情況下進(jìn)行。與NH2-CH2-CH2-NH2組合利用碳二亞胺類容許將羧基基團(tuán)轉(zhuǎn)變成胺基團(tuán)。與NH2-CH2-CH2-SH組合利用EDC確保了羧基基團(tuán)向硫醇基團(tuán)的轉(zhuǎn)變。適合于修飾多肽或在多肽上引入官能團(tuán)的其他化合物的非限制性列表包括2-氨基乙基-2'-氨基乙疏醇-磺酸鹽(2畫Aminoethyl-2'-aminoethanethiol國(guó)sulfonate),其是將石危醇基團(tuán)轉(zhuǎn)化成還原劑可裂解的胺基團(tuán)的硫醇反應(yīng)性胺化試劑(thiol-reactiveaminationreagent);氨基乙基-8試劑，其將游離硫醇轉(zhuǎn)化成伯胺基團(tuán)；將硫醇基團(tuán)修飾成為羧基基團(tuán)的BMPA;MSA,其是具有潛在的羧基基團(tuán)的胺反應(yīng)性的(它將胺轉(zhuǎn)變成被保護(hù)的羧基。羧基在磷酸鹽緩沖液中在pH9.5被去屏蔽(unmasked));與伯胺反應(yīng)來(lái)添加被保護(hù)的硫醇的SATA;羥胺HCl(HydroxylamineHC1),其是對(duì)于解封閉SATA和SATP修飾的蛋白質(zhì)來(lái)產(chǎn)生游離>5危醇高度有效的試劑，以及Traut，s試劑，其是在pH7-10下與伯胺反應(yīng)來(lái)引入硫醇基團(tuán)的水溶性試劑。這些試劑可以獲自例如PierceChemicals(IL,USA)。還設(shè)想的是，通過(guò)除去保護(hù)基團(tuán)在肽或多肽中產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)。因此，在特定的實(shí)施方式中，多肽中的官能團(tuán)被改變或添加。在特定的實(shí)施方式中，添加的官能團(tuán)是在蛋白質(zhì)中不天然出現(xiàn)的基團(tuán)。在本發(fā)明的情境中適合的雙標(biāo)記試劑的其他實(shí)施方式中，PRG基團(tuán)實(shí)際上是特定的蛋白質(zhì)修飾酶的底物。這種酶可以是體內(nèi)翻譯后修飾中涉及的酶。這些酶中的某些與疾病狀態(tài)或出生缺陷相關(guān)。關(guān)于這些的實(shí)例是酸性磷酸酶(acidphosphatase)、堿性磷酸酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、淀粉酶、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensinconvertingenzyme)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、肌酸激酶、Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、脂肪酶、乳酸脫氪酶和葡萄4唐-6-石壽酸酉旨脫氛酵(glucose-6-phosphatedehydrogenase)、蛋白酵和酉旨酶。根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)記試劑的特定的實(shí)施方式，所述同位素標(biāo)記物組件和所述同量異序標(biāo)記物組件構(gòu)成標(biāo)記試劑的不同部分，由4建分隔。根據(jù)這些實(shí)施方式的適合的同位素和同量異序標(biāo)記物組件如上所述。然而，為了簡(jiǎn)化試劑的制造，特別是同位素的摻入，同位素標(biāo)記物組件的同位素可以摻入標(biāo)記試劑的另一個(gè)部分之中或之上，更特別的，摻入同量異序標(biāo)記物組件之中或之上，在其報(bào)告基團(tuán)中或平衡基團(tuán)中。根據(jù)一個(gè)特定的實(shí)施方式，同量異序基團(tuán)的平衡基團(tuán)具有結(jié)構(gòu)-C-CO-C-(參見(jiàn)附圖3)(例如商業(yè)上可獲得的同量異序標(biāo)記物)，或更大的基團(tuán)，例如上文所描述的那些，例如-CH2-CHR^CH2-,其中W是相同的或不同的，并且是包含一到八個(gè)碳原子的烷基，其包含同位素標(biāo)記物組件，其任選地是雜原子，或取代的或未取代的芳基基團(tuán)，其中所述烷基和芳基基團(tuán)的碳原子獨(dú)立地包含連接的氫、氘和/或氟原子。為了使同量異序標(biāo)記物組件的平衡基團(tuán)也起同位素標(biāo)記物組件的作用，這種-CHb-CHR1-CHb-基團(tuán)一方面帶有所需數(shù)量的同位素來(lái)提供與報(bào)告基團(tuán)的平衡，另一方面含有所需數(shù)量的同位素替換以在一個(gè)組中產(chǎn)生不同標(biāo)記試劑之間的質(zhì)量差。做為選擇，單獨(dú)的標(biāo)記試劑之間的質(zhì)量差通過(guò)用其他原子改變標(biāo)記試劑中的一個(gè)或多個(gè)原子來(lái)獲得，從而確保標(biāo)記試劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)特征被最小地改變，來(lái)確保在MS之前，即在電泳或?qū)游銎陂g，不考慮連接的標(biāo)記物，差異化標(biāo)記的相同的肽的基本上相同的行為。舉例來(lái)說(shuō)，設(shè)想一組8種標(biāo)記試劑，其中一組4種標(biāo)記試劑具有同量異序標(biāo)記物組件，包含氧，如附圖3中描繪的那樣。在另一組4個(gè)標(biāo)記試劑中，同量異序標(biāo)記物組件中的氧原子被硫替換，參見(jiàn)附圖4,以和附圖3中所示相同的方式通過(guò)用34S替換32S來(lái)獲得平衡。這種改變對(duì)同量異序標(biāo)記物組件質(zhì)量的影響在表2中說(shuō)明。30表2:通過(guò)同量異序標(biāo)記物的平衡基團(tuán)結(jié)構(gòu)的改變產(chǎn)生質(zhì)量差異。<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>通過(guò)用硫替換標(biāo)記物中的單個(gè)碳獲得的雙標(biāo)記的肽之間的輕微的化學(xué)差異將僅改變這樣的肽在分離系統(tǒng)如液相層析上的行為到有限的程度。碳和硫的質(zhì)量之間的差異容許根據(jù)它們的質(zhì)量分離兩組標(biāo)記的肽。對(duì)于這兩個(gè)組的每一個(gè)，將在MS/MS中照常產(chǎn)生不同的報(bào)告基團(tuán)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，差異化標(biāo)記試劑之間的質(zhì)量差異通過(guò)在同量異序標(biāo)記物組件的報(bào)告基團(tuán)中摻入另外的同位素來(lái)獲得。在附圖3中描繪的同量異序標(biāo)記物組件中，另外的氘原子可以摻入甲基-哌溱基團(tuán)中，來(lái)產(chǎn)生附圖3的標(biāo)記物的同位素標(biāo)記物。然而，當(dāng)設(shè)想利用具有3種或更多不同質(zhì)量的標(biāo)記試劑組的更高的多通道化時(shí)，曱基哌嗪基團(tuán)變得太小而不能攜帶所有這些額外的同位素。因而，作為實(shí)例，標(biāo)記試劑被提供有丙基哌。秦基團(tuán)(參見(jiàn)附圖4C),其中摻入不同的氘和13C同位素。表3顯示了具有丙基哌"秦基團(tuán)的一組8個(gè)標(biāo)記試劑的報(bào)告和平衡基團(tuán)的質(zhì)量，其中質(zhì)量差通過(guò)在丙基側(cè)鏈中摻入兩個(gè)"C和兩個(gè)2！1同位素來(lái)獲得。表3:通過(guò)同量異序標(biāo)記物的報(bào)告基團(tuán)的改變產(chǎn)生質(zhì)量差異。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>如表3中呈現(xiàn)的標(biāo)記物的這種設(shè)計(jì)具有的優(yōu)點(diǎn)是，報(bào)告基團(tuán)的質(zhì)量對(duì)于集中的樣品中每種標(biāo)記的肽都是獨(dú)特的，并充當(dāng)了內(nèi)部對(duì)照。類似地，如上文對(duì)平衡基團(tuán)所闡述的那樣，單獨(dú)的標(biāo)記試劑之間的質(zhì)量差異也可以通過(guò)用另一個(gè)原子替換報(bào)告基團(tuán)中的原子來(lái)獲得，只要結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)的改變是最小限度的。概括起來(lái)，通過(guò)在常規(guī)同量異序標(biāo)記物組件的報(bào)告基團(tuán)和/或平衡基團(tuán)之內(nèi)提供同位素標(biāo)記物組件，不需要在標(biāo)記試劑中設(shè)計(jì)獨(dú)立的部分來(lái)用于摻入同位素。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的雙標(biāo)記試劑包含親和標(biāo)簽(A),其容許選擇性地分離已經(jīng)與標(biāo)記試劑反應(yīng)的、即已被標(biāo)記的那些多肽。雖然親和標(biāo)簽原則上可以存在于試劑上的任何位置，但它一般位于不影響報(bào)告基團(tuán)在CID后的釋放的位置。在特定的實(shí)施方式中，親和標(biāo)簽位于同位素標(biāo)記物組件的側(cè)鏈上。雖然親和標(biāo)簽可以是大體積的，但它們可以用可裂解基團(tuán)結(jié)合到標(biāo)記試劑。一般地，在片企測(cè)之前親和標(biāo)簽被從多肽上的標(biāo)記物上除去，僅留下標(biāo)記物上的疤痕。如以上所指出的，在本發(fā)明的雙標(biāo)記試劑中親和標(biāo)簽的存在，容許標(biāo)記的肽或多肽的選擇性結(jié)合，結(jié)合為共價(jià)地或非共價(jià)地并具有對(duì)捕獲試劑(CR)的高親和力。一般地，親和標(biāo)簽與捕獲試劑的結(jié)合是強(qiáng)的，從而它對(duì)使用多種溶液的任一種或組合的大量的和/或多次的洗滌具有抗性，這確保了除去沒(méi)有特異性結(jié)合到捕獲試劑上的肽或多肽。一般地，親和標(biāo)簽不經(jīng)歷MS分析期間的類似肽的碎裂。通過(guò)親和標(biāo)簽與CR結(jié)合的肽或多肽的去除可以通過(guò)添加如下所述的置換配體(displacingligand,DL)、或通過(guò)改變溫度或溶劑條件來(lái)實(shí)現(xiàn)。根據(jù)一個(gè)特定的實(shí)施方式，設(shè)想的是，為了進(jìn)一步降低用于分析的樣品的復(fù)雜度，設(shè)想了在本發(fā)明的方法和工具的情境中雙標(biāo)記的蛋白質(zhì)或肽的提取。為了在這些實(shí)施方式的情境中使用，親和標(biāo)簽的性質(zhì)不是關(guān)鍵的，只要它容許選擇性結(jié)合到捕獲試劑(CR)和任選地從其上去除，而不影響與親和標(biāo)簽結(jié)合的肽或多肽。因此，親和標(biāo)簽(A)和捕獲試劑(CR)對(duì)的非限制性實(shí)例包括-d-生物素或結(jié)構(gòu)上修飾的基于生物素的試劑，包括d-亞氨基生物素，其結(jié)合到抗生物素蛋白/鏈霉抗生物素蛋白(streptavidin)(例如鏈霉抗生物素蛋白-瓊脂糖、寡聚-抗生物素蛋白-瓊脂糖，或單體-抗生物素蛋白-瓊脂糖)-1,2-二醇，例如1,2-二羥基乙烷(HO-CH2-CH2-OH),和其他1,2-二羥基烷烴，包括環(huán)烷烴的那些，例如，1，2-二羥基環(huán)己烷，其結(jié)合到烷基或芳基硼酸或硼酸酯，例如苯基-B(OH)2或己基-B(0乙基)2(例如，經(jīng)由烷基或芳基基團(tuán)附著到支持物例如瓊脂糖)-結(jié)合到麥芽糖結(jié)合蛋白的麥芽糖；或其他的糖/糖結(jié)合蛋白對(duì)，或更一般地，服從上述的親和標(biāo)簽標(biāo)準(zhǔn)的任何配體/配體結(jié)合蛋白對(duì)。-半抗原，例如，二硝基苯基基團(tuán)，其結(jié)合到相應(yīng)的抗半抗原抗體，例如，抗二硝基苯基-IgG;-結(jié)合到過(guò)渡金屬的配體，例如，寡聚組氨酸(所謂的6His-標(biāo)簽)將結(jié)合Ni(II),在特定的實(shí)施方式中過(guò)渡金屬CR以樹(shù)脂結(jié)合的螯合過(guò)渡金屬的形式使用，例如，氮基三乙酸螯合的Ni(II)或亞氨基二乙酸螯合的Ni(II);-結(jié)合到谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的谷胱甘肽。在本發(fā)明的特定的實(shí)施方式中，雙標(biāo)記的肽或多肽的親和純化在MS分析之前進(jìn)行。因此，由于結(jié)合的肽或多肽需要進(jìn)一步的分析，所以需要從捕獲試劑上除去，或親和標(biāo)簽從肽上解離。這可以以不同的方法實(shí)現(xiàn)。在特定的實(shí)施方式中，親和標(biāo)簽是可從標(biāo)記試劑上裂解的，使試劑的同量異序和異重(同位素)標(biāo)記物組件保持完整。如以上所指出的，親和標(biāo)簽在本發(fā)明的標(biāo)記試劑上的位置不是關(guān)鍵的。因而，親和標(biāo)簽可以通過(guò)化學(xué)上或酶學(xué)上可裂解的鍵結(jié)合到標(biāo)記試劑中的同位素或同量異序標(biāo)記物組件上。在特定的實(shí)施方式中，親和標(biāo)簽通過(guò)可裂解的鍵(例如，但不限于，酸不穩(wěn)定的、硫醇不穩(wěn)定的、堿不穩(wěn)定的、高碘酸不穩(wěn)定的或羥胺不穩(wěn)定的鍵)連接到雙標(biāo)記試劑。在進(jìn)一步的特定實(shí)施方式中，親和標(biāo)簽和標(biāo)記試劑之間的鍵也可以是通過(guò)化學(xué)、熱或光化反應(yīng)可裂解的。適合的光可裂解基團(tuán)是1-(2-硝基苯基)-乙基。熱不穩(wěn)定鍵是例如，雙鏈核酸、核酸與肽核酸的雙鏈、或雙鏈的肽核酸鏈，其將在加熱時(shí)解離?？闪呀獾幕鶊F(tuán)還包括具有二硫鍵的那些，酸或堿不穩(wěn)定基團(tuán)，尤其包括，二芳基甲基或三甲基芳基甲基基團(tuán)，甲硅烷基醚，氨基曱酸酯(carbamates),氧酯(oxyesters),疏酯(thiesters),疏逐酸酯(thionoesters)和oc-氟化的酰胺和酯?？擅噶呀獾幕鶊F(tuán)是例如，蛋白酶敏感的酰胺或酯、P-內(nèi)酰胺酶敏感的P-內(nèi)酰胺類似物，以及核酸酶可裂解的或糖香酶可裂解的鍵。才艮據(jù)這個(gè)實(shí)施方式，親和標(biāo)簽可以通過(guò)用適合的試劑處理標(biāo)記的蛋白質(zhì)或肽來(lái)除去。對(duì)于其它原因，例如，來(lái)避免肽的分析中，例如MS中的干擾，親和標(biāo)簽的除去也是希望的。一般地，在標(biāo)記的肽或多肽的親和分離之后裂解掉親和標(biāo)簽。做為選擇，親和標(biāo)簽可以通過(guò)不可裂解的鍵結(jié)合到本發(fā)明的標(biāo)記試劑。為了確保可以回收親和純化的肽，使用可以從捕獲試劑上解離的親和標(biāo)簽。在特定的實(shí)施方式中，使用生物素和基于生物素的親和標(biāo)簽。特別感興趣的是在結(jié)構(gòu)上修飾的生物素，例如，d-亞氨基生物素，其將在與ESI-MS分析相容的溶劑條件下，例如，含有10-20%有機(jī)溶劑的烯酸，從抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白柱上洗脫。已經(jīng)建立的是，d-亞氨基生物素標(biāo)簽化的化合物將在低于pH4的溶劑中洗脫。另外地或作為選擇，置換配體(DL)被用于從捕獲試劑(CR)替換親和標(biāo)簽(A)(和與之結(jié)合的肽或蛋白質(zhì))。當(dāng)用DL洗脫時(shí)，這種DL的至少一部分將存在于包含感興趣的肽的洗脫液中。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法可以包括利用DL,其是在MS分析期間不經(jīng)歷類似肽的碎裂的分子，并且它在樣品中的存在不顯著抑制標(biāo)簽化的肽、底物或反應(yīng)產(chǎn)物綴合物的電離。特別地，可以選擇置換配體從而它本身在質(zhì)譜分析期間被最小限度地電離并且由DL簇組成的離子的形成是最小的。適合的置換配體(DL)的性質(zhì)取決于所采用的A和CR。一般地，選擇DL來(lái)在合理的時(shí)間尺度上從CR替換A,最多在它添加的一周內(nèi)，但更優(yōu)選在幾分鐘或至多一小時(shí)之內(nèi)。與含有A的標(biāo)簽化的化合物對(duì)CR的親和力相比，DL對(duì)CR的親和力應(yīng)當(dāng)是可比4交的或更強(qiáng)的。此外，DL應(yīng)當(dāng)可溶于在含有親和標(biāo)簽A的標(biāo)簽化的化合物從CR洗脫期間所使用的溶劑中。在特定的實(shí)施方式中，DL對(duì)應(yīng)于游離的親和標(biāo)簽A,或A的衍生物或結(jié)構(gòu)修飾物。置換配體的實(shí)例因而包括d-生物素或d-生物素書(shū)t生物。構(gòu)成本發(fā)明的標(biāo)記試劑的部分的同位素(IT)和同量異序(IB)標(biāo)記物組件、蛋白質(zhì)反應(yīng)基團(tuán)(PRG)和任選的親和標(biāo)簽(A)可以以不同的可能的構(gòu)造設(shè)置?？赡艿慕M合的非限制性列表在附圖5中示出。此處的要求是，標(biāo)記試劑的PRG可以與多肽上的官能團(tuán)反應(yīng)，和同量異序標(biāo)記物組件的報(bào)告基團(tuán)可以在CID時(shí)釋放。不同的部分，除了在側(cè)面連接報(bào)告基團(tuán)的那些之外，之間的鍵可上述的同位素標(biāo)記物組件的化學(xué)結(jié)構(gòu)，或其中所標(biāo)明的基團(tuán)Bl或B2可以用于連接標(biāo)記試劑的不同部分。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供了方法和分析，其中利用本發(fā)明的雙標(biāo)記試劑差異化標(biāo)記樣品，來(lái)容許用MS同時(shí)分析。因此，本發(fā)明提供了同時(shí)分析不同的樣品中包含官能團(tuán)的一種或多種多肽的存在的方法。本發(fā)明的方法包括標(biāo)記步驟，其中通過(guò)容許標(biāo)記試劑與樣品中一種或多種多肽或從其產(chǎn)生的肽的官能團(tuán)反應(yīng)，用一組差異化雙標(biāo)記試劑的一種來(lái)標(biāo)記每種樣品。如在上文中詳細(xì)描述的，這一組差異化雙標(biāo)記試劑具有相同的或基本上相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)并帶有同位素和同量異序標(biāo)記物組件。每種標(biāo)記試劑包含同位素和同量異序標(biāo)記物組件的獨(dú)特組合。在標(biāo)記之后的步驟中，對(duì)于每種樣品，標(biāo)記的肽;陂分離和分析。理想地，在本發(fā)明的情境中設(shè)想的分析方法中，標(biāo)記步驟靶向樣品中幾乎每一個(gè)蛋白質(zhì)，以獲得樣品中蛋白質(zhì)組(proteome)的最大的覆蓋度。35同時(shí)，當(dāng)考慮每個(gè)單獨(dú)的蛋白質(zhì)時(shí)，在該蛋白質(zhì)中官能團(tuán)的數(shù)量理想地是低的，以降低分析的復(fù)雜度(來(lái)自樣品中這種蛋白質(zhì)的要分析的肽的數(shù)目?jī)H是一種或是有限的數(shù)目)。半胱氨酸通常被用作用于標(biāo)記的官能團(tuán)，因?yàn)榘腚装彼針?biāo)記提供了最大覆蓋度(標(biāo)記樣品中的每個(gè)蛋白質(zhì))和最小復(fù)雜度(標(biāo)記樣品中每個(gè)蛋白質(zhì)僅一次或有限的次數(shù))之間的折衷。半胱氨酸在Genbank中所有蛋白質(zhì)的約85%中存在，并且在多肽序列中平均以2%的頻率出現(xiàn)(每50個(gè)氨基酸中一個(gè))。此外，用半胱氨酸反應(yīng)性試劑標(biāo)記不修飾蛋白質(zhì)的其他部分，而標(biāo)記在賴氨酸和氨基末端上出現(xiàn)的胺基團(tuán)或者標(biāo)記在天冬氨酸、谷氨酸和羧基末端上出現(xiàn)的羧基基團(tuán)則通常是這樣的。根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方式，因而通過(guò)半胱氨酸官能團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，在標(biāo)記步驟之前，樣品凈皮還原以確保在樣品蛋白質(zhì)中的半胱氨酸上可用的硫醇官能團(tuán)的存在。此外，半胱氨酸出現(xiàn)在給定的酶消化物的C-末端肽或N-末端肽中的概率，隨著這種酶在蛋白質(zhì)中的識(shí)別位點(diǎn)的數(shù)目而降低。這個(gè)數(shù)目通常隨多肽的長(zhǎng)度而成比例地提高。因而，其中半胱氨酸被用作標(biāo)記試劑的官能團(tuán)的標(biāo)記方法非常適合于測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)水平。根據(jù)一個(gè)特定的實(shí)施方式，如以上所指出的，本發(fā)明的方法包括在標(biāo)記步驟之前或之后的蛋白質(zhì)變?yōu)殡牡牧呀獠襟E。通常進(jìn)行這一步驟來(lái)容許分析較小的肽，而不是全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)。在高處理量系統(tǒng)例如LC中，與蛋白質(zhì)相比，更容易分離肽，并且在MS/MS中更容易解釋來(lái)自肽的序列數(shù)據(jù)。用于蛋白質(zhì)裂解的適合的化學(xué)物質(zhì)包括溴化氰、BNPS曱基吲哚(BNPSskatole)(2-(2'-硝基苯基磺?；?-3-曱基-3-溴假吲哚)、曱酸、羥胺、碘苯甲酸、NTCB+Ni(2硝基5氰硫基(thiocyano)苯曱酸)。適合的蛋白水解酶包括Asp-N內(nèi)肽酶、半胱氨酸蛋白酶(caspase)l、2、3、4、5、6、7、8、9或10、糜蛋白酶；梭菌蛋白酶、腸激酶、因子X(jué)a、谷氨酰內(nèi)月太酶(glutamylendopeptidase)、GranzymeB、LysC賴氨酰內(nèi)月大酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、脯氨酸內(nèi)肽酶、蛋白酶K、葡萄球菌的肽酶I、嗜熱菌蛋白酶、凝血酶、胰蛋白酶。取決于蛋白質(zhì)樣品的類型，進(jìn)行化學(xué)裂解和酶裂解的組合，或進(jìn)行雙酶消化。盡管有各種酶和化學(xué)物質(zhì)，胰蛋白酶仍然是具有最高特異性(賴氨酸和精氨酸)和效率的酶。在脊推動(dòng)物中，在蛋白質(zhì)中賴氨酸以7.4%的頻率存在，精氨酸以4.2。/o的頻率存在。因而，胰蛋白酶消化對(duì)于未修飾的蛋白質(zhì)產(chǎn)生具有9個(gè)氨基酸的平均長(zhǎng)度的肽，而當(dāng)賴氨酸被修飾到不再有胰蛋白酶的底物的程度時(shí)，產(chǎn)生具有25個(gè)氨基酸的平均長(zhǎng)度的肽。這樣的肽非常適合于層析和MS技術(shù)。根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)特定實(shí)施方式，蛋白質(zhì)的裂解在標(biāo)記之后進(jìn)行。通過(guò)僅分離在官能團(tuán)上帶有標(biāo)記物的那些肽，這容許降低樣品的復(fù)雜度。根據(jù)一個(gè)特定的實(shí)施方式，用胰蛋白酶消化標(biāo)記的蛋白質(zhì)。根據(jù)一個(gè)更特定的實(shí)施方式，在進(jìn)行胰蛋白酶消化之前，標(biāo)記的蛋白質(zhì)用乙酰化試劑進(jìn)行處理來(lái)修飾賴氨酸的側(cè)鏈。結(jié)果，多肽的氨基末端將同樣地;陂乙?；８鶕?jù)另一個(gè)特定的實(shí)施方式，標(biāo)記的蛋白質(zhì)用賴氨酸特異性蛋白酶來(lái)消化。作為結(jié)果，從這種消化獲得的所有的肽將在它們的氨基末端處和在羧基末端賴氨酸的側(cè)鏈處具有胺基團(tuán)(除了可能具有另一個(gè)羧基末端氨基酸的羧基末端肽之外)。在標(biāo)記步驟中被雙標(biāo)記的、但是不包含蛋白質(zhì)裂解位點(diǎn)的蛋白質(zhì)可以作為裂解的肽原樣地參予剩余的過(guò)程。根據(jù)本發(fā)明的方法的特定的實(shí)施方式，使用的標(biāo)記試劑包含親和標(biāo)簽，所述方法包括雙標(biāo)記樣品中存在的蛋白質(zhì)、裂解雙標(biāo)記的蛋白質(zhì)以及根據(jù)肽上的標(biāo)記物中存在的親和標(biāo)簽來(lái)分離雙標(biāo)記的肽的步驟。這種親和分離容許降低樣品的復(fù)雜度用于進(jìn)一步的分析。當(dāng)進(jìn)行蛋白質(zhì)裂解時(shí)，不包含官能團(tuán)并因而不被標(biāo)記的那些肽被除去。本發(fā)明的方法包括集中兩種或更多種樣品的步驟，所述樣品是在第一和第二標(biāo)記步驟中被差異化地標(biāo)記的。通過(guò)集中不同的樣品，獲得多肽樣品混合物。這容許在分析中即刻比較不同的樣品。當(dāng)本發(fā)明的方法中使用的蛋白質(zhì)樣品是復(fù)雜的時(shí)，集中的樣品將經(jīng)歷一種或多種肽分離技術(shù)，以從多肽樣品混合物中選擇性地分離具有相同的氨基酸序列的雙標(biāo)記的多肽或肽。根據(jù)本發(fā)明，在一組標(biāo)記試劑之內(nèi)組合的同量異序/同位素標(biāo)記物37的化學(xué)結(jié)構(gòu)是相同的，或是基本上相同的，從而在被不同地標(biāo)記的相同的肽之間，在(多維)層析技術(shù)中的性質(zhì)方面其不會(huì)產(chǎn)生顯著差異。容許將復(fù)雜的蛋白質(zhì)或肽樣品分離成兩種或更多種、直到多種級(jí)分(在分離雙標(biāo)記的肽的情境中)的適合的分離技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括但不限于等電聚焦(isoelectricfocusing)、SDSPAGE、2-維凝膠電泳、尺寸排阻層折、離子交換層析、反相HPLC、親和層析，等等。當(dāng)樣品由更大的肽(例如，Mr3000和100,000之間)組成時(shí)，可以使用2DGE。對(duì)于從例如蛋白水解消化獲得的肽樣品，2DLC方法更適合于分離，并且自動(dòng)化和處理量顯著更好。已經(jīng)描述了通過(guò)液相層析分離蛋白質(zhì)/肽消化物的幾種技術(shù)，反相(RP)-HPLC,和2-維液相層析。毛細(xì)管電泳(CE)也是適合于分離肽的方法。2D-LC—般利用離子交換柱(通常，強(qiáng)陽(yáng)離子交換，SCX),在線與反相柱連接，以一系列的循環(huán)來(lái)運(yùn)行。在每個(gè)循環(huán)中，鹽濃度在離子交換柱中提高，以根據(jù)肽的離子電荷將它們洗脫到反相系統(tǒng)中。在此，肽根據(jù)疏水性被分離，通過(guò)例如，CH3CN梯度。許多參數(shù)影響可以被LC-MS顯示的分辨能力和隨后的蛋白質(zhì)數(shù)量。通常，設(shè)置笫一維分離技術(shù)(SCX)和笫二維RP-HPLC分離方法之間的"在線，，構(gòu)造用于樣品分級(jí)。離子交換層析可以通過(guò)利用不斷提高的鹽濃度的分步洗脫進(jìn)行、或通過(guò)鹽梯度進(jìn)行。一般地，SCX在存在例如最高達(dá)30%乙腈的情況下進(jìn)行，以最小化SCX層析期間的疏水相互作用。在實(shí)施在例如C18柱上的反相層析之前，除去有機(jī)溶劑例如乙腈，或通過(guò)例如蒸發(fā)來(lái)強(qiáng)烈地降低。因而，適合于進(jìn)行本發(fā)明的方法的設(shè)備任選地含有或連接到一個(gè)或多個(gè)適合的分離儀器，例如電泳儀器、層析儀器，例如但不限于毛細(xì)管電泳(CE)儀器、反相(RP)-HPLC儀器，和/或多維液相層析儀器，等等。本發(fā)明提供了用于不同樣品中蛋白質(zhì)的同時(shí)鑒定(通過(guò)MS/MS)和/或定量(通過(guò)MS或MS/MS)的工具和方法。更特別地，本發(fā)明的方法涉及通過(guò)質(zhì)譜法、隨后通過(guò)肽的鑒定來(lái)分析分離的雙標(biāo)記的多肽或肽的相對(duì)發(fā)生率(relativeoccurrence)。因而，用于實(shí)施本發(fā)明的方法的設(shè)備包括一個(gè)或多個(gè)質(zhì)譜儀。通過(guò)譜測(cè)定法進(jìn)行的質(zhì)量測(cè)量通過(guò)將被分析物電離成氣相來(lái)進(jìn)行。典型質(zhì)譜儀由3個(gè)組件構(gòu)成，從感興趣的分子產(chǎn)生離子的離子源、測(cè)定電離的分子的質(zhì)荷比(m/z)的質(zhì)量分析器、以及對(duì)每個(gè)單獨(dú)的m/z值對(duì)離子的數(shù)量進(jìn)行記錄并計(jì)數(shù)的檢測(cè)器。MS譜中的每個(gè)特征由兩個(gè)值定義，m/z以及對(duì)離子數(shù)量的測(cè)量，所述離子到達(dá)儀器的檢測(cè)器。譜儀中用于質(zhì)量分析的蛋白或肽的電離通常通過(guò)電噴霧電離(ESI)或基質(zhì)輔助的激光解吸/電離(MALDI)來(lái)進(jìn)行。在ESI過(guò)程期間，被分析物被直接電離出溶液，因而ESI常常直接連接到液體層析分離工具(例如，反相HPLC)上。MALDI經(jīng)由激光脈沖來(lái)蒸發(fā)與小有機(jī)分子混合的干燥樣品，所述小有機(jī)分子吸收激光能量，如苯丙烯酸，來(lái)使得該過(guò)程更有效。質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀的關(guān)鍵組件；重要的參數(shù)是敏感性、分辨率和質(zhì)量精確性。當(dāng)前在蛋白質(zhì)組學(xué)中使用五種基本類型的質(zhì)量分析器。這些包括離子阱、飛行時(shí)間(TOF)、四極、Orbitrap和傅里葉變換離子回旋加速(FTICR-MS)分析器。串聯(lián)的MS或MS/MS可以以時(shí)間(離子阱)和以位置(所有雜化儀器，例如LTQ-FTICR、LTQ-Orbitrap、Q-TOF、TOF-TOF、三級(jí)四極和雜化三級(jí)四極/線性離子阱(QTRAP))進(jìn)行。如在此詳述的，已經(jīng)預(yù)先從差異化標(biāo)記的樣品的庫(kù)中分離的多肽或肽在質(zhì)譜儀上產(chǎn)生的譜，含有具有在不同的同位素標(biāo)記物組件之間的特征質(zhì)量差異的一組峰(如果在樣品之一中如果其中出現(xiàn)這種多肽的蛋白質(zhì)根本沒(méi)有被表達(dá)，峰的數(shù)量將更少)。這些峰的每一個(gè)都通過(guò)串聯(lián)MS進(jìn)行進(jìn)一步分析，來(lái)釋放同量異序標(biāo)記物組件的報(bào)告基團(tuán)，用于不同地標(biāo)記的肽的鑒定和進(jìn)一步的定量。根據(jù)多肽的Mr,單獨(dú)的肽的氨基酸組成或氨基酸序列，肽的身份被測(cè)定。以下通過(guò)許多標(biāo)記方案來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的方法。如上文中詳述的和以下在不同的說(shuō)明性標(biāo)記方案中進(jìn)一步的闡明的，肽的碎裂和親和標(biāo)簽的使用對(duì)于本發(fā)明的所有實(shí)施方式都不是必需的。以下標(biāo)記方案(參見(jiàn)附圖6)公開(kāi)了利用具有蛋白質(zhì)反應(yīng)基團(tuán)(PRG)的本發(fā)明的雙標(biāo)記試劑標(biāo)記8種蛋白質(zhì)樣品的實(shí)施方式，所述蛋白質(zhì)反應(yīng)基團(tuán)是半胱氨酸反應(yīng)基團(tuán)。在預(yù)加工步驟中，樣品被還原來(lái)確保半胱氨酸上可使用的硫醇官39能團(tuán)的存在，并且被乙?；瘉?lái)封閉賴氨酸的側(cè)鏈的胺。標(biāo)記方案的不同步驟包括-8種蛋白質(zhì)樣品各自用一組雙標(biāo)記試劑中的一種來(lái)標(biāo)記，其中每種標(biāo)記試劑具有同位素和同量異序標(biāo)記物的獨(dú)特組合，和所述標(biāo)記試劑是生物素標(biāo)簽化的并且包含半胱氨酸反應(yīng)基團(tuán)。-在標(biāo)記之后，在這個(gè)階段所有的樣品已經(jīng)被集中，并作為一個(gè)反應(yīng)混合物來(lái)處理，其降低了由于對(duì)單獨(dú)樣品的操作而引起的變動(dòng)。-用胰蛋白酶來(lái)消化如此獲得的半胱氨酸標(biāo)記的樣品。-為了降低進(jìn)一步分析的肽的數(shù)量，利用(鏈酶)抗生物素蛋白親和技術(shù)通過(guò)生物素親和標(biāo)簽來(lái)只分離雙標(biāo)記的肽。在親和步驟之后，現(xiàn)在每個(gè)肽具有帶有同位素和同量異序標(biāo)記物組件的標(biāo)記物。因此，每個(gè)肽在經(jīng)由MS進(jìn)行分析時(shí)都是情報(bào)性的。所述方法進(jìn)一步包括步驟，其中-集中的肽通過(guò)例如液相層析來(lái)分離。在此，相同的、但是來(lái)源于盡4在來(lái)自不同樣品的4個(gè)肽上存在同;立素;同量異;標(biāo)記物組7牛的不同組合，但這將不會(huì)影響它們的洗脫，因?yàn)槊總€(gè)標(biāo)記物組中的不同標(biāo)記物具有相同的化學(xué)式或基本上相同的化學(xué)式。-通過(guò)MS來(lái)分析每個(gè)分離的肽級(jí)分，其應(yīng)當(dāng)產(chǎn)生兩個(gè)信號(hào)，具有不同的質(zhì)量，對(duì)應(yīng)于"輕，，或"重"同位素標(biāo)記物組件的存在。此后，具有不同同位素的每個(gè)肽被進(jìn)一步碎裂，借此從每個(gè)肽上存在的同量異序標(biāo)記物組件釋放報(bào)告基團(tuán)。報(bào)告物的相對(duì)數(shù)量表示用該報(bào)告物標(biāo)記的肽的相對(duì)數(shù)量。MS數(shù)據(jù)被進(jìn)一步用于測(cè)定肽的序列和鑒定其所來(lái)源的蛋白質(zhì)。在本文的實(shí)施例1中顯示了測(cè)定肽混合物中每種標(biāo)記的肽的相對(duì)數(shù)量的理論實(shí)例。上文說(shuō)明的本發(fā)明的方法，其利用具有2種不同同位素標(biāo)記物組件和4種不同的同量異序標(biāo)記物組件的組合的一組標(biāo)記試劑，容許復(fù)雜度最高達(dá)8的不同蛋白質(zhì)樣品的多通道化。當(dāng)使用另外的同量異序和/或同位素標(biāo)記物組件時(shí)，這容許提高的多通道化。通過(guò)不同的同位素標(biāo)記物組件的數(shù)量乘以不同的同量異序標(biāo)記物組件的數(shù)量的乘積來(lái)確定多通道性(multiplexicity)。以上描述的示范性的標(biāo)記方案適合于，例如，利用內(nèi)部肽測(cè)定在不同的樣品中單獨(dú)的蛋白質(zhì)之間表達(dá)水平的差異。取決于特定的應(yīng)用，設(shè)想了不同的可選擇的方案。以上列出的最常規(guī)的方法利用在肽的側(cè)鏈上的標(biāo)記。一般地，在側(cè)鏈上的標(biāo)記在半胱氨酸上進(jìn)行。然而如上所述，在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中約15%的蛋白質(zhì)沒(méi)有半胱氨酸，并且將不會(huì)被標(biāo)記。在蛋白質(zhì)中不存在半胱氨酸的概率隨著蛋白質(zhì)長(zhǎng)度降低而提高。對(duì)于在除了半胱氨酸之外的氨基酸側(cè)鏈上進(jìn)行標(biāo)記，這也是同樣成立的。蛋白質(zhì)越短，在氨基酸的側(cè)鏈上標(biāo)記的概率就越小。為了研究低Mr蛋白質(zhì)，其中蛋白質(zhì)/肽反應(yīng)基團(tuán)與是伯胺或羧基基團(tuán)的官能團(tuán)具有相互作用的本發(fā)明的雙標(biāo)記試劑和方法是特別令人感興趣的。實(shí)際上，這些基團(tuán)總是存在于每個(gè)蛋白質(zhì)中，分別在氨基末端和羧基末端。根據(jù)一個(gè)特定的實(shí)施方式，本發(fā)明的方法包括利用凝膠過(guò)濾層析或尺寸排阻方法(透析或超濾)將樣品分級(jí)為一個(gè)或多個(gè)低Mr級(jí)分的步驟。此后，樣品的低Mr蛋白質(zhì)級(jí)分被標(biāo)記而不進(jìn)行進(jìn)一步的蛋白質(zhì)裂解，因?yàn)檫@些蛋白質(zhì)樣品的有限大小使得它們直接適合于液相層析技術(shù)。在本發(fā)明的方法的這個(gè)實(shí)施方式中，不必使用親和標(biāo)簽，因?yàn)榈蚆r級(jí)分中的每個(gè)蛋白質(zhì)都浮皮標(biāo)記。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明方法的試劑被用于特異性地標(biāo)記蛋白質(zhì)的N-末端或C-末端肽。對(duì)于N-末端肽的分離，蛋白質(zhì)上的胺基團(tuán)(賴氨酸和N-末端)首先被修飾(例如，烷基化或乙酰化)。Asp和Glu的側(cè)鏈也^皮修飾。此后，蛋白質(zhì)被裂解(例如，用胰蛋白酶)，從而所有的肽，除了N-末端肽之外，都獲得了新的可用的反應(yīng)性胺基團(tuán)。這個(gè)基團(tuán)與蛋白質(zhì)反應(yīng)性親和標(biāo)簽(例如，NHS-生物素)反應(yīng)。此后，利用親和層析分離內(nèi)部和C-末端肽。現(xiàn)在其余的N-末端肽在它的C-末端與具有羧基反應(yīng)基團(tuán)的標(biāo)記試劑反應(yīng)。對(duì)于這種過(guò)程，不需要標(biāo)記試劑上的親和標(biāo)簽，因?yàn)楦信d趣的肽實(shí)際上早已經(jīng)預(yù)先被親和純化。仍然可以設(shè)想使用標(biāo)記試劑上的標(biāo)簽以及隨后的親和純化，來(lái)確保只有被適當(dāng)?shù)貥?biāo)記的肽經(jīng)歷進(jìn)一步的分析。在這種方法中，在裂解之前Asp和Glu的修飾避免了氨基酸側(cè)鏈的標(biāo)記，但是對(duì)于這種過(guò)程不是必需的?？梢詫?shí)施類似的方法用于C-末端肽的分離，其中羧基基團(tuán)被修飾，并且在裂解時(shí)產(chǎn)生的肽與親和標(biāo)簽反應(yīng)，所述親和標(biāo)簽帶有對(duì)羧基基團(tuán)具有反應(yīng)性的基團(tuán)。標(biāo)記試劑因而包含蛋白質(zhì)/肽反應(yīng)基團(tuán)，其對(duì)裂解時(shí)產(chǎn)生的新的N-末端是反應(yīng)性的。蛋白質(zhì)的N-末端或C-末端肽的標(biāo)記具有一些優(yōu)點(diǎn)。首先，樣品中的所有蛋白質(zhì)都被檢測(cè)，而在氨基酸的側(cè)鏈處的標(biāo)記將忽略那些其中不出現(xiàn)特定官能的蛋白質(zhì)。其次，甚至具有封閉的N-末端的蛋白質(zhì)也將被檢測(cè)。利用這種方法，所有的氨基末端都被封閉，或在體內(nèi)，或通過(guò)所述標(biāo)記方法。另一個(gè)根據(jù)本發(fā)明的方法的示例性標(biāo)記方案是被認(rèn)為特別適合于例如研究樣品中蛋白質(zhì)的蛋白水解加工(所謂的降解組學(xué))的方案。對(duì)于具有N-末端序列1-9的假定蛋白質(zhì)，差異化N-末端加工的實(shí)例在表1中示出，其中氨基酸4和9是精氨酸。當(dāng)不加工蛋白質(zhì)時(shí)，所有八種差異化標(biāo)記的N-末端肽在層析后作為一個(gè)級(jí)分洗脫，在MS中被分離到包含不同的同位素標(biāo)記物的不同級(jí)分中，并且在MS/MS中這些的每一個(gè)進(jìn)一步產(chǎn)生來(lái)自同量異序標(biāo)記物組件的一組不同的報(bào)告基團(tuán)。在以下表l中所列的情況中，加工的蛋白質(zhì)的N-末端肽的標(biāo)記產(chǎn)生4種不同的N-末端肽，其在高性能層析系統(tǒng)例如反相HPLC層析上將在不同的位置洗脫。因而，當(dāng)這些肽具有相同的同位素標(biāo)記物但是攜帶不同的同量異序標(biāo)記物時(shí)，這樣的肽級(jí)分甚至可以在MS上表現(xiàn)為單個(gè)峰。表1:差異化N-末端加工樣品序列力口工N-末端胰蛋白酶肽1123(4R)5678(9R)..無(wú)123(4R)2123(4R)5678(9R)..無(wú)123(4R)3123(4R)5678(9R)..123(4R)4123(4R)5678(9R)..123(4R)123(4R)5678(9R)..23(4R)6123(4R)5678(9R)..23(4R)7123(4R)5678(9R)..123(4R)5678(9R)8123(4R)5678(9R)..123(4R)5678(9R)42盡管如此對(duì)于每個(gè)樣品，不考慮加工程度，對(duì)于其所來(lái)源的蛋白質(zhì)的某些部分測(cè)定了N-末端肽。在本發(fā)明的一般方法中(即，其中官能團(tuán)的性質(zhì)不由樣品的性質(zhì)或期望的結(jié)果來(lái)決定)，在多肽上要被修飾的官能團(tuán)的選擇可以受不同因素的影響，例如-可用的標(biāo)記試劑上存在的蛋白質(zhì)反應(yīng)基團(tuán)的類型-可用的標(biāo)記試劑中親和標(biāo)簽的存在或不存在。本發(fā)明的方法可用于生物標(biāo)志物的檢測(cè)，例如，在疾病的情境中。取決于樣品，通過(guò)MS和MS/MS分析大量的肽。這種數(shù)量可以高達(dá)數(shù)百或甚至超過(guò)一千。對(duì)于它們中的許多而言，不考慮樣品的來(lái)源，相同的肽的差異化標(biāo)記的版本之間的相對(duì)數(shù)量將是恒定的。然而，對(duì)于與特定樣品所代表的疾病狀況相關(guān)的有限數(shù)量的肽，將觀察到顯著差異。這些肽本身的分析使得可以測(cè)定所述肽所來(lái)源的蛋白質(zhì)。當(dāng)對(duì)于來(lái)自同一蛋白質(zhì)的不同肽觀察到檢測(cè)出相同的表達(dá)水平時(shí)，這種分析將甚至更為可靠。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于蛋白質(zhì)樣品的多通道分析的設(shè)備(100),包括至少兩個(gè)樣品源(IOI)、具有相應(yīng)的標(biāo)記物源(104)的標(biāo)記單元(103)、分離單元(107)、質(zhì)譜儀單元(108)、以及控制電路和數(shù)據(jù)分析單元(109)。在特定的實(shí)施方式中，分離單元(107)包含兩個(gè)連續(xù)連接的分離系統(tǒng)(1107)和(2107),其中，所述第一分離系統(tǒng)(1107)是例如2D凝膠電泳系統(tǒng)或陽(yáng)離子交換層析系統(tǒng)和分離系統(tǒng)，所述第二分離系統(tǒng)(2107)—般是HPLC反相系統(tǒng)。質(zhì)譜儀元件108是MS/MS譜儀，其分離同位素形式并且其中一旦進(jìn)行CID,同量異序標(biāo)記物的報(bào)告基團(tuán)就被差異地測(cè)出，以及其中可以進(jìn)行從頭開(kāi)始的肽測(cè)序。MS/MS分析可以利用2個(gè)基礎(chǔ)上不同的儀器來(lái)進(jìn)行。在第一類型的儀器中，其中進(jìn)行MS/MS分析的離子阱是在其中進(jìn)行MS的同一離子阱，但是MS/MS是以時(shí)間進(jìn)行(阱被填滿，除了感興趣的離子之外所有離子被噴出，進(jìn)行CID，并掃描碎片離子)。第二類型的儀器，雜化儀器(三級(jí)四極、q-tof、ltq-ftms、ltq-orbitrap)以位置分開(kāi)MS/MS。例如親本選擇在第一質(zhì)量分析器中進(jìn)行，碎片在第二質(zhì)量分析器中掃描。所述設(shè)備可以進(jìn)一步包含許多可選擇的元件，例如樣品制備單元(102),其中，例如，發(fā)生樣品溶解(lysis)和免疫耗盡，蛋白質(zhì)裂解單元(105)和親和純化單元(106)來(lái)選擇性地分離帶有親和標(biāo)簽的標(biāo)記的多肽(例如，生物素-抗生物素蛋白親和純化)。用于加入本發(fā)明的設(shè)備中的適合的設(shè)備如質(zhì)譜儀單元和分離單元在以上已經(jīng)描述?？梢岳斫獾氖?，本發(fā)明的標(biāo)記方法可用于蛋白質(zhì)組學(xué)、蛋白質(zhì)表達(dá)分布(proteinexpressionprofiling)、生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)和革巴點(diǎn)發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明的方法的高度多通道性容許在一個(gè)單一實(shí)驗(yàn)中分析許多不同的條件。所述方法對(duì)于研究獲自不同疾病狀態(tài)的樣品的表達(dá)分布是特別有用的。被分析的樣品來(lái)自以下的一個(gè)或多個(gè)健康的人、患有良性病癥(benigndisorder)的人、患有惡性病癥(malignantdisorder)的人(緩和的或侵略性的)、來(lái)自響應(yīng)于或不響應(yīng)于治療的人、來(lái)自患有在身體的不同部分顯現(xiàn)的病癥的人、來(lái)自治療之前、期間和之后的人、來(lái)自接受不同的治療方法的人、和來(lái)自具有一種或多種病癥癥狀不然就健康的人。在本發(fā)明的情境中考慮的病癥包括細(xì)菌或病毒感染，免疫學(xué)病癥、心血管病癥和癌癥。體現(xiàn)本發(fā)明的系統(tǒng)和方法的其他方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是明顯的。要理解的是，雖然對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備已經(jīng)在此討論了優(yōu)選的實(shí)施方式、特定的結(jié)構(gòu)和構(gòu)造以及材料，但是可以進(jìn)行形式和細(xì)節(jié)上的各種變化或修改而不背離本發(fā)明的范圍和精神。實(shí)施例實(shí)施例1:利用同位素和同量異序標(biāo)記的單獨(dú)的肽的相對(duì)表達(dá)水平的測(cè)定利用包含同量異序和同位素標(biāo)記物組件的獨(dú)特組合的標(biāo)記試劑，通過(guò)不同的同量異序和同位素標(biāo)記組合，可以測(cè)定標(biāo)記的肽的混合物中單獨(dú)的肽的相對(duì)量。這通過(guò)以下理論實(shí)施例來(lái)例示。用同位素標(biāo)記物a或b以及同量異序標(biāo)記物A、B、C和D的組合根據(jù)表4中的方案標(biāo)記內(nèi)部肽8種樣品(l到8)。表4:混合物中標(biāo)記的多肽的相對(duì)濃度的測(cè)定肽12345678同位素標(biāo)記物aabbbb同量異序標(biāo)記物ABCDABCD集中的樣品laA,2aB,3aC,4aD,5bA,6bB，7bC,8bD第一分離MSlaA,2aB,3aC,4aD5bA,6bB,7bC,8bD比例同位素標(biāo)記物23第二分離MS/MSlaA2aB3aC4aD5bA,6bB,7bC,8bD比例同量異序標(biāo)記物19371865單獨(dú)的比例1/20x2/5=0.029/20x2/5=0.183/20x2/5=0.067/20x2/5=0.141/20x3/5=0.038/20x3/5=0.246/20x3/5=0.185/20x3/5=0.15標(biāo)準(zhǔn)化的19371.51297.5此后，所有的樣品被集中并經(jīng)歷層析，其中不考慮肽上的特定同位素/同量異序標(biāo)記物組件組合，標(biāo)記的肽的行為方式相同。肽的差異化標(biāo)記的版本作為一個(gè)級(jí)分洗脫。將級(jí)分施加到MS上，其中它將分離為具有重同位素的級(jí)分和具有輕同位素的級(jí)分。對(duì)于這兩個(gè)級(jí)分，可以計(jì)算相對(duì)量。在表4中，測(cè)量到比具有a同位素的肽多50%的具有b同位素的肽。隨后，具有不同的同位素標(biāo)記物的兩個(gè)肽級(jí)分被碎裂，其容許測(cè)定具有給定的同位素標(biāo)記物的每個(gè)肽級(jí)分之內(nèi)同量異序肽的相對(duì)比例(表4中給出的理論比例)。4權(quán)利要求1.用于多肽的質(zhì)譜分析的一組標(biāo)記試劑，每種標(biāo)記試劑包含-異重標(biāo)記物組件，-蛋白質(zhì)/肽反應(yīng)基團(tuán)，和-包含報(bào)告基團(tuán)(RP)和平衡基團(tuán)(BG)的同量異序標(biāo)記物組件。2.根據(jù)權(quán)利要求1的一組標(biāo)記試劑，其中所述異重標(biāo)記物組件是同位素標(biāo)記物組件。3.根據(jù)權(quán)利要求1的一組標(biāo)記試劑，其中所述異重標(biāo)記物組件被包含在所述同量異序標(biāo)記物的所述報(bào)告基團(tuán)和/或所述平衡基團(tuán)之內(nèi)。4.根據(jù)權(quán)利要求1的一組標(biāo)記試劑，其中所述蛋白質(zhì)/肽反應(yīng)基團(tuán)與蛋白質(zhì)或多肽中的半胱氨酸反應(yīng)。5.根據(jù)權(quán)利要求1的一組標(biāo)記試劑，其中每種標(biāo)記試劑進(jìn)一步包含親和標(biāo)簽。6.根據(jù)權(quán)利要求5的一組標(biāo)記試劑，其中所述親和標(biāo)簽是可裂解的。7.根據(jù)權(quán)利要求5的試劑，其中所述親和標(biāo)簽是生物素。8.—種用于同時(shí)分析不同的樣品中包含官能團(tuán)的一種或多種多肽的存在的方法，其包括步驟a)標(biāo)記步驟，其中每種樣品被一組差異化雙標(biāo)記試劑中的一種標(biāo)記，所述標(biāo)記是通過(guò)容許所述標(biāo)記試劑與所述樣品中一種或多種多肽或從其產(chǎn)生的肽的官能團(tuán)反應(yīng)而進(jìn)行的；其中所述一組差異化雙標(biāo)記試劑具有相同的或基本上相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并且包含異重和同量異序標(biāo)記物組件，和其中每種標(biāo)記試劑包含異重和同量異序標(biāo)記物組件的獨(dú)特組合，b)集中所述不同的樣品來(lái)獲得多肽樣品混合物，c)/人所述多肽樣品混合物中選才,性地分離所述雙標(biāo)記的多肽或肽；和d)通過(guò)質(zhì)譜法分析所述分離的標(biāo)記的多肽或肽的相對(duì)出現(xiàn)。9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述異重標(biāo)記組件是同位素標(biāo)記組件。10.才艮據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述一組標(biāo)記試劑的標(biāo)記試劑包含親和標(biāo)簽。11.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其進(jìn)一步包括在步驟(a)之后將所述蛋白質(zhì)裂解成肽的步驟。12.根據(jù)權(quán)利要求ll的方法，其中所述裂解用胰蛋白酶進(jìn)行。13.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中在步驟c)中，根據(jù)在所述標(biāo)記的多肽或肽上存在的親和標(biāo)簽選擇性地分離所述多肽或肽。14.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述官能團(tuán)是硫醇。15.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述多肽或從其產(chǎn)生的肽的官能團(tuán)作為另一個(gè)官能團(tuán)的修飾結(jié)果存在。16.權(quán)利要求8的方法，其中步驟(c)包括通過(guò)電泳或?qū)游鰪乃黾械亩嚯闹蟹蛛x標(biāo)記的多肽或肽級(jí)分的步驟。17.權(quán)利要求8的方法，其中步驟(d)包括用MS測(cè)定步驟(c)中獲得的所述分離的標(biāo)記的多肽或肽級(jí)分中不同質(zhì)量的相對(duì)數(shù)量的步驟。18.權(quán)利要求17的方法，其中步驟(d)進(jìn)一步包括使所述分離的標(biāo)記的多肽級(jí)分經(jīng)歷碰撞誘導(dǎo)的解離(CID)并測(cè)定其中不同的同量異序標(biāo)記的多肽的相對(duì)數(shù)量的步驟。19.權(quán)利要求18的方法，其中不同的同量異序標(biāo)記的多肽的相對(duì)數(shù)量通過(guò)測(cè)定CID之后從所述同量異序標(biāo)記物釋放的報(bào)告基團(tuán)的相對(duì)數(shù)量來(lái)測(cè)定。20.權(quán)利要求19的方法，進(jìn)一步包括測(cè)定所述多肽的序列的步驟。21.—種用根據(jù)權(quán)利要求1的具有同量異序和異重標(biāo)記物組件的標(biāo)記試劑標(biāo)記多肽樣品的方法，包括使所述標(biāo)記試劑與所述樣品中所述多肽上的官能團(tuán)反應(yīng)的步驟。22.根據(jù)權(quán)利要求8到21的任一項(xiàng)的方法用于鑒定蛋白質(zhì)的用途，所述蛋白質(zhì)在對(duì)照蛋白質(zhì)樣品和一種或多種實(shí)-瞼或疾病蛋白質(zhì)樣品之間被差異化表達(dá)。23.—種多肽或肽的混合物，所述多肽或肽各自包含含有同位素標(biāo)記物組件和同量異序標(biāo)記物組件的標(biāo)記物，所述標(biāo)記物已經(jīng)通過(guò)所述多肽或肽中的官能團(tuán)與所述多肽或肽連接。24.權(quán)利要求23的多肽或肽的混合物，其中所述官能團(tuán)選自由以下構(gòu)成的組誦N國(guó)末端或賴氨酸上的伯胺，-天冬氨酸、谷氨酸或C-末端上的羧基基團(tuán)，和-半胱氨酸上的硫醇基團(tuán)。25.根據(jù)權(quán)利要求23的肽的混合物，包含是蛋白質(zhì)的胰蛋白酶肽的肽。26.根據(jù)權(quán)利要求23的混合物，其中所述多肽或肽上存在的不同標(biāo)記物的數(shù)目至少是4。27.—種包含四種或更多種標(biāo)記試劑的試劑盒，每種標(biāo)記試劑包含同量異序標(biāo)記物組件、異重標(biāo)記物組件和蛋白質(zhì)/肽反應(yīng)基團(tuán)，其中所述試劑盒中每種標(biāo)記試劑具有相同的或基本上相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并且其中所述試劑盒內(nèi)每種標(biāo)記試劑包括所述異重和所述同量異序標(biāo)記物組件的獨(dú)特組合。28.根據(jù)權(quán)利要求27的試劑盒，其中所述標(biāo)記試劑包含親和標(biāo)簽。29.—種測(cè)定單獨(dú)的多肽或肽的集中混合物中具有相同氨基酸序列的單獨(dú)的多肽或肽的相對(duì)數(shù)量的方法，其中在集中之前，每種單獨(dú)的多肽或肽已經(jīng)用一組差異化雙標(biāo)記試劑中的一種進(jìn)行標(biāo)記，其中所述一組差異化雙標(biāo)記試劑具有相同的或基本上相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)并帶有同位素和同量異序標(biāo)記物組件，每種標(biāo)記試劑包含不同的同位素和同量異序標(biāo)記物組件的獨(dú)特組合，包括步驟a)任選地，通過(guò)液相色譜分離所述多肽或肽，以便獲得包含所述具有相同氨基酸序列的單獨(dú)的多肽或肽的分離的級(jí)分，b)通過(guò)第一MS將所述集中的混合物或步驟(a)中獲得的分離的多肽級(jí)分中的肽或多肽分離成具有不同質(zhì)量的進(jìn)一步的多肽或肽的級(jí)分，并測(cè)定具有不同質(zhì)量的每種肽級(jí)分的相對(duì)數(shù)量，c)使步驟(b)中獲得的所述肽級(jí)分在一定條件下進(jìn)行第二MS，在所述條件下其中所述單獨(dú)的多肽的同量異序標(biāo)記物組件被碎裂，并測(cè)定所述肽級(jí)分內(nèi)單獨(dú)的肽的每種碎裂的同量異序標(biāo)記物組件的數(shù)量，d)從步驟(c)中測(cè)定的每種同量異序標(biāo)記物組件的數(shù)量，確定步驟(b)中獲得的肽級(jí)分內(nèi)單獨(dú)的肽的相對(duì)數(shù)量，e)從步驟(b)中測(cè)定的具有不同質(zhì)量的每種級(jí)分的相對(duì)數(shù)量以及從步驟(d)中確定的單獨(dú)的肽的相對(duì)數(shù)量，計(jì)算所述集中的混合物中具有相同氨基酸序列的每種單獨(dú)的多肽的相對(duì)數(shù)量。30.—種用于蛋白質(zhì)樣品的多通道標(biāo)記和分析的設(shè)備(100)，包括至少兩個(gè)樣品源(101)、標(biāo)記單元(103)和相應(yīng)的各自包含標(biāo)記試劑的標(biāo)記物源(104)，所述標(biāo)記試劑包含-異重標(biāo)記物組件，-蛋白質(zhì)/肽反應(yīng)基團(tuán)，和-包含報(bào)告基團(tuán)(RP)和平衡基團(tuán)(BG)的同量異序標(biāo)記物組件，以及進(jìn)一步包含分離單元(107),質(zhì)譜儀單元(108)和數(shù)據(jù)分析單元間。31.根據(jù)權(quán)利要求30的設(shè)備，進(jìn)一步包括選自由樣品制備單元(102)、蛋白質(zhì)裂解單元(105)和親和純化單元(106)構(gòu)成的組中的一種或多種元件。全文摘要本發(fā)明描述了適合于差異化標(biāo)記不同的蛋白質(zhì)樣品的、具有同位素和同量異序標(biāo)記物組件的雙標(biāo)記試劑。在單獨(dú)的蛋白質(zhì)樣品的標(biāo)記之后，集中所有樣品。來(lái)自集中的樣品的肽被分離，并通過(guò)質(zhì)譜法分析，用于測(cè)定每種差異化雙標(biāo)記的多肽的相對(duì)濃度。文檔編號(hào)G01N33/68GK101542291SQ200780040967公開(kāi)日2009年9月23日申請(qǐng)日期2007年10月23日優(yōu)先權(quán)日2006年11月2日發(fā)明者R·霍夫曼申請(qǐng)人:皇家飛利浦電子股份有限公司