專利名稱：被分析物的電化學(xué)分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及被分析物的電化學(xué)檢測(cè)方法以及該方法中所使用的感應(yīng)電極。
用生物傳感器對(duì)生物流體中的被分析物如各種抗原、抗體、DNA分子等的電化學(xué)分析，是最有前途和吸引力的儀器分析方法之一。對(duì)該領(lǐng)域持續(xù)不減的興趣和大量的出版物是由于該方法有許多基本優(yōu)點(diǎn)，即高靈敏度、簡(jiǎn)便，以及采用相對(duì)簡(jiǎn)單而廉價(jià)的設(shè)備。
本領(lǐng)域眾所周知，生物傳感器裝置的設(shè)計(jì)是基于采用導(dǎo)電聚合物膜，如聚吡咯或聚噻吩，這種膜將與被分析物的存在相關(guān)的化學(xué)信號(hào)變成可測(cè)量的電信號(hào)(參見[1]和[2])。
EP-A-0193154描述了一種電化學(xué)檢測(cè)使用的電極，該電極的表面被涂以聚吡咯或聚噻吩膜。與待測(cè)的被分析物互補(bǔ)的生物受體被吸附到聚合后的導(dǎo)電聚合物膜表面上。WO 8911649描述了另一種生產(chǎn)電化學(xué)分析中所用的聚合物電極的方法。在該方法中，含有所需結(jié)合特異性的生物受體分子在聚合期間被引入導(dǎo)電聚合物膜中。采用EPA-0193154和WO 89/11649中所描述的方法，對(duì)于每個(gè)給定的分析，必須合成不同的感應(yīng)電極，在該電極上含有能夠特異性結(jié)合欲測(cè)被分析物的固定化生物受體。
PCT申請(qǐng)人公開的申請(qǐng)PCT/GB98/00548描述了一種電化學(xué)分析的電勢(shì)測(cè)定方法，該方法使用的電化學(xué)感應(yīng)電極包括金屬電勢(shì)電極又覆以包含與受測(cè)被分析物特異性結(jié)合的固定化生物受體分子的導(dǎo)電聚合物層。該被分析物的存在是通過(guò)被分析物結(jié)合至該固定化生物受體時(shí)，該感應(yīng)電極表面電荷的變化而顯示出來(lái)的。被分析物的檢測(cè)是通過(guò)下列過(guò)程進(jìn)行的首先安裝包括感應(yīng)電極和參比電極的電化學(xué)電池，將這兩個(gè)電極通過(guò)浸于固定pH值的工作緩沖溶液中的測(cè)量裝置相連。首先記錄感應(yīng)電極和參比電極之間電勢(shì)差的基值，然后將感應(yīng)電極和參比電極與包含被分析物、具有較高離子強(qiáng)度但與工作緩沖溶液相同pH值的溶液相接觸，并再次記錄電勢(shì)差。最后將該感應(yīng)電極和參比電極轉(zhuǎn)至干凈的工作緩沖溶液中，并再次記錄電勢(shì)。在恒定的pH值下，由于被分析物存在，離子強(qiáng)度變化引起的感應(yīng)電極和參比電極之間電勢(shì)差的變化與被分析物的濃度成正比。
如參考文獻(xiàn)[13、14、15、16]和[3]中所示，具有含生物受體聚合物膜的感應(yīng)電極對(duì)周圍溶液離子強(qiáng)度的階段變化(所謂“離子階段”步驟)的響應(yīng)(電勢(shì)變化的大小和比率)，在很大程度上是由聚合物膜上的電荷決定的。除構(gòu)成膜的材料之外，該聚合物膜電荷是由結(jié)合于其上的受體分子的電荷決定的。如果受體電荷隨其與特異性被分析物的親合性反應(yīng)而變化，由于在感應(yīng)電極與測(cè)試流體接觸之后進(jìn)行的離子階段步驟，感應(yīng)電極的響應(yīng)也發(fā)生變化。應(yīng)當(dāng)注意，由于大多數(shù)被分析物的兩性性質(zhì)，受體電荷取決于溶液的pH值，所以在離子階段步驟中保持溶液的pH值恒定是非常重要的。
因此在前述方法中，基于感應(yīng)電極對(duì)該感應(yīng)電極與測(cè)試流體接觸前后進(jìn)行的離子階段過(guò)程響應(yīng)的變化的測(cè)定，有可能確定與結(jié)合于感應(yīng)電極的受體特異性結(jié)合的被分析物在測(cè)試流體中的存在。在理想的情況下，膜中受體電荷的變化以及由此感應(yīng)電極響應(yīng)的變化直接與結(jié)合于該感應(yīng)電極的受體特異性結(jié)合的被分析物在測(cè)試流體中的濃度成正比。然而，在真實(shí)的條件下，相同被分析物的電荷能夠顯著地變化，產(chǎn)生不一致的定量結(jié)果。此外，親合性反應(yīng)并不總是伴隨著受體電荷變化。這在測(cè)試小的或非荷電的抗原時(shí)經(jīng)常發(fā)生[14]。
總之，以前基于使用導(dǎo)電聚合物電極的電化學(xué)檢測(cè)方法的缺點(diǎn)包括復(fù)雜性，感應(yīng)電極制造工藝工業(yè)化受限制，所得的感應(yīng)電極特性的不一致性，無(wú)性能損失存放感應(yīng)電極的能力受限制。此外，前述的電化學(xué)檢測(cè)規(guī)程，特別是在PCT/GB98/00548中所述方法，限制了對(duì)小分子、非荷電的分子或其等電點(diǎn)接近于固定在感應(yīng)電極表面上受體的等電點(diǎn)的分子的檢測(cè)。
本發(fā)明提供一種分析樣品中被分析物的電化學(xué)分析方法，該方法很大程度上沒(méi)有上述方法所固有的缺點(diǎn)，由于能夠分析小分子和非荷電的分子，拓寬了其適用范圍，提供嚴(yán)格的定量結(jié)果，使該電極制造工藝更適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)方法，增加分析效率，改善重現(xiàn)性，因此提高了所得結(jié)果的可靠性。
因此，本發(fā)明的第一方面是提供一種用于電化學(xué)檢測(cè)被分析物方法的感應(yīng)電極，該感應(yīng)電極包括一種涂有含銜接分子的導(dǎo)電聚合物的導(dǎo)電電極，這些銜接分子選自抗生物素蛋白質(zhì)、抗生蛋白鏈菌素、抗-FITC抗體和一種能夠結(jié)合到至少一類被固定于其中的或被吸附于其上的受體分子的分子。
使用感應(yīng)電極的電化學(xué)分析方法所固有的主要問(wèn)題之一是長(zhǎng)時(shí)間保持固定于感應(yīng)電極上受體的天然性質(zhì)。該領(lǐng)域已經(jīng)實(shí)現(xiàn)的相關(guān)進(jìn)展僅僅是有限的酶感應(yīng)電極[7]。對(duì)大多數(shù)在文獻(xiàn)[8、9、10]中使用提純受體的電化學(xué)感應(yīng)電極，根本沒(méi)有說(shuō)明其有效的保存期限。保持固定化受體之天然性質(zhì)在將抗體用作受體時(shí)特別關(guān)鍵，這可歸因于它們固有的高度構(gòu)型可變性。
相反，眾所周知，當(dāng)將抗體及其他生物分子以濃溶液形式保存時(shí)，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)久時(shí)間仍保持其有用的性質(zhì)；所以，在使用前乃至在電化學(xué)檢測(cè)過(guò)程中，可能通過(guò)受體的快速固定來(lái)解決在無(wú)損工作特性的情況下延期儲(chǔ)存感應(yīng)電極的問(wèn)題。
在本公開發(fā)明中，該問(wèn)題是通過(guò)利用被固定在或被吸附至導(dǎo)電聚合物上的所謂銜接分子來(lái)解決的。銜接分子的作用是將對(duì)受檢被分析物特異性的受體分子連接至感應(yīng)電極的表面上。正如將在下面所討論的那樣，借助于使用銜接分子，有可能在感應(yīng)電極生產(chǎn)中暫時(shí)分離工序。因此，下面方法是可行的，制造出含有被固定的/被吸附的銜接分子的電極，將其長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存，然后在電化學(xué)分析之前或者在電化學(xué)分析期間將特異性受體固定在該電極上。選擇適當(dāng)?shù)你暯臃肿樱部赡苤圃彀軌蚪Y(jié)合整個(gè)系列不同受體分子的銜接分子的通用感應(yīng)電極。僅僅通過(guò)將適當(dāng)特異性的受體結(jié)合到銜接分子上，就可在賦予“通用的”感應(yīng)電極對(duì)受測(cè)被分析物的特異性。所以在電沉積過(guò)程中，不再需要引入所需的特異性的受體。
抗生物素蛋白和抗生蛋白鏈菌素優(yōu)選用作銜接分子?？股锼氐鞍踪|(zhì)，一種從生雞蛋中獲得的蛋白質(zhì)，是由四種同樣的肽亞單位組成，其中每一種都具有一個(gè)能夠與輔助因子生物素分子結(jié)合的位點(diǎn)。生物素(維生素H)是一種存在每種活細(xì)胞中的極微量輔酶，并被發(fā)現(xiàn)主要結(jié)合在蛋白質(zhì)或多肽上。生物素分子進(jìn)入與抗生物素蛋白質(zhì)或抗生蛋白鏈菌素(從某些細(xì)菌溫育物(例如鏈霉菌屬aviation)中分離的一種抗生物素蛋白質(zhì))的結(jié)合反應(yīng)，并在該反應(yīng)期間形成事實(shí)上非解離的“生物素-抗生物素蛋白質(zhì)”(絡(luò)合物常數(shù)約10-15mol/l)的能力是眾所周知的[11、12]。
由本公開發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行的調(diào)查表明，被固定在導(dǎo)電聚合物膜中抗生物素蛋白質(zhì)和抗生蛋白鏈菌素在延長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)保持其原來(lái)的天然性質(zhì)(至少一年并可能更長(zhǎng))，并在此期間一直能夠用于與生物素綴合受體連接。生物素與許多不同分子綴合的技術(shù)在本領(lǐng)域是眾所周知的。因此，僅僅通過(guò)結(jié)合適當(dāng)?shù)纳锼鼗氖荏w，就能夠制造出對(duì)給定的被分析物特異性的含有固定化抗生物素蛋白質(zhì)或抗生蛋白鏈菌素的感應(yīng)電極。
雖然抗生物素蛋白質(zhì)和抗生蛋白鏈菌素是優(yōu)選的銜接分子，但使用替代性銜接分子，特別是那些能夠與至少一類受體分子特異性結(jié)合的分子屬于在本發(fā)明的范疇。替代性銜接分子中包括蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G和外源凝集素。這些分子均可結(jié)合至少一類受體分子，即表明它們能特異性結(jié)合位于一組受體分子中每個(gè)成員的共同結(jié)合位點(diǎn)，其結(jié)合相互作用的離解常數(shù)為小于10-8mol/l。例如，蛋白質(zhì)A(一種42kD的多肽，分離于金黃色葡萄球菌或通過(guò)DNA重組技術(shù)得到)可在Fc區(qū)域結(jié)合免疫球蛋白，特別是多種哺乳動(dòng)物的IgG分子；而且蛋白質(zhì)G(IgG的Ⅲ型Fc受體，參見Bjorck,L.和Kronvall,G.,J.Immunol.,(1984)133,969)也可在Fc區(qū)域結(jié)合多種哺乳動(dòng)物的IgG。外源凝集素是結(jié)合在糖蛋白或碳水化合物的糖部分的蛋白質(zhì)。每種類型的外源凝集素對(duì)一定的糖部分具有特異性，因此將能結(jié)合多種帶有恰當(dāng)?shù)奶遣糠值奶堑鞍谆驈?fù)合碳水化合物。
在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗-FITC抗體能被用作銜接分子。在這一實(shí)施方案中，針對(duì)被分析物的感應(yīng)電極的特異性能夠通過(guò)結(jié)合具有適度特異性的抗FITC抗體標(biāo)記的受體而確定。
在導(dǎo)電聚合物膜中或其上使用銜接分子，在與感應(yīng)電極接觸時(shí)通過(guò)減少測(cè)試溶液中組分的非特異性的相互作用，也可顯著地改進(jìn)在電化學(xué)中所得分析的結(jié)果的可靠性，這與銜接分子阻滯該導(dǎo)電聚合物的自由表面有關(guān)。銜接分子的使用同樣增加該感應(yīng)電極制造工藝的技術(shù)效率，例如消除了對(duì)另外的表面阻滯過(guò)程的需要。
本發(fā)明的電勢(shì)測(cè)定感應(yīng)電極制造成本低，因此為了方便起見，能夠以一次性使用的形式生產(chǎn)，意指被用來(lái)進(jìn)行單個(gè)電化學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)或一系列檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，然后丟棄。本發(fā)明更進(jìn)一步提供一種包括電化學(xué)檢測(cè)需要的感應(yīng)電極和參比電極的電極裝置。如以下將討論的那樣，合適的參比電板包括銀/氯化銀和甘汞電極。該電極裝置能夠方便地作為一種一次性使用的部件提供，其包括一種裝有連接感應(yīng)電極和參比電極電觸點(diǎn)的、由廉價(jià)材料制造的容器或支架。
本發(fā)明的感應(yīng)電極可被用于各類的電化學(xué)分析過(guò)程，包括(而不限定于)對(duì)抗原的雙抗體夾層結(jié)構(gòu)分析法、對(duì)抗體的雙抗原夾層結(jié)構(gòu)分析法、對(duì)抗原的競(jìng)爭(zhēng)性分析法、對(duì)抗體的競(jìng)爭(zhēng)性分析法、測(cè)定人體抗體血清的血清分析法(如使用標(biāo)記的抗人類抗體的風(fēng)疹I(lǐng)gG抗體)和IgM分析法(如IgM風(fēng)疹抗體)。
因此，本發(fā)明的第二方面是提供一種用于電化學(xué)檢測(cè)被分析物方法的感應(yīng)電極的制備方法，該感應(yīng)電極包括一種用含有銜接分子的導(dǎo)電聚合物涂制的導(dǎo)電電極，這些銜接分子選自抗生物素蛋白質(zhì)、抗生蛋白鏈菌素和一種能夠與至少一類被固定于其中的受體分子結(jié)合的分子，該方法包括下列步驟(a)制備一種含有導(dǎo)電聚合物單體和銜接分子的電化學(xué)聚合溶液，(b)將欲涂制的電極浸入該電化學(xué)聚合溶液中，和(c)在該電極和該電化學(xué)聚合溶液之間施加一種循環(huán)電勢(shì)，通過(guò)該溶液聚合物的電化學(xué)合成來(lái)涂制該電極，所述被施加的循環(huán)電勢(shì)為至少一全循環(huán)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種用于樣品中被分析物的電化學(xué)檢測(cè)方法之感應(yīng)電極的制備方法，該感應(yīng)電極包括一種涂有含銜接分子的導(dǎo)電聚合物的導(dǎo)電電極，這些銜接分子選自抗生物素蛋白質(zhì)、抗生蛋白鏈菌素和一種能夠與至少一類被吸附于其上的受體結(jié)合的分子。該方法包括下列步驟(a)制備一種含有導(dǎo)電聚合物單體的電化學(xué)聚合溶液，(b)將欲涂制的電極浸入在該電化學(xué)聚合溶液中，(c)在該電極和該電化學(xué)聚合溶液之間施加一種循環(huán)電勢(shì)，通過(guò)該溶液的聚合物電化學(xué)合成涂制該電極，所述被施加的循環(huán)電勢(shì)為至少一全循環(huán)；和(d)將該涂制過(guò)的電極與一種含有銜接分子的溶液接觸，以使該銜接分子被吸附在該電極的導(dǎo)電聚合物涂層上。
按照本發(fā)明的方法，通過(guò)單體溶液的電化學(xué)合成，一種導(dǎo)電聚合物膜被沉積在導(dǎo)電的電極表面上。該導(dǎo)電電極優(yōu)選是一種具有金屬或準(zhǔn)金屬導(dǎo)電性，在水介質(zhì)中穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)電勢(shì)電極。正如將在本文實(shí)施例中說(shuō)明的那樣，導(dǎo)電聚合物膜電沉積的實(shí)施是通過(guò)使用一種包含單體、極性溶劑和本底電解質(zhì)的溶液中進(jìn)行的。吡咯、噻吩、呋喃或苯胺為優(yōu)選單體。去離子水優(yōu)先作為極性溶劑使用。
如所屬技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員眾所周知的那樣，為了改變?cè)摼酆衔锏慕Y(jié)構(gòu)和/或傳導(dǎo)性質(zhì)，該導(dǎo)電聚合物往往在電化學(xué)合成階段被摻雜。通常摻雜的陰離子是在聚合步驟引入硫酸根(SO42-)，以中和該聚合物骨架上的正電荷。硫酸根不易于由離子交換釋放，因此有助于保持該聚合物的結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明中，優(yōu)選使用具有與聚合物周圍溶液最大離子交換容量的摻雜陰離子，以增加電極的靈敏性。當(dāng)制備電化學(xué)溶液時(shí)，通過(guò)將一種其陰離子具有大離子半徑的鹽用作本底電解質(zhì)即可達(dá)到此目的。具有大離子半徑的合適鹽類包括十二烷基硫酸鈉和葡聚糖硫酸鹽。這些電化學(xué)聚合溶液中鹽類的濃度按測(cè)試類型在0.005-0.05M范圍內(nèi)變化。
如同許多論文中報(bào)道的那樣[4、5]，對(duì)于浸于溶液中的導(dǎo)電聚合物，與其發(fā)生離子交換的容易程度和與其達(dá)到離子平衡的快速性基本上取決于在電沉積階段引入的抗-離子的大小抗-離子的離子半徑越大，越易于發(fā)生離子交換反應(yīng)，越快達(dá)到平衡狀態(tài)。這與“金屬電極-導(dǎo)電聚合物”體系應(yīng)答溶液中離子組分改變時(shí)電勢(shì)變化的數(shù)值和速率直接關(guān)聯(lián)[6]。
該導(dǎo)電聚合物膜完成雙重職能，既結(jié)合感應(yīng)電極表面的受體，又表示該感應(yīng)電極對(duì)緩沖溶液中成分變化的敏感性。特別是影響導(dǎo)電聚合物氧化還原組成的緩沖溶液組成的變化導(dǎo)致感應(yīng)電極的穩(wěn)態(tài)電勢(shì)發(fā)生相應(yīng)的變化。
銜接分子可以通過(guò)在電化學(xué)合成階段將銜接分子添加至電化學(xué)聚合溶液中而被固定在導(dǎo)電聚合物膜上，或者在電化學(xué)聚合之后被吸附在導(dǎo)電聚合物膜的表面。在前一種情況下，銜接分子的溶液可在淀積過(guò)程之前被迅速加到電沉積溶液中。如果配制的溶液的存儲(chǔ)時(shí)間不超過(guò)30分鐘，沉積過(guò)程運(yùn)行最佳。根據(jù)測(cè)試的特定類型，在該溶液中銜接分子的濃度可在5.00-100.00μg/ml的范圍內(nèi)變化。自包含銜接分子的溶液中電沉積導(dǎo)電聚合物的過(guò)程在本文包括的實(shí)施例中描述。在完成電沉積步驟時(shí)，所得的感應(yīng)電極可用去離子水和0.01M磷酸鹽緩沖溶液依次沖洗，根據(jù)測(cè)試的類型，可將其放置在一種包含微生物生長(zhǎng)抑制劑或殺菌劑(如慶大霉素)的特定存儲(chǔ)緩沖溶液中，或在室溫下的無(wú)塵空氣中干燥。
在完成電沉積步驟之后，可使用下列規(guī)程(雖然在此陳述該規(guī)程，但本發(fā)明決不局限于應(yīng)用該特定的方法)將銜接分子吸附到膜上，首先將感應(yīng)電極用去離子水沖洗，并放入新制備的0.02M碳酸鹽緩沖液中，將它在其中保持15-60分鐘。然后通過(guò)將感應(yīng)電極浸入一個(gè)充滿新制備的含有1.00-50.00μg/ml濃度銜接分子的0.02M碳酸鹽緩沖溶液的容器中，或通過(guò)在感應(yīng)電極的表面上滴一滴該溶液，使該感應(yīng)電極與該溶液相接觸。該感應(yīng)電極一般在+4℃與銜接分子溶液共同溫育1-24小時(shí)。在溫育之后，將該感應(yīng)電極用去離子水沖洗，并在0.01M的磷酸鹽緩沖溶液中放置1-4小時(shí)。根據(jù)測(cè)試的類型，該感應(yīng)電極既可放置在含有微生物生長(zhǎng)抑制劑或殺菌劑的特定存儲(chǔ)緩沖溶液中，也可在室溫下的無(wú)塵空氣中干燥。
當(dāng)銜接分子是抗生物素蛋白質(zhì)或抗生蛋白鏈菌素時(shí)，本發(fā)明上述的用于生產(chǎn)感應(yīng)電極的制備方法可任選進(jìn)一步將涂制的電極與一種含有與生物素綴合的特異性受體溶液接觸，以使所述生物素化的受體通過(guò)生物素/抗生物素蛋白質(zhì)或生物素/抗生蛋白鏈菌素結(jié)合相互作用結(jié)合到被固定于或被吸附至電極的導(dǎo)電聚合物涂層上的抗生物素蛋白質(zhì)或抗生蛋白鏈菌素分子上。
由本發(fā)明的作者和他人[12]進(jìn)行的研究表明，在最佳條件下，與它們的非生物素化的等價(jià)物相比，生物素化的受體并不改變其性質(zhì)(親合性、存儲(chǔ)質(zhì)量等等)。
生物素與相應(yīng)受體的綴合，作為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的生物素化的方法，可以應(yīng)用已知的步驟之一進(jìn)行，如[12]中所述。此外，許多制備好的特異性不同的生物素化受體有市售產(chǎn)品，例如由美國(guó)Calbiochem-Novabiochem制備的抗人IgG或抗人IgA羊生物素標(biāo)記的抗體。
應(yīng)用生物素化受體的重要的優(yōu)點(diǎn)之一是通過(guò)結(jié)合于感應(yīng)電極上的抗生物素蛋白質(zhì)或抗生蛋白鏈菌素與相應(yīng)生物素化受體之間所產(chǎn)生的反應(yīng)，能夠改變感應(yīng)電極的特異性。如前所述，與抗生物素蛋白質(zhì)/抗生蛋白鏈菌素所結(jié)合的感應(yīng)電極實(shí)際上是一種“通用的感應(yīng)電極”，對(duì)受檢目的分子的特異性是通過(guò)結(jié)合適當(dāng)?shù)纳锼鼗荏w所確定的。為了制備含對(duì)受檢被分析物有特異性的抗生物素蛋白質(zhì)或抗生蛋白鏈菌素的感應(yīng)電極，需要完成結(jié)合在感應(yīng)電極上的抗生物素蛋白質(zhì)或抗生蛋白鏈菌素與生物素化受體之間的反應(yīng)，為此，感應(yīng)電極與后者的溶液在室溫下接觸，既可將該感應(yīng)電極浸入一個(gè)充滿該溶液的容器中，也可將該溶液滴在感應(yīng)電極表面(溶液中生物素化受體的濃度通常為0.1-100μg/ml；接觸時(shí)間3-15分鐘)。
這些受體分子可以是任何一種能夠特異性結(jié)合另一種分子(被分析物)的分子。適當(dāng)類型的受體包括單克隆和多克隆抗體、嵌和體抗體、保留能夠識(shí)別抗原的抗體片段(如Fab和Fab2碎片)、重組蛋白質(zhì)和其片段、合成肽、抗原、單股DNA、RNA或者PNA分子、激素、激素受體、酶、化合物等。
如上所述，在本領(lǐng)域已知的使用電勢(shì)感應(yīng)電極的電化學(xué)檢測(cè)方法在檢測(cè)小的和非荷電的抗原時(shí)，其用途受到限制。為了克服這個(gè)問(wèn)題，并為了得到嚴(yán)格定量的結(jié)果，可以使用與電荷標(biāo)記物綴合的次級(jí)受體或者競(jìng)爭(zhēng)分子。
所以，本發(fā)明更進(jìn)一步地提供一種檢測(cè)樣品中被分析物的電化學(xué)檢測(cè)方法，該方法包括下列步驟(a)提供一種含有導(dǎo)電聚合物涂層的感應(yīng)電極，該涂層含有被固定于其中或者被吸附于其上的特異性結(jié)合樣品中目的待測(cè)被分析物的受體；(b)將感應(yīng)電極浸入一種含有樣品的試液中，以使所述目的被分析物與所述被固定的或者被吸附的受體結(jié)合；(c)將該感應(yīng)電極與一種含有次級(jí)受體的溶液接觸，該次級(jí)受體能夠與該被分析物在空間上不同于與被固定或者被吸附的受體的結(jié)合位點(diǎn)的位點(diǎn)上結(jié)合，并且該次級(jí)受體與一種電荷標(biāo)記物綴合；(d)當(dāng)處理過(guò)的感應(yīng)電極與參比電極浸入一種電解液中時(shí)，監(jiān)測(cè)兩者之間的電勢(shì)差；和(e)在恒定pH值下，電解液的離子強(qiáng)度改變之后，監(jiān)測(cè)感應(yīng)電極與參比電極之間的電勢(shì)差。
上述方法的親合性反應(yīng)步驟等價(jià)于一種本領(lǐng)域技術(shù)人員所眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)夾層結(jié)構(gòu)分析。該夾層結(jié)構(gòu)的分析程序?qū)Χ鄡r(jià)抗原的檢測(cè)特別有用，在測(cè)試中所用的受體和被標(biāo)記的次級(jí)受體是其結(jié)合在抗原上不同的、空間上不同的抗原決定簇的抗體。該夾層結(jié)構(gòu)形式還可用于攜帶兩個(gè)或更多同樣的抗原決定簇，其在空間上是分開的抗原。在后者的情況下，受體與標(biāo)記的次級(jí)受體被用于測(cè)試同樣特異性的抗體。
在競(jìng)爭(zhēng)性分析形式中完成電化學(xué)分析同樣在本發(fā)明的范疇之內(nèi)。所以，本發(fā)明還提供一種樣品中被分析物的電化學(xué)檢測(cè)方法，該方法包括下列步驟(a)提供一種含有導(dǎo)電聚合物涂層的感應(yīng)電極，該涂層含有被固定于其中或者被吸附于其上的能夠結(jié)合樣品中目的待測(cè)被分析物的受體；(b)將感應(yīng)電極浸入一種含有樣品的溶液中，以使該目的被分析物與所述被固定的或者被吸附的受體結(jié)合；(c)將感應(yīng)電極與含有能夠與被固定或被吸附的受體結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)分子的溶液接觸，該競(jìng)爭(zhēng)分子與一種電荷標(biāo)記物綴合；(d)當(dāng)處理過(guò)的感應(yīng)電極與參比電極浸入一種電解液中時(shí)，監(jiān)測(cè)兩者之間的電勢(shì)差；并且(e)在恒定pH值下，電解液的離子強(qiáng)度改變之后，監(jiān)測(cè)感應(yīng)電極與參比電極之間的電勢(shì)差。
在這一競(jìng)爭(zhēng)性的電化學(xué)分析中，競(jìng)爭(zhēng)分子可以是能夠結(jié)合在被固定的/被吸附的受體上相同的被分析物結(jié)合部位的被標(biāo)記的被分析物，或者是被標(biāo)記的被分析物的結(jié)構(gòu)類似物(參見圖5B和圖7B)。為了檢測(cè)小的被分析物分子(如地高新，如在本發(fā)明所包括的實(shí)施例中所述的)，使用被標(biāo)記的被分析物作為競(jìng)爭(zhēng)分子是特別優(yōu)選的。作為一種替代方案，競(jìng)爭(zhēng)分子可以與固定/被吸附的受體上不同的位點(diǎn)結(jié)合。例如，如果被固定的受體是抗體，競(jìng)爭(zhēng)分子可以是抗免疫球蛋白的抗體(優(yōu)選是Fab特異性的)或一種具有適度特異性的抗遺傳型抗體(參見圖5A和圖7A)。
正如將易于被所屬技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員所理解的那樣，參考本申請(qǐng)的圖5A、5B、7A和7B，競(jìng)爭(zhēng)性的檢測(cè)方法通常取決于該感應(yīng)電極表面上的過(guò)剩受體位點(diǎn)。那些不結(jié)合被分析物的受體將可用于結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)分子。假定受體位點(diǎn)的總額保持恒定，結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)分子的數(shù)量將與被分析物存在的數(shù)量成反比。
為了將與被分析物濃度有關(guān)的化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換為一種可測(cè)量的電信號(hào)，與次級(jí)受體或者競(jìng)爭(zhēng)分子綴合的電荷標(biāo)記物可以是任何具有下列性質(zhì)的電荷(ⅰ)在(d)部分電解液pH值下攜帶一種凈電荷(正電或者負(fù)電)；和(ⅱ)在恒定pH值下，該電荷數(shù)量的變化相應(yīng)于該電解液離子強(qiáng)度的變化。
優(yōu)選該電荷標(biāo)記物帶有大量電荷，即在(d)部分電解液的pH值下具有大于一個(gè)靜電單位(e)的凈電荷。合適的電荷標(biāo)記物包括金、二茂鐵和膠乳微球。電荷標(biāo)記物上的電荷大小影響感應(yīng)電極上導(dǎo)電聚合物涂層的氧化還原組分，致使步驟(d)和(e)之間的離子強(qiáng)度的階段變化在感應(yīng)電極和參比電極之間的電勢(shì)差可以被檢測(cè)到。在形成受體/被分析物/次級(jí)受體復(fù)合物(夾層結(jié)構(gòu)分析法)或者受體/競(jìng)爭(zhēng)分子復(fù)合物(競(jìng)爭(zhēng)分析法)時(shí)，電荷標(biāo)記物是唯一最接近導(dǎo)電聚合物的成分。由于能夠測(cè)試小的和非荷電的被分析物，因此使用電荷標(biāo)記物可以獲得正確的定性結(jié)果，并顯著擴(kuò)展可測(cè)試的被分析物的范圍。
與次級(jí)受體或者競(jìng)爭(zhēng)分子綴合的膠乳微球體是優(yōu)選的電荷標(biāo)記物。與膠乳微球體的綴合可使用已知技術(shù)之一進(jìn)行，例如，如[17]或者[18]所描述的那樣，或者遵循由該廠家提供的規(guī)程，使用特定的用于抗體與膠乳微球體綴合的市售試劑盒，例如由Polysciences Inc.,USA制造的“用于羧化珠的碳化二亞胺試劑盒”。某些制成的膠乳綴合體是由專業(yè)制造廠家市售的，如Polysciences Inc.,USA。
作為使用電荷標(biāo)記物的可替代的方案，為將與被分析物濃度有關(guān)的化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換成一種可測(cè)量的電信號(hào)，還可以采用相當(dāng)于上述的那些方法，使用次級(jí)受體或者競(jìng)爭(zhēng)分子與一種酶標(biāo)物綴合來(lái)完成電化學(xué)檢測(cè)過(guò)程。
所以，本發(fā)明更進(jìn)一步提供一種在樣品中的被分析物的電化學(xué)檢測(cè)方法，該方法包括下列步驟(a)提供一種具有導(dǎo)電聚合物涂層的感應(yīng)電極，該涂層含有被固定于其中或者被吸附于其上的能夠結(jié)合在樣品中目的被待測(cè)分析物的受體；(b)通過(guò)將該感應(yīng)電極浸入一種含有樣品的溶液中，以使所述的被分析物結(jié)合到所述的被固定的或者被吸附的受體上；(c)將該感應(yīng)電極與一種含有次級(jí)受體的溶液接觸，該次級(jí)受體能夠與該被分析物在空間上不同于被固定或者被吸附的受體的結(jié)合位點(diǎn)的位點(diǎn)上結(jié)合，并且該次級(jí)受體與一種酶綴合；(d)將處理過(guò)的感應(yīng)電極與參比電極浸在在一種電解液之中，監(jiān)測(cè)兩者之間的電勢(shì)差；并且(e)在接觸一種含有所述酶作用底物的電解液后，監(jiān)測(cè)該感應(yīng)電極與參比電極之間的電勢(shì)差。
在本發(fā)明范疇內(nèi)的還有相應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)性的電化學(xué)檢測(cè)方法，該方法包括下列步驟(a)提供一種含有導(dǎo)電聚合物涂層的感應(yīng)電極，該涂層含有被固定于其中或者被吸附于其上的能夠結(jié)合在樣品中目的待測(cè)被分析物的受體；(b)通過(guò)將該感應(yīng)電極浸入一種含有樣品的溶液中，以使該目的被分析物結(jié)合到所述被固定的或者被吸附的受體上；(c)將感應(yīng)電極與一種含有能夠結(jié)合到被固定的或者被吸附的受體上的競(jìng)爭(zhēng)分子的溶液接觸，該競(jìng)爭(zhēng)分子與一種酶綴合；(d)將處理過(guò)的感應(yīng)電極與參比電極浸在一種電解液之中，記錄兩者之間的電勢(shì)差；并且(e)在接觸一種含有所述酶作用底物的電解液之后，記錄該感應(yīng)電極與參比電極之間的電勢(shì)差。
在上述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，與次級(jí)受體或者競(jìng)爭(zhēng)分子綴合的酶能夠?qū)⒁环N直接影響感應(yīng)電極的導(dǎo)電聚合物涂層的氧化還原組成的底物，轉(zhuǎn)換成一種對(duì)導(dǎo)電聚合物的氧化還原組成沒(méi)有可檢測(cè)作用的產(chǎn)物。
在一種可替代的實(shí)施方案中，與次級(jí)受體或者競(jìng)爭(zhēng)分子綴合的酶能夠?qū)⒁环N對(duì)電化學(xué)聚合物的氧化還原組成沒(méi)有可檢測(cè)作用的底物，轉(zhuǎn)換成一種能夠直接或者間接影響該導(dǎo)電聚合物的氧化還原組成的產(chǎn)物。這樣一種酶的實(shí)例是辣根過(guò)氧化酶。一種酶促反應(yīng)的產(chǎn)物可間接影響該導(dǎo)電聚合物的氧化還原組成的方法是造成電解液的pH值變化(因?yàn)樵搶?shí)施方案電解液的pH值不是緩沖的)。一種產(chǎn)生這類產(chǎn)物的酶的實(shí)例是脲酶。
在一種更進(jìn)一步實(shí)施方案中，與次級(jí)受體或者競(jìng)爭(zhēng)分子綴合的酶能夠?qū)⒁环N對(duì)導(dǎo)電聚合物感應(yīng)電極的導(dǎo)電聚合物涂層的氧化還原組成沒(méi)有可檢測(cè)作用的產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化成作為第二種酶的底物的產(chǎn)物，該第二種酶的作用是產(chǎn)生一種直接或者間接影響該導(dǎo)電聚合物的氧化還原組成的第二種產(chǎn)物。
在所有的實(shí)施方案中，綴合酶通過(guò)形成受體/被分析物/次級(jí)受體絡(luò)合物(夾層結(jié)構(gòu)分析法)或者通過(guò)形成受體/競(jìng)爭(zhēng)分子絡(luò)合物(競(jìng)爭(zhēng)形式法)進(jìn)入導(dǎo)電聚合物的近程。
次級(jí)受體或者競(jìng)爭(zhēng)分子與酶標(biāo)記物的綴合可以通過(guò)本領(lǐng)域任何已知的技術(shù)完成(參見例如[19])。也可以使用不同酶標(biāo)記物與不同特異性受體的綴合體的廣泛市售制劑。
上述所有電化學(xué)檢測(cè)的方法可以使用能夠特異性結(jié)合至另一種分子(被分析物)的任何類型的受體完成。適當(dāng)?shù)氖荏w類型包括單克隆和多克隆的抗體、嵌和體抗體、保持能夠辨認(rèn)抗原的抗體碎片(如Fab和Fab2碎片)、重組體蛋白質(zhì)和其碎片、合成肽、抗原、單股DNA、RNA或者PNA分子、激素、激素受體、酶、化合物等。
無(wú)論次級(jí)受體還是競(jìng)爭(zhēng)分子與電荷或酶標(biāo)記物綴合，對(duì)本發(fā)明所有檢測(cè)方法的最大程度的特異性和靈敏度是通過(guò)親合性反應(yīng)(即(a)至(c)步驟)以一種“順序的”形式實(shí)現(xiàn)的，特別是當(dāng)受檢被分析物是一種多價(jià)抗原(即夾層結(jié)構(gòu)分析)時(shí)。在該順序的形式中，含結(jié)合受體的感應(yīng)電極首先與含有待測(cè)被分析物存在的樣品的試液接觸。本文所用的術(shù)語(yǔ)“樣品”包括此范圍內(nèi)所要檢測(cè)被分析物存在的任何材料，包括生物學(xué)流體如全血、血清、血漿、尿、淋巴、腦脊髓液流體或者精液、環(huán)境的流體、在飲食工業(yè)使用或者生產(chǎn)的材料，或者上述所有的被分析物的稀釋或者提取物。該樣品也可以包括固體物料的溶液或者提取物。用于該試液的容器可以是一種微量滴定板的澆口窩、微離心管或者任何其它適當(dāng)大小的容器。根據(jù)感應(yīng)電極的幾何的尺寸，試液的體積通常是5-200μl。在15-40℃、有或者無(wú)連續(xù)混合下，通常將感應(yīng)電極和試液接觸3-30分鐘。
與試液接觸后，該感應(yīng)電極被轉(zhuǎn)入一種裝有標(biāo)記的次級(jí)受體溶液的容器中。所用的容器和溶液的體積與用于感應(yīng)電極和試液接觸的容器和體積類似。依賴于檢測(cè)所需要的靈敏度，標(biāo)記的次級(jí)受體或者標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)分子在溶液中的濃度通常為1-100μg/ml。在15-40℃、有或者無(wú)連續(xù)混合下接觸3-30分鐘。
作為一種“順序的”形式可替代的方案，可以通過(guò)將感應(yīng)電極與已經(jīng)添加適當(dāng)標(biāo)記的次級(jí)受體或者標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)分子的試液接觸，接觸時(shí)間為大約5-60分鐘，同時(shí)完成(b)和(c)步驟，以大大減少總的測(cè)試時(shí)間和簡(jiǎn)化測(cè)試步驟。根據(jù)其類型、特異性和檢測(cè)所需要的靈敏度，加到試液中的標(biāo)記的次級(jí)受體或者標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)分子的濃度通常為1-100μg/ml。
為了消除使所得結(jié)果失真的在受檢生物學(xué)流體和感應(yīng)電極的表面之間可能的非特異性相互作用，以及標(biāo)記的次級(jí)受體或者標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)分子在該感應(yīng)電極上的非特異性吸附，可向標(biāo)記的次級(jí)受體或者標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)分子的溶液中加入各種阻滯劑。合適的阻滯劑包括牛血清白蛋白(0.5％-5％)，人血清白蛋白(0.5-5wt.％)，稀釋的正常人或者動(dòng)物血清(5-10vol％)，白明膠(10-50vol.％)等等。在這種情況下，標(biāo)記的次級(jí)受體或者標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)分子與感應(yīng)電極的相互作用同時(shí)伴隨有對(duì)感應(yīng)電極任何自由表面的阻滯。
在本發(fā)明的全部檢測(cè)方法中，可以使用包含被固定的/被吸附的銜接分子的感應(yīng)電極。特別是受體分子可通過(guò)生物素/抗生物素蛋白質(zhì)、生物素/抗生蛋白鏈菌素、蛋白質(zhì)A/抗體、蛋白質(zhì)G/抗體、FITC、抗-FITC或者外源凝集素/糖的結(jié)合相互作用附著于感應(yīng)電極的表面上。
使用包含銜接分子的“通用”感應(yīng)電極允許該檢測(cè)方法以“一鍋”的形式完成。在這一實(shí)施方案中，親合性反應(yīng)在一種使相互作用分子之間最大接觸，并保證了最高靈敏度和最短的檢測(cè)時(shí)間的均勻溶液中完成。在這種情況下，將受體溶液和標(biāo)記的次級(jí)受體或者標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)分子的溶液同時(shí)或者順序加到在單個(gè)反應(yīng)容器中含有假定包含被分析物樣品的試液中。在試液中受體和標(biāo)記的次級(jí)受體或者標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)分子的濃度通常分別為0.1-100μg/ml和1-100μg/ml。然后將試液在15-40℃、有或者沒(méi)有連續(xù)混合的情況下溫育5-60分鐘，以使結(jié)合反應(yīng)發(fā)生。然后將包含適當(dāng)銜接分子的感應(yīng)電極或者通過(guò)浸入包含試液的容器或者通過(guò)在該感應(yīng)電極表面上滴一滴試液使之與試液接觸。在15-40℃下，感應(yīng)電極和試液之間的接觸時(shí)間通常為3-30分鐘。然后用“離子步驟”程序，或者根據(jù)次級(jí)受體或者競(jìng)爭(zhēng)分子是否已用電荷或者酶標(biāo)物所標(biāo)記，通過(guò)加入適當(dāng)?shù)拿傅孜?，測(cè)量被分析物結(jié)合于感應(yīng)電極的數(shù)量。
一旦該親合性反應(yīng)全部完成，通過(guò)將感應(yīng)電極和參比電極連接到測(cè)量?jī)x器來(lái)安裝電化學(xué)電池，與電解質(zhì)溶液接觸(此處同樣指工作溶液)，在固定時(shí)間內(nèi)用測(cè)量裝置記錄感應(yīng)電極相對(duì)于參比電極的電極電勢(shì)。市售的適當(dāng)大小的參比電極或者為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明特定目的設(shè)計(jì)的電極可用作參比。測(cè)量?jī)x器是一種標(biāo)準(zhǔn)電勢(shì)測(cè)定的測(cè)量?jī)x或者電勢(shì)穩(wěn)定器。還可以使用為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的而設(shè)計(jì)的并通過(guò)常規(guī)軟件控制的PC兼容電子測(cè)量?jī)x器。
為了方便起見，可以通過(guò)一種為連接感應(yīng)電極和參比電極的裝有電觸點(diǎn)的專用刀桿，將該感應(yīng)電極和參比電極與測(cè)量?jī)x器連接，并通過(guò)電纜或者其他設(shè)備連接到測(cè)量?jī)x器上。還可以使用與測(cè)量?jī)x器一體的支架，從而使該測(cè)量系統(tǒng)的總尺寸能夠小型化。
水性緩沖液用作工作溶液磷酸鹽-鹽水、Tris-HCl、碳酸鹽、碳酸氫鹽、乙酸鹽、硼酸鹽等等。按照感應(yīng)電極的幾何的尺寸，電化學(xué)電池的工作溶液的體積在50至5000μl之間。緩沖溶液的容器可以是具有最小吸附作用性質(zhì)材料的任何合適尺寸的容器，如標(biāo)準(zhǔn)微量滴定板的澆口窩。本公開的發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種變體，其中一種小體積的(＜1cm3)流通池用于與該感應(yīng)電極和參比電極的整體支架連接，緩沖溶液可以通過(guò)蠕動(dòng)泵或者通過(guò)其他設(shè)備泵送。
使用一種連接到電勢(shì)測(cè)定的測(cè)量裝置或者電壓穩(wěn)定器的圖表記錄儀，或者通過(guò)一種使用PC-兼容電子儀器的特定程序，在固定時(shí)間記錄感應(yīng)電極相對(duì)于參比電極的電勢(shì)。在后者的情況下，該程序在預(yù)定時(shí)段測(cè)量感應(yīng)電極相對(duì)于參比電極的電勢(shì)(通常為每3-5秒，總共10-100秒)并以“感應(yīng)電極信號(hào)-時(shí)間”為坐標(biāo)點(diǎn)的形式顯示結(jié)果。記錄感應(yīng)電極電勢(shì)相對(duì)于參比電極電勢(shì)，以測(cè)定感應(yīng)電極的本底電勢(shì)值V1，并評(píng)估該感應(yīng)電極的本底電勢(shì)漂移(γ)，其通過(guò)對(duì)“感應(yīng)電極-時(shí)間”獲得的曲線使用最小二乘法的線性回歸計(jì)算。
如果該次級(jí)受體或者競(jìng)爭(zhēng)分子與一種電荷標(biāo)記物綴合，在恒定pH值下，在所謂的“離子-步驟”程序中，通過(guò)改變電解質(zhì)溶液離子強(qiáng)度的來(lái)評(píng)估結(jié)合至該感應(yīng)電極的被分析物的量。
在該離子步驟程序中，可以通過(guò)將支架與感應(yīng)電極和參比電極從初始工作溶液轉(zhuǎn)移到具有相同組成只是離子強(qiáng)度不同的第二種工作溶液中，或者通過(guò)將不同離子強(qiáng)度的緩沖溶液(更高或者更低的)加到感應(yīng)電極和參比電極被浸入其中的工作溶液中，改變電解質(zhì)溶液的離子強(qiáng)度(增加或者減少)。如果使用流動(dòng)池，可以通過(guò)使用一種不同離子強(qiáng)度的緩沖溶液排出池中初始工作溶液來(lái)改變電解質(zhì)溶液的離子強(qiáng)度。
不同的離子強(qiáng)度工作溶液可以通過(guò)配制不同濃度的鹽類溶液得到，例如KCl、Na2SO4等，其使用是根據(jù)當(dāng)它們被加到溶液中時(shí)完全離解并不改變?nèi)芤簆H值的事實(shí)。工作溶液中鹽類的濃度為0.01M至0.1M。
如果該次級(jí)受體或者競(jìng)爭(zhēng)分子與一種酶綴合，則沒(méi)有必要進(jìn)行“離子步驟”程序。反而，工作溶液的組成通過(guò)加入一種該酶的適當(dāng)?shù)孜锒淖?。為此，或者將支架與感應(yīng)電極和參比電極一同從裝有初始工作溶液的容器轉(zhuǎn)移至裝有工作溶液加底物的容器中，或者將底物溶液直接加入感應(yīng)電極和參比電極浸入其中的原始工作溶液中。如果使用流動(dòng)池，工作溶液的組成可以通過(guò)用一種包含底物的工作溶液排出池中初始工作溶液來(lái)改變。
可以使用的底物包括ABTS({2,2′-偶氮基-雙[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]})、TMB(3,3,5,5′-四乙基聯(lián)苯胺)、DAB(3,3′-二氨基聯(lián)苯胺)(其中的酶標(biāo)記物是過(guò)氧化酶)、尿素(其中的酶標(biāo)記物是脲酶)、p-NPP(磷酸對(duì)-硝基苯酯)、BCIP(5-溴代-4-氯代-3-吲哚磷酸酯)(其中的酶標(biāo)記物是堿性磷酸酶)。
使用一種測(cè)量?jī)x器，在固定時(shí)間段記錄該感應(yīng)電極電勢(shì)相對(duì)于參比電極電勢(shì)響應(yīng)于工作溶液的離子強(qiáng)度階段變化或添加酶底物的變化。此外，使用一種連接到電勢(shì)測(cè)定的測(cè)量裝置或者電壓穩(wěn)定器的圖表記錄儀，或者通過(guò)使用PC-兼容電子儀器的特定程序來(lái)進(jìn)行記錄。在后者的情況下，該程序在預(yù)定時(shí)段測(cè)量感應(yīng)電極電勢(shì)相對(duì)于參比電極電勢(shì)(通常為每3-5秒)并以“感應(yīng)電極信號(hào)-時(shí)間”為坐標(biāo)的點(diǎn)的形式顯示結(jié)果。依檢測(cè)的具體類型，用于記錄感應(yīng)電極相于參比電極的電勢(shì)變化的時(shí)間間隔在30到600秒之間變化。
在其中緩沖溶液的離子強(qiáng)度被改變的情況下，感應(yīng)電極電勢(shì)相對(duì)于參比電極電勢(shì)的變化所得的曲線通常為拋物線的形式，并表示感應(yīng)電極對(duì)緩沖溶液在離子強(qiáng)度方面變化的響應(yīng)，其通過(guò)導(dǎo)電聚合物膜的電荷總數(shù)(等電點(diǎn))來(lái)調(diào)節(jié)。
如果該分析是作為夾層結(jié)構(gòu)分析進(jìn)行的，聚合物膜的總電荷變化與受檢被分析物的數(shù)量成正比。然而，如果該分析是作為競(jìng)爭(zhēng)分析進(jìn)行的，聚合物膜的總電荷變化通常與受檢被分析物的數(shù)量成反比。
在完成這一程序階段時(shí)，測(cè)定感應(yīng)電極電勢(shì)相對(duì)于參比電極電勢(shì)的最終電勢(shì)V2。因此可以計(jì)算感應(yīng)電極電勢(shì)相對(duì)于參比電極電勢(shì)變化的下列定量特性1．感應(yīng)電極電勢(shì)相對(duì)于參比電極電勢(shì)變化所得曲線的(積分)面積S2S2=∫T1T2f2(t)dt]]>其中T2-T1=記錄本底電勢(shì)漂移或者相對(duì)于參比電極電勢(shì)的總時(shí)間周期；f2-“以毫伏計(jì)的感應(yīng)電極電勢(shì)-時(shí)間”的曲線；t-當(dāng)前記錄時(shí)間；和2．該感應(yīng)電極基礎(chǔ)與最后的電勢(shì)之間以毫伏計(jì)的差值
δ=V2-V1基于感應(yīng)電極電勢(shì)響應(yīng)于在工作溶液的離子強(qiáng)度或者組成方面的變化而變化的數(shù)量特征，可測(cè)定在試液中目標(biāo)被分析物的定量含量。
使用上述所得的γ、S2和/或δ，將基線漂移計(jì)算在內(nèi)，再計(jì)算這些數(shù)值，得到S2γ和/或δγ，以此為基礎(chǔ)，測(cè)定目標(biāo)被分析物在試液中的量。該校正值S2γ和δγ可與“分析結(jié)果對(duì)目標(biāo)被分析物量”校準(zhǔn)曲線相比。正如將對(duì)所屬技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員而言是易于顯而易見的，用于繪制校準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)可以類似于如上所述的方式，使用一定范圍的包含已知量的目標(biāo)被分析物的試液得到。
本發(fā)明更進(jìn)一步提供一種電化學(xué)檢測(cè)樣品中的被分析物的方法，該方法包括下列步驟(a)提供一種包括涂有含被固定其中或者被吸附其上的抗生物素蛋白質(zhì)或者抗生蛋白鏈菌素的導(dǎo)電聚合物的導(dǎo)電電極的感應(yīng)電極，經(jīng)由生物素/抗生物素蛋白質(zhì)或者生物素/抗生蛋白鏈菌素結(jié)合相互作用，該抗生物素蛋白質(zhì)或者抗生蛋白鏈菌素分子被附著在能夠結(jié)合待測(cè)被分析物的受體分子上；(b)將感應(yīng)電極與含有樣品的試液接觸，以使該被分析物結(jié)合至所述被固定的或者被吸附的受體分子上；(c)將該感應(yīng)電極與參比電極浸在電解液之中，記錄兩者之間相對(duì)的電勢(shì)差；和(d)在恒定pH值下，電解液的離子強(qiáng)度或者組成改變之后，監(jiān)測(cè)感應(yīng)電極相對(duì)于參比電極的電勢(shì)差。
這種電化學(xué)檢測(cè)方法用于目標(biāo)被分析物結(jié)合到受體上造成感應(yīng)電極表面足以被測(cè)量的電荷變化，而不需要單獨(dú)的電荷或者酶標(biāo)記物。特別是，本方法可用于核酸的電化學(xué)檢測(cè)。目標(biāo)核酸結(jié)合到附著于電極表面的核酸探針(如低聚核苷酸)上伴隨有足夠大的電荷變化，可通過(guò)“離子-步驟”程序檢測(cè)。因此不需要使用與電荷標(biāo)記物綴合的次級(jí)受體或者競(jìng)爭(zhēng)分子。在進(jìn)行檢測(cè)過(guò)程之前，疑有包含特異性核酸的材料(如生物學(xué)流體)可通常經(jīng)歷一種放大步驟(如PCR)。因此對(duì)經(jīng)歷了放大步驟的特異性核酸樣品進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)是在本發(fā)明的范疇之內(nèi)的。
參考下列非限定實(shí)施例與描繪其主要實(shí)施階段的附圖，本發(fā)明將得到更進(jìn)一步理解。


圖1A圖示說(shuō)明由電勢(shì)電極組成的感應(yīng)電極(1)，該電極上涂有導(dǎo)電聚合物層(2)，抗生物素蛋白質(zhì)或者抗生蛋白鏈菌素分子(3)被固定在該聚合物層中。
圖1B圖示說(shuō)明由電勢(shì)電極組成的感應(yīng)電極(1)，該電極上涂有導(dǎo)電聚合物層(2)，抗生物素蛋白質(zhì)或者抗生蛋白鏈菌素分子(3)被吸附在該聚合物層表面上。
圖2A通過(guò)被固定在聚合物層的抗生物素蛋白質(zhì)或者抗生蛋白鏈菌素和與生物素(5)綴合的抗體(4)之間的結(jié)合反應(yīng)，說(shuō)明感應(yīng)電極特異性結(jié)合被分析物(假定為抗原、介質(zhì)或高分子量物質(zhì))的過(guò)程。
圖2B通過(guò)被固定在聚合物層中的抗生物素蛋白質(zhì)或者抗生蛋白鏈菌素和與生物素(5)綴合的抗原(6)之間的結(jié)合反應(yīng)，說(shuō)明測(cè)試過(guò)程中感應(yīng)電極特異性結(jié)合被分析物(假定為抗體)的過(guò)程。
圖2C通過(guò)被固定在聚合物層中的抗生物素蛋白質(zhì)或者抗生蛋白鏈菌素和與生物素(5)綴合的DNA探針(7)之間的結(jié)合反應(yīng)，說(shuō)明測(cè)試過(guò)程中感應(yīng)電極特異性結(jié)合被分析物(假定為DNA分子)的過(guò)程。
圖3A表明感應(yīng)電極與包含對(duì)被固定在該感應(yīng)電極上的生物素化抗體特異性的抗原(6)的試液接觸的過(guò)程。
圖3B表明感應(yīng)電極與包含對(duì)被固定在該感應(yīng)電極上的生物素化抗原特異性的抗體(4)的試液接觸的過(guò)程。
圖3C表明感應(yīng)電極與包含對(duì)被固定在該感應(yīng)電極上的生物素化DNA探針特異性的DNA分子(8)的試液接觸的過(guò)程。
圖4A表明感應(yīng)電極與和電荷標(biāo)記物(10)綴合并對(duì)待測(cè)抗原特異性的次級(jí)受體(9)的溶液接觸的過(guò)程(血清的分析方式，其中如自身抗體是通過(guò)利用與電荷標(biāo)記物綴合的抗異型抗體測(cè)定的)。
圖4B表明感應(yīng)電極與和電荷標(biāo)記物(10)綴合并對(duì)待測(cè)抗體特異性的次級(jí)受體(11)的溶液接觸的過(guò)程(夾層結(jié)構(gòu)分析方式，在次級(jí)受體是抗異型抗體的情況下)。
圖5A表明感應(yīng)電極與和電荷標(biāo)記物(10)綴合并對(duì)生物素化的抗體特異性的競(jìng)爭(zhēng)分子(12)的溶液接觸的過(guò)程(競(jìng)爭(zhēng)分析方式)。
圖5B表明感應(yīng)電極與和電荷標(biāo)記物(10)綴合并對(duì)生物素化的抗原特異性的競(jìng)爭(zhēng)分子(13)的溶液接觸的過(guò)程(競(jìng)爭(zhēng)分析方式)。
圖6A表明感應(yīng)電極與和一種酶(14)綴合并對(duì)受檢抗原特異性的次級(jí)受體(9)的溶液接觸的過(guò)程(夾層結(jié)構(gòu)分析方式)。
圖6B表明感應(yīng)電極與和一種酶(14)綴合并對(duì)受檢抗體特異性的次級(jí)受體(11)的溶液接觸的過(guò)程(血清的分析方式，其中如自身抗體是通過(guò)利用與一種酶綴合的抗異型抗體測(cè)定的)。
圖7A表明感應(yīng)電極與和一種酶(14)綴合并對(duì)生物素化的抗體特異性的競(jìng)爭(zhēng)分子(12)的溶液接觸的過(guò)程(競(jìng)爭(zhēng)分析方式)。
圖7B表明感應(yīng)電極與和一種酶(14)綴合并對(duì)生物素化的抗原特異性的競(jìng)爭(zhēng)分子(13)的溶液接觸的過(guò)程(競(jìng)爭(zhēng)分析方式)。
圖8A舉例說(shuō)明一種感應(yīng)電極以“順序的”的形式與[圖8A1]生物素化受體、[圖8A2]試液、[圖8A3]標(biāo)記的次級(jí)受體溶液順序接觸，并隨后測(cè)量感應(yīng)電極電勢(shì)相對(duì)于參比電極電勢(shì)[圖8A4]的電化學(xué)分析步驟。
圖8B舉例說(shuō)明電化學(xué)分析步驟，其中首先將感應(yīng)電極浸入生物素化的受體溶液中[圖8B1]，然后將感應(yīng)電極浸入加有適當(dāng)標(biāo)記的次級(jí)受體的測(cè)試液中[圖8B2]，測(cè)量感應(yīng)電極電勢(shì)相對(duì)于參比電極電勢(shì)[圖8B3]。
圖8C舉例說(shuō)明在“一鍋”形式中的電化學(xué)分析步驟，其中將生物素化的受體和標(biāo)記的次級(jí)受體加到試液中[圖8C1]，然后將感應(yīng)電極放入與該試液接觸[圖8C2]，并隨后測(cè)量感應(yīng)電極電勢(shì)相對(duì)于參比電極電勢(shì)[圖8C3]。
圖9舉例說(shuō)明在工作溶液的離子強(qiáng)度或者組成階梯式的變化時(shí)，感應(yīng)電極電勢(shì)變化曲線的典型形狀(以“毫伏-時(shí)間”雙坐標(biāo))，隨后將感應(yīng)電極與不含任何被分析物的試液溫育(曲線2)，以及隨后將感應(yīng)電極與包含對(duì)生物素化的受體特異性被分析物的試液溫育(曲線2)。
圖10表明所測(cè)得的感應(yīng)電極相對(duì)于參比電極的本底電勢(shì)與最后電勢(shì)的電勢(shì)差以毫伏計(jì)相對(duì)于血清樣品中HBsAg濃度的校準(zhǔn)曲線。
圖11表明所測(cè)得的感應(yīng)電極相對(duì)于參比電極的本底電勢(shì)與最后電勢(shì)的電勢(shì)差以毫伏計(jì)相對(duì)于HbsAg-陽(yáng)性血清稀釋液的電勢(shì)差曲線。
在實(shí)施例中所用的試劑、材料和設(shè)備見如下試劑和材料吡咯(＞98％)購(gòu)自Merck公司，使用前使用真空蒸餾法提純兩次，然后在氮?dú)庀略诓煌该鞯娜萜髦性?4℃下存放；下列試劑全部購(gòu)自美國(guó)Sigma Chemical公司氫氧化鉀(KOH,ACS試劑)、氫氧化鈉(NaOH,ACS試劑)、疊氮化鈉(SigmaUltra)、硫酸高鈰(ACS試劑)、氯化鉀(SigmaUltra)、氯化鈉(SigmaUltra)、三[羥甲基]氨基甲烷(SigmaUltra)、十二烷基硫酸鈉(SDS,＞99％)、萄聚糖硫酸鈉(分子量約8000)、異丙醇(ACS試劑)、丙酮、鹽酸(ACS試劑)、氯酸(ACS試劑)，N,N-二甲基甲酰胺(ACS試劑)、甘氨酸緩沖溶液(0.2M)、“三鹽緩沖片”、“磷酸鹽緩沖片”、“鄰苯二胺二氫氯化物片”、牛血清白蛋白(RIA等級(jí)，級(jí)分V)、冰凍牛血清、抗生蛋白鏈菌素(來(lái)自鏈霉菌屬avidinii),NHS-d-生物素，二甲基亞砜(DMS0、ACS試劑)、生物素-X-X-NHS、牛白蛋白的兔多克隆抗體、小鼠IgG的羊多克隆抗體與脲酶的綴合物、地高新、小鼠單克隆抗-地高新克隆DI-22生物素復(fù)合物、過(guò)氧化酶(每一毫克固體100單位)、一次性的透滲析袋(MWCO1,000)；除非另有說(shuō)明，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)一直在pH值7.4使用。
乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的小鼠單克隆抗體(5.7mg/ml含0.01％疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖溶液)，小鼠IgG的羊多克隆抗體(10.0毫克/ml含0.01％疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖溶液)和HBsAg的小鼠單克隆抗體與過(guò)氧化酶的綴合物(2.5毫克/ml含0.01％疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖溶液)購(gòu)買自Sorbent-ServiceLtd.(俄國(guó))；冷凍胰島素(牛的，約20IU/mg)和胰島素的小鼠單克隆抗體(1.2mg/ml磷酸鹽緩沖溶液)，由附屬于俄國(guó)醫(yī)藥科學(xué)院的心臟病學(xué)研究中心會(huì)員惠贈(zèng)；冷凍的雙股DNA-探針制劑(長(zhǎng)度約lkb)通過(guò)缺口移位生物素化[20]，與生物素化DNA探針互補(bǔ)的冷凍雙股DNA制劑、與生物素化DNA探針?lè)腔パa(bǔ)的冷凍雙股DNA制劑、來(lái)自鮭魚精液的冷凍DNA制劑和用于DNA雜化反應(yīng)的緩沖溶液，都由附屬于衛(wèi)生部的科學(xué)研究學(xué)會(huì)成員惠贈(zèng)。
Polybead硫酸鹽微球體(2.5％固體-膠乳，0.2μm)，購(gòu)買自PolysciencesInc公司；LavsanTM薄膜(約500μm厚)，購(gòu)買自Vladimir化工廠(俄國(guó))；分散在真空和光致抗蝕劑中的鉻靶《FP-383》，購(gòu)買自NIIPIK研究所(俄國(guó))；去離子水(試劑等級(jí)，電阻＞18Ω)使用Millipore Milli-RO/Milli-Q系統(tǒng)得到；鉑絲，厚度約0.5mm；有關(guān)英國(guó)第二工作標(biāo)準(zhǔn)的乙型肝炎表面抗原(HBsAg濃度0.50iU/ml)，由英國(guó)北方倫敦輸血中心惠贈(zèng)；HBsAg陽(yáng)性的人類血清樣品，由北方倫敦輸血中心惠贈(zèng)；設(shè)備
UVN真空沉積裝置(俄國(guó))；《PNF-6Ts》光致抗蝕應(yīng)用裝置(俄國(guó))；自制光-模板(在WO 96/02001的圖1、圖3或者圖4中所示的其給予電極設(shè)計(jì)的光-模板是適用的)；《STP-300》曝光裝置(俄國(guó))；自制的索格利特抽提器；EU18干熱柜(Jouan，法國(guó))；《PI-50.1》帶標(biāo)準(zhǔn)積分器和雙坐標(biāo)記錄器的電壓穩(wěn)定器-恒流器(俄國(guó))；雙道記錄器2210(LKB-Pribori，瑞典)；帶標(biāo)準(zhǔn)復(fù)合電極的Checkmate pH計(jì)(Mettler，瑞士)；自制Ag/AgCl半-微參比電極，直徑約2.5mm，充滿飽和的KCl溶液；AgCl參比電極N°476370(Corning)；針對(duì)用途設(shè)計(jì)的PC兼容測(cè)量?jī)x器，包括放大器和模擬-數(shù)字轉(zhuǎn)換器，由常規(guī)軟件控制；針對(duì)用途設(shè)計(jì)的感應(yīng)電極和參比電極支架。
實(shí)施例1HBsAg測(cè)定；競(jìng)爭(zhēng)性分析；樣品-稀釋性樣本；受體-生物素化的單克隆小鼠抗-HBsAg；競(jìng)爭(zhēng)分子-標(biāo)記的羊多克隆抗小鼠免疫免疫球蛋白G；電荷標(biāo)記物-膠乳。
1.1．電極基材由60×48mm Lavsan薄膜制備，然后在熱異丙醇中洗滌并在異丙醇蒸汽中干燥。0.05μm鉻層通過(guò)磁控管沉淀涂敷到該基材上。通過(guò)離心作用將光致抗蝕劑涂敷在鉻層上并在+80℃下干燥20分鐘。將該光致抗蝕劑層用紫外光通過(guò)圖形光模板曝光。將該光致抗蝕劑層在KOH溶液中顯影，然后+100℃下干燥20分鐘。該鉻圖形通過(guò)在硫酸高鈰溶液中刻蝕得到。使用二甲基甲酰胺將光致抗蝕劑除去，然后沖洗并在熱異丙醇蒸汽中干燥。通過(guò)在氯化金溶液的電沉積，將0.50μm黃金層涂敷于鉻圖形上，隨后沖洗并在異丙醇蒸汽中干燥。
1.2．將如此得到的電極在2-5％KOH溶液中洗滌兩次30分鐘，用去離子水沖洗并在丙酮中洗滌兩次5分鐘，然后在室溫下風(fēng)干20分鐘。將電極插在氟塑料支架上，并放入索氏抽提器中，在熱異丙醇中洗滌0.5-2小時(shí)。然后將支架與電極一同從索氏抽提器中移開，并在異丙醇蒸汽中干燥。以上過(guò)程完成后，將電極置于密封的玻璃容器中。
1.3．用于感應(yīng)電極的存儲(chǔ)溶液是通過(guò)將8.0克氯化鈉、12.2克三(羥甲基氨基甲烷)、0.2克氯化鉀和0.1克疊氮化鈉溶解在1升去離子水配制的。
1.4．HBsAg的小鼠單克隆抗體按如下生物素化包含疊氮化鈉的0.01M三鹽緩沖溶液(pH值8.0)，是通過(guò)將20片三鹽緩沖片和0.15g疊氮化鈉溶解在1.50升去離子水中制備的；將1.0mg的NHS-d-生物素溶于1ml的DMSO中；將176μl購(gòu)買的HBsAg的小鼠單克隆抗體(5.7mg/ml)加至一個(gè)包含824μl 0.01M磷酸鹽緩沖溶液的微管中；將50μl的NHS-d-生物素的DMSO溶液加至所得的溶液中；將包含該混合物的微管放置在熱混合器中并在+22℃溫度下連續(xù)混合4小時(shí)；然后將該混合物置于含疊氮化鈉且體積500倍過(guò)量的0.01M三鹽的緩沖溶液中，在+4℃下透析過(guò)夜；將該生物素化抗體的產(chǎn)物溶液等分成多個(gè)小包裝(約10μl)并在+4℃儲(chǔ)存。
1.5．小鼠IgG的羊多克隆抗體與膠乳微球按如下方法綴合含疊氮化鈉的甘氨酸緩沖液(pH值8.2)將500ml 0.2M甘氨酸緩沖溶液加到500ml去離子水中，加入8.5g氯化鈉和0.1g疊氮化鈉，并用0.1M NaOH溶液將pH值調(diào)至8.2；將60μl購(gòu)買的小鼠IgG的羊多克隆抗體(10mg/ml)加到包含940μl甘氨酸緩沖鹽水溶液的微管中(優(yōu)選該多克隆抗體在標(biāo)記之前進(jìn)行親合性純化)；將200μl 2.5％ Polybead硫酸鹽微球懸浮液加到所得溶液中；將包含該混合物的微管放置在熱混合器中并在37±1℃溫度下連續(xù)混合30分鐘；然后將包含該混合物的微管冷卻至室溫，并加入0.01g牛血清白蛋白；將所得標(biāo)記的抗體溶液等分成多個(gè)小包裝(約5μl)并在+4℃儲(chǔ)存。
1.6．在聚合之前，將單體(如吡咯)在標(biāo)準(zhǔn)水冷式的儀器中在大氣壓力、135-140℃下蒸餾，并在N2氣氛、-20至-5℃下保存在一種密封的不透明容器中。根據(jù)測(cè)試的類型，單體在電化學(xué)聚合溶液中的濃度在0.3-1.0M的范圍內(nèi)變化。
在該實(shí)施例中用于吡咯電化學(xué)聚合的溶液按如下制備
將2.5ml新近蒸餾的吡咯和0.02g的SDS溶于20.0ml的去離子水中；將磷酸鹽緩沖片溶于200ml的去離子水中，4.0mg的抗生蛋白鏈菌素溶于2ml的PBS中；將1ml抗生蛋白鏈菌素的PBS溶液加到吡咯和SDS的溶液中；將最后的溶液放入軌道式混合器中，并混合10分鐘。
1.7．電沉積步驟在一種三電極電化學(xué)電池中進(jìn)行，該三電極包括工作電極、參比電極和輔助(計(jì)數(shù)器)電極。工作電極是如上所述制備的金屬電勢(shì)電極，輔助電極是一段金或者鉑絲，參比電極是銀/氯化銀電極。
使用電壓穩(wěn)定器，在工作電極上連續(xù)施加電壓掃描進(jìn)行沉積。根據(jù)所需聚合物膜的厚度和性質(zhì)，改變較低電勢(shì)的掃描邊界、較高電勢(shì)的掃描邊界、電壓掃描速率和掃描循環(huán)數(shù)目，它們通常分別為-500mV至+800mV,+1000mV至+2000mV(相對(duì)于Ag/AgCl參比電極)、25-200mV/秒與3-30。
在該實(shí)施例中聚吡咯膜由電化學(xué)沉積形成，抗生蛋白鏈菌素結(jié)合在該電極上，步驟如下將200μl電化學(xué)聚合溶液放入微量滴定板的澆口窩中；將連接電壓穩(wěn)定器上的電極、鉑絲和半微參比電極浸入該澆口窩中；相對(duì)于參比電極的電極電勢(shì)在+800至+1800mV范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)掃描，電壓掃描速率150mV/秒；形成聚吡咯膜的過(guò)程用一種連接電壓穩(wěn)定器的相應(yīng)輸出的雙坐標(biāo)圖表記錄儀，參考伏安曲線，并使用一種連接電壓穩(wěn)定器的相應(yīng)輸出的積分儀和圖表記錄儀，參考經(jīng)過(guò)電極的總電量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。對(duì)該沉積的整個(gè)過(guò)程進(jìn)行檢查，以保證第一次經(jīng)過(guò)工作電極的電量和后來(lái)的循環(huán)相差不超過(guò)15％；當(dāng)聚吡咯膜達(dá)到規(guī)定厚度時(shí)(電勢(shì)掃描循環(huán)數(shù)約為8，通過(guò)電極的總電量為約750mC)，該過(guò)程停止。
1.8．將涂有含結(jié)合抗生蛋白鏈菌素的聚吡咯膜的感應(yīng)電極從澆口窩處移走，用去離子水沖洗，隨后用0.01M磷酸鹽緩沖溶液(pH值7.4)沖洗，并放入含300μl存儲(chǔ)溶液的微管中，在+4℃下儲(chǔ)存。
1.9．重復(fù)步驟1.7-1.8，以得到需要數(shù)量的感應(yīng)電極。
1.10．用預(yù)先解凍的牛血清稀釋英國(guó)第二應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的乙型肝炎表面抗原，稀釋倍數(shù)為2、4、8和10，向裝有100、50、25和20μl英國(guó)第二應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的乙型肝炎表面抗原的不同的微管中，分別加入100、150、175和180μl牛血清，制備一系列200μl已知HBsAg濃度的樣品。純牛血清用作不含HBsAg的樣品。
1.11．將0.2mlHBsAg之生物素化的小鼠單克隆抗體的合適滴定量的溶液加到19.8ml的0.01M磷酸鹽緩沖溶液中。在一種軌道式搖動(dòng)器中完全混合，然后以每份200μl等分至微管中。
1.12．將0.1ml(膠乳綴合)標(biāo)記的小鼠IgG之羊多克隆抗體的合適滴定量的溶液加到19.9ml的0.01M磷酸鹽緩沖溶液中，在一種軌道式混合器中完全混合，然后以每份200μl等分至微管中。
1.13．工作緩沖溶液N°1配制如下將磷酸鹽緩沖片溶解于200ml的去離子水中；將2g牛血清白蛋白和0.37g KCl溶于所得的溶液中。
1.14．通過(guò)在200ml的去離子水中溶解磷酸鹽緩沖片配制N°2工作緩沖溶液。
1.15．將適當(dāng)數(shù)量的涂有含結(jié)合抗生蛋白鏈菌素的聚吡咯膜的感應(yīng)電極從存儲(chǔ)緩沖溶液中移開，并將每個(gè)電極放入包含生物素化的HBsAg之小鼠單克隆抗體溶液(來(lái)自步驟1.11)的微管中，在室溫下溫育10分鐘。
1.16．當(dāng)完成1.15時(shí)，將感應(yīng)電極從包含生物素化抗體溶液的微管中移開，并將每個(gè)電極放入一個(gè)包含已知的HBsAg濃度樣品(來(lái)自1.10)的微管中，然后將帶感應(yīng)電極的微管放入熱混合器中并在37±1℃下不斷混合15分鐘。
1.17．當(dāng)完成1.16時(shí)，將感應(yīng)電極從包含樣品的微管中移開，并放入包含膠乳綴合的小鼠IgG之羊多克隆抗體的微管中(來(lái)自1.12)，然后放入旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)器中并在室溫下連續(xù)混合5分鐘。
1.18．當(dāng)完成1.17時(shí)，將感應(yīng)電極從微管移開，在0.01M磷酸鹽緩沖溶液中沖洗3-5秒，并將每個(gè)電極放入充滿工作緩沖溶液N°1的微量滴定板的澆口窩中。
1.19．將感應(yīng)電極和參比電極連接到與PC控制的測(cè)量裝置相連的支架的電觸點(diǎn)上，并將該支架固定在充滿N°1工作緩沖溶液微量滴定板澆口窩的上方。
1.20．啟動(dòng)常規(guī)軟件，并用來(lái)記錄30秒的時(shí)間感應(yīng)電極電勢(shì)相對(duì)于參比電極電勢(shì)的毫伏數(shù)。
1.21．完成1.20后，以類似于在1.19所述的方式，將該支架固定在充滿N°2工作緩沖溶液的微量滴定板澆口窩之上。
1.22．啟動(dòng)常規(guī)軟件，并用來(lái)記錄100秒的時(shí)間感應(yīng)電極電勢(shì)相對(duì)于參比電極電勢(shì)變化的毫伏數(shù)。
1.23．使用常規(guī)軟件，計(jì)算該感應(yīng)電極的本底電勢(shì)和最后電勢(shì)之差δ的毫伏數(shù)。
1.24．使用在1.10過(guò)程中制備的已知濃度的HBsAg樣品，順序重復(fù)在1.19-1.21中所述的操作。
1.25．將在1.24步驟所得的結(jié)果，用常規(guī)軟件繪制“δ對(duì)樣品中HBsAg的濃度”曲線(圖10)，并根據(jù)該曲線測(cè)定該感應(yīng)電極系統(tǒng)絕對(duì)靈敏度的下閾。
實(shí)施例2HBsAg測(cè)定；競(jìng)爭(zhēng)性分析；樣品-稀釋性樣本；受體-生物素化單克隆小鼠抗HBsAg；競(jìng)爭(zhēng)分子-標(biāo)記的羊多克隆抗小鼠免疫免疫球蛋白G；電荷標(biāo)記物-膠乳。
2.1．進(jìn)行在1.1-1.5中所述的過(guò)程。
2.2．用于吡咯電化學(xué)聚合的溶液按如下制備將2.5ml新蒸餾的吡咯和0.05g的SDS溶于20.0ml去離子水中。
2.3．聚吡咯膜按如下方法由電化學(xué)沉積形成將200μl的電化學(xué)聚合溶液放入微量滴定板的澆口窩中；將連接到電壓穩(wěn)定器上的電極、鉑絲和半微參比電極浸入該澆口窩中；相對(duì)于參比電極的電極電勢(shì)的循環(huán)掃描在+800至+2200mV范圍內(nèi)，掃描速率100mV/秒；參照用連接到電壓穩(wěn)定器相應(yīng)輸出的X-Y圖表記錄儀記錄的伏-安曲線，和用連接到電壓穩(wěn)定器的相應(yīng)輸出的積分器和圖表記錄儀記錄的通過(guò)電極的總電量，監(jiān)測(cè)聚吡咯膜形成的過(guò)程；當(dāng)聚吡咯膜達(dá)到規(guī)定厚度時(shí)(電勢(shì)掃描循環(huán)數(shù)6；通過(guò)該電極的總電量約為750mC)，停止該過(guò)程。
2.4．將涂有聚吡咯膜的感應(yīng)電極從澆口窩處移走，用去離子水沖洗，隨后用0.01M磷酸鹽緩沖溶液(pH值7.4)沖洗，并放入含300μl存儲(chǔ)溶液的微管中，在+4℃下儲(chǔ)存。
2.5．重復(fù)在2.1-2.4中所述的過(guò)程，以得到需要數(shù)量的感應(yīng)電極。
2.6．將磷酸鹽緩沖片溶解在200ml的去離子水中，并用所得溶液溶解1.0mg抗生蛋白鏈菌素，配制抗生蛋白鏈菌素溶液。
2.7．按如下步驟將抗生蛋白鏈菌素結(jié)合至覆在感應(yīng)電極的聚吡咯膜的表面上將抗生蛋白鏈菌素溶液等分至200μl并置于微管中；將涂有聚吡咯膜的感應(yīng)電極從存儲(chǔ)緩沖溶液中移開，將每個(gè)電極放入帶抗生蛋白鏈菌素溶液的微管中，并在+4℃下溫育18小時(shí)；將感應(yīng)電極從包含抗生蛋白鏈菌素溶液的微管中移出，用0.01M的磷酸鹽緩沖溶液洗滌，并將每個(gè)電極放入存儲(chǔ)緩沖溶液中，然后在+4℃下儲(chǔ)存。
2.8．一系列已知濃度的HBsAg樣品如1.10中所述制備。
2.9．將0.1ml合適滴定量的生物素化HBsAg之小鼠單克隆抗體溶液加到19.9ml的0.01M磷酸鹽緩沖溶液中。在旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)器中完全混合，然后以200μl等分至微管中。
2.10．將0.1ml合適滴定量的標(biāo)記(綴合膠乳)小鼠IgG之羊多克隆抗體的溶液加到19.9ml的0.01M磷酸鹽緩沖溶液中，在軌道式混合器中完全混合，然后以200μl等分至微管中。
2.11．工作緩沖溶液N°1如1.13中的描述配制。
2.12．工作緩沖溶液N°2如1.14中的描述配制。
2.13．將涂有含結(jié)合抗生蛋白鏈菌素的聚吡咯膜的感應(yīng)電極從存儲(chǔ)緩沖溶液中移出，并將每個(gè)電極放入包含生物素化的HBsAg之小鼠單克隆抗體溶液的微管中，并在室溫下溫育10分鐘。
2.14．當(dāng)完成2.13時(shí)，將感應(yīng)電極從包含生物素化抗體溶液的微管中移開。并將每個(gè)電極放入包含已知的HBsAg濃度樣品的微管中(來(lái)自步驟2.8)，然后將帶感應(yīng)電極的微管放入熱混合器中并在37±1℃下連續(xù)混合15分鐘。
2.15．當(dāng)完成2.14時(shí)，將感應(yīng)電極從包含樣品的微管中移出，并放入包含膠乳綴合小鼠IgG之羊多克隆抗體的微管中(來(lái)自步驟2.10)，然后放入旋轉(zhuǎn)的搖動(dòng)器中，并在室溫下連續(xù)混合5分鐘。
2.16．當(dāng)完成2.15時(shí)，將感應(yīng)電極從微管移出，在0.01M磷酸鹽緩沖溶液中沖洗3-5秒，并將每個(gè)電極放入充滿工作緩沖溶液N°1的微量滴定板的澆口窩中。
2.17．將感應(yīng)電極和參比電極連接到與PC控制的測(cè)量?jī)x器相連的支架的電觸點(diǎn)上，并將該支架固定在裝有N°1工作緩沖溶液微量滴定板澆口窩的上方，以使該感應(yīng)電極和參比電極浸入該溶液中。
2.18．啟動(dòng)該常規(guī)軟件，并用來(lái)記錄30秒的時(shí)間感應(yīng)電極電勢(shì)相對(duì)于參比電極電勢(shì)的毫伏數(shù)。
2.19．完成2.18后，以類似于在2.17中所述的方式，將該支架定位在充滿N°2工作緩沖溶液的微量滴定板澆口窩之上。
2.20．該常規(guī)軟件用來(lái)記錄100秒的時(shí)間感應(yīng)電極電勢(shì)相對(duì)于參比電極電勢(shì)變化的毫伏數(shù)。
2.21．使用該常規(guī)軟件，計(jì)算該感應(yīng)電極的本底電勢(shì)和最后電勢(shì)之差(δ)的毫伏數(shù)。
2.22．使用在2.8步驟中制備的已知濃度的HBsAg樣品，順序重復(fù)在2.17-2.20中所述的操作。
2.23．將步驟2.22所得的結(jié)果，使用該常規(guī)軟件繪制“δ對(duì)樣品中HBsAg濃度”的校準(zhǔn)曲線。
2.24．將若干HBsAg-陽(yáng)性的血清樣品(包含一種未知濃度的HBsAg)在預(yù)先解凍的牛血清中分別連續(xù)稀釋，以制備一系列稀釋倍數(shù)為10、100、1000、5000和10000的樣品。將分成200μl等分的每種稀釋液放入分開的微管中。
2.25．使用在2.13-2.21中所述的步驟測(cè)定每一稀釋液的HBsAg濃度，使用這些結(jié)果和在步驟2.23中所得的校準(zhǔn)曲線，計(jì)算在血清樣品中初始的(未稀釋的)HBsAg濃度(圖11)。
實(shí)施例3抗白蛋白抗體測(cè)定；競(jìng)爭(zhēng)性分析法；樣品-白蛋白的兔多克隆抗體；受體-生物素化的牛血清白蛋白；競(jìng)爭(zhēng)分子-標(biāo)記的白蛋白之兔多克隆抗體；電荷標(biāo)記物-膠乳。
3.1．進(jìn)行在1.1-1.3中所述的過(guò)程。
3.2．牛血清白蛋白(BSA)按1.4.中所述進(jìn)行生物素化。將所得生物素化的BSA溶液等分成小包裝(約10μl)并在+4℃儲(chǔ)存。
3.3．按1.5中所述的步驟，使牛白蛋白的兔多克隆抗體與膠乳微球體綴合。將所得的標(biāo)記抗體溶液等分成小包裝(約5μl)，并在+4℃儲(chǔ)存。
3.4．如2.2.中所述配制吡咯的電化學(xué)聚合溶液。
3.5．如在2.3中所述電化學(xué)沉積形成聚吡咯膜。
3.6．將涂有聚吡咯膜的感應(yīng)電極從澆口窩處移走，用去離子水沖洗，隨后用0.01M磷酸鹽緩沖溶液(pH值7.4)沖洗，并放入含300μl存儲(chǔ)溶液的微管中，在+4℃下儲(chǔ)存。
3.7．重復(fù)在3.1-3.6中所述的過(guò)程，得到需要數(shù)量的感應(yīng)電極。
3.8．抗生蛋白鏈菌素的溶液如2.6中所述配制。
3.9．如2.7中所述，抗生蛋白鏈菌素被結(jié)合于覆蓋感應(yīng)電極的聚吡咯膜的表面上。
3.10．一系列已知的濃度的未標(biāo)記的牛白蛋白之兔多克隆的抗體制備如下購(gòu)買的牛白蛋白之兔多克隆抗體在500倍過(guò)量的0.01M磷酸鹽緩沖溶液中在+4℃下透析過(guò)夜；將所得牛白蛋白之兔多克隆抗體的0.01M磷酸鹽緩沖溶液順序用0.01M磷酸鹽緩沖溶液以10、20、50、100、1000和5000的稀釋倍數(shù)稀釋；將每一稀釋樣品的200μl等分溶液分別放入微管中。
3.11．將0.8ml生物素化BSA的適當(dāng)稀釋溶液加到19.2ml的0.01M磷酸鹽緩沖溶液中，在旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)器中完全混合，將每一稀釋樣品的200μl等分溶液分別放入微管中。
3.12．將0.1ml合適滴定量的標(biāo)記(膠乳綴合的，如上所述)的牛白蛋白之兔多克隆抗體的溶液加到19.9ml的0.01M磷酸鹽緩沖溶液中，在軌道式混合器中完全混合，然后以200μl等分至微管中。
3.13．工作緩沖溶液N°1配制如下將一磷酸鹽緩沖片溶解于200ml的去離子水中；將0.37gKCl溶于所得溶液中。
3.14．工作緩沖溶液N°2如1.14中所述配制。
3.15．將涂有含結(jié)合抗生蛋白鏈菌素的聚吡咯膜的感應(yīng)電極從存儲(chǔ)緩沖溶液中移開，并將每個(gè)電極放入一個(gè)含有200μl生物素化BSA的溶液(來(lái)自步驟3.11)的微管中，并在室溫下溫育25分鐘。
3.16．當(dāng)完成3.15時(shí)，將感應(yīng)電極從包含生物素化BSA的溶液的微管中移開，并將每個(gè)電極放入一個(gè)包含已知濃度的未標(biāo)記的牛白蛋白之兔多克隆抗體樣品的微管中，然后將帶感應(yīng)電極的微管放入熱混合器中，并在37±1℃下連續(xù)混合25分鐘。
3.17．當(dāng)完成3.16時(shí)，將感應(yīng)電極從包含樣品的微管中移開，并轉(zhuǎn)入包含膠乳綴合的牛白蛋白之兔多克隆抗體(來(lái)自步驟3.12)的微管中，然后放入旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)器中，并在室溫下連續(xù)混合10分鐘。
3.18．當(dāng)完成3.17時(shí)，將感應(yīng)電極從微管中移開，在0.01M磷酸鹽緩沖溶液中沖洗3-5秒，并將每個(gè)電極放入裝有工作緩沖溶液N°1微量滴定板的澆口窩。
3.19．將感應(yīng)電極和參比電極連接到與基于PC的測(cè)量?jī)x器相連支架的電觸點(diǎn)上，并將該支架定位在充滿N°1工作緩沖溶液微量滴定板澆口窩的上方，以使感應(yīng)電極和參比電極浸入該溶液中。
3.20．啟動(dòng)常規(guī)軟件用來(lái)記錄100秒的時(shí)間感應(yīng)電極電勢(shì)相對(duì)于參比電極電勢(shì)的毫伏數(shù)。
3.21．當(dāng)完成3.20時(shí)，以類似于在3.19所述的方式，將該支架定位在充滿N°2工作緩沖溶液的微量滴定板澆口窩之上。
3.22．啟動(dòng)該常規(guī)軟件用來(lái)記錄200秒的時(shí)間感應(yīng)電極電勢(shì)相對(duì)于參比電極電勢(shì)變化的毫伏數(shù)。
3.23．使用該常規(guī)軟件，通過(guò)感應(yīng)電極電勢(shì)變化對(duì)參比電極電勢(shì)的所述曲線，計(jì)算(積分)面積S2。
3.24．用在3.10過(guò)程中用已知濃度的未標(biāo)記的牛白蛋白之兔多克隆抗體制備的樣品，順序重復(fù)在3.19-3.23中所述的操作。
3.25．基于步驟3.24所得的結(jié)果，使用常規(guī)軟件繪制“S2對(duì)樣品中未標(biāo)記的牛白蛋白之兔多克隆抗體的濃度”的校準(zhǔn)曲線。
實(shí)施例4HBsAg測(cè)定；夾層結(jié)構(gòu)分析法；樣品-已知HBsAg濃度的樣品；受體-生物素化的HBsAg之小鼠單克隆抗體；標(biāo)記的HBsAg之小鼠單克隆抗體；標(biāo)記物-過(guò)氧化酶。
4.1．進(jìn)行在1.1-1.4中所述的過(guò)程。
4.2．用于吡咯電化學(xué)聚合的溶液如2.2中所述制備。
4.3．聚吡咯膜如在2.3中所述由電化學(xué)沉積形成。
4.4．將涂有聚吡咯膜的感應(yīng)電極從澆口窩處移走，用去離子水沖洗，隨后用0.01M磷酸鹽緩沖溶液(pH值7.4)沖洗，并放入含300μl存儲(chǔ)溶液的微管中，將其在+4℃下儲(chǔ)存。
4.5．重復(fù)在4.1-4.4中所述的過(guò)程，得到需要數(shù)量的感應(yīng)電極。
4.6．抗生蛋白鏈菌素的溶液如2.6中所述配制。
4.7．如2.7中所述，將抗生蛋白鏈菌素結(jié)合于覆在該感應(yīng)電極的聚吡咯膜的表面上。
4.8．一系列已知HBsAg濃度的樣品如1.10中所述制備。
4.9．將0.2ml合適滴定量的生物素化的HBsAg之小鼠單克隆抗體的溶液加到19.8ml的0.01M磷酸鹽緩沖溶液中，在一種旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)器中完全混合，然后以200μl等分至微管中。
4.10．將5ml預(yù)先解凍的牛血清加到15ml的0.01M磷酸鹽緩沖溶液中，0.4ml合適滴定量的購(gòu)買的過(guò)氧化綴合HBsAg之小鼠單克隆抗體的溶液加到19.6ml的產(chǎn)物溶液中，將其在旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)器中完全混合，并以200μl等分至微管中。
4.11．通過(guò)在200ml的去離子水中溶解磷酸鹽緩沖片配制N°1工作緩沖溶液。
4.12．工作緩沖溶液N°2配制如下將一片鄰-苯二胺二氫氯化物片和一片尿素過(guò)氧化氫/緩沖片溶于20ml的去離子水中；將0.1ml所得的溶液加至19.9ml的0.01M磷酸鹽緩沖溶液中，在旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)器中完全混合，放入不透明玻璃容器中在+4℃下儲(chǔ)存，直到開始測(cè)試。
4.13．將涂有含結(jié)合抗生蛋白鏈菌素的聚吡咯膜的感應(yīng)電極從存儲(chǔ)緩沖溶液中移開，并將每個(gè)電極放入包含200μl生物素化的HBsAg之小鼠單克隆抗體溶液(來(lái)自步驟4.9)的微管中，并在室溫下溫育5分鐘。
4.14．當(dāng)完成4.13時(shí)，將感應(yīng)電極從包含生物素化抗體的溶液的微管中移開，并將放入包含已知的HBsAg濃度樣品的微管中(來(lái)自步驟4.8)，然后將帶感應(yīng)電極的微管放入熱混合器中并在37±1℃下連續(xù)混合10分鐘。
4.15．當(dāng)完成4.14時(shí)，將感應(yīng)電極從包含樣品的微管中移開，并放入包含過(guò)氧化酶-綴合HBsAg之小鼠單克隆抗體的微管中(來(lái)自步驟4.10)，然后放入旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)器中并在室溫下連續(xù)混合5分鐘。
4.16．當(dāng)完成4.15時(shí)，將感應(yīng)電極從微管移開，在0.01M磷酸鹽緩沖溶液中沖洗3-5秒，并將每個(gè)電極放入充滿工作緩沖溶液N°1的微量滴定板的澆口窩中。
4.17．將感應(yīng)電極和參比電極連接到與基于PC的測(cè)量?jī)x器相連的支架的電觸點(diǎn)上，并將該支架定位在充滿N°1工作緩沖溶液微量滴定板澆口窩的上方，以使感應(yīng)電極和參比電極浸入該溶液中。
4.18．啟動(dòng)該常規(guī)軟件，并用來(lái)記錄50秒的時(shí)間感應(yīng)電極電勢(shì)相對(duì)于參比電極電勢(shì)的毫伏數(shù)。
4.19．完成4.18后，以類似于在4.17中所述的方式，將該支架定位在充滿N°2工作緩沖溶液的微量滴定板澆口窩之上。
4.20．用該常規(guī)軟件記錄100秒的時(shí)間感應(yīng)電極電勢(shì)相對(duì)于參比電極電勢(shì)變化的毫伏數(shù)。
4.21．使用該常規(guī)軟件，計(jì)算該感應(yīng)電極的本底電勢(shì)和最后電勢(shì)之差(δ)。
4.22．使用在4.8步驟中制備的已知濃度的HBsAg樣品，順序重復(fù)在4.17-4.21中所述的操作。
4.23．基于在步驟4.22所得的結(jié)果，使用該常規(guī)軟件繪制“δ相對(duì)于樣品中HBsAg濃度”的校準(zhǔn)曲線。
4.24．如2.24中所述，制備一系列稀釋的血清樣品。
4.25．使用在4.13-4.21步驟中所述的步驟測(cè)定在4.24中所制備每個(gè)稀釋樣品的HBsAg濃度，使用這些結(jié)果加之在步驟4.23中所得的校準(zhǔn)曲線，計(jì)算在血清樣品中原有的(未沖淡的)HBsAg濃度。
實(shí)施例5HBsAg測(cè)定；夾層結(jié)構(gòu)分析法；樣品-已知HBsAg濃度的樣品；受體-生物素化的HBsAg之小鼠單克隆抗體；標(biāo)記的HBsAg之小鼠單克隆抗體；標(biāo)記物-過(guò)氧化酶；“順序分析”。
5.1．進(jìn)行在1.1-1.4中所述的過(guò)程。
5.2．用于吡咯電化學(xué)聚合的溶液如2.2中所述制備。
5.3．聚吡咯膜如在2.3中所述由電化學(xué)沉積形成。
5.4．將涂有聚吡咯膜的感應(yīng)電極從澆口窩處移走，用去離子水沖洗，隨后用0.01M磷酸鹽緩沖溶液(pH值7.4)沖洗，并放入含300μl存儲(chǔ)溶液的微管中，將其在+4℃下儲(chǔ)存。
5.5．重復(fù)在5.1-5.4中所述的過(guò)程，得到需要數(shù)量的感應(yīng)電極。
5.6．抗生蛋白鏈菌素的溶液如2.6中所述配制。
5.7．如2.7中所述，將抗生蛋白鏈菌素結(jié)合于覆在該感應(yīng)電極的聚吡咯膜的表面上。
5.8．一系列已知HBsAg濃度的樣品如1.10中所述制備。
5.9．將0.5ml生物素化的HBsAg之小鼠單克隆抗體的溶液加到19.5ml的0.01M磷酸鹽緩沖溶液中，在一種旋轉(zhuǎn)的搖動(dòng)器中完全混合，然后以200μl等分至微管中。
5.10．將1.7ml過(guò)氧化酶標(biāo)記的HBsAg之小鼠單克隆抗體的溶液加到18.3ml的0.01M磷酸鹽緩沖溶液中，在一種軌道式搖動(dòng)器中完全混合，然后以200μl等分至微管中。
5.11．工作緩沖溶液N°1如4.11中所述的配制。
5.12．工作緩沖溶液N°2如4.22中所述的配制。
5.13．將涂有含結(jié)合抗生蛋白鏈菌素的聚吡咯膜的感應(yīng)電極從存儲(chǔ)緩沖溶液中移開，并將每個(gè)電極放入包含生物素化的HBsAg之小鼠單克隆抗體溶液(來(lái)自步驟5.9)的微管中，并在室溫下溫育5分鐘。
5.14．與步驟5.13同時(shí)，將10μl適當(dāng)?shù)味抠?gòu)買的過(guò)氧化酶-標(biāo)記的HBsAg之小鼠單克隆抗體加到包含已知的HBsAg濃度樣品的樣品中(來(lái)自步驟5.8)，首先從樣品中移走10μl，然后將微管和樣品放入熱混合器中，并在37±1℃下保持5-10分鐘。
5.15．當(dāng)完成5.13-5.14時(shí)，將感應(yīng)電極從包含生物素化抗體的溶液中移開，并放入包含已知HBsAg濃度樣品的微管中(來(lái)自步驟5.14)，然后將其放入熱混合器中，并在37±1℃下連續(xù)混合15分鐘。
5.16．當(dāng)完成5.15時(shí)，將感應(yīng)電極從微管移開，在0.01M磷酸鹽緩沖溶液中沖洗3-5秒，并將每個(gè)電極放入充滿工作緩沖溶液N°1的微量滴定板的澆口窩中。
5.17．將感應(yīng)電極和參比電極連接到與基于PC的測(cè)量?jī)x器相連的支架的電觸點(diǎn)上，并將該支架定位在充滿N°1工作緩沖溶液微量滴定板澆口窩的上方，以使感應(yīng)電極和參比電極浸入該溶液中。
5.18．啟動(dòng)該常規(guī)軟件，并用來(lái)開始記錄50秒的時(shí)間感應(yīng)電極電勢(shì)相對(duì)于參比電極電勢(shì)的毫伏數(shù)。
5.19．當(dāng)完成5.18時(shí)，以類似于在5.17中所述的方式，將該支架定位在充滿N°2工作緩沖溶液的微量滴定板澆口窩之上。
5.20．用該常規(guī)軟件記錄200秒的時(shí)間感應(yīng)電極電勢(shì)相對(duì)于參比電極電勢(shì)變化的毫伏數(shù)。
5.21．使用該常規(guī)軟件，通過(guò)感應(yīng)電極電勢(shì)變化對(duì)參比電極電勢(shì)的所述曲線，計(jì)算S2(積分的)面積。
5.22．使用在步驟5.8中制備的已知濃度的HBsAg樣品，順序重復(fù)在5.17-5.21中所述的操作。
5.23．基于在步驟5.22所得的結(jié)果，使用該常規(guī)軟件繪制“S2對(duì)樣品中HBsAg濃度”的校準(zhǔn)曲線。
5.24．如2.24中所述，制備一系列稀釋的血清樣品。
5.25．使用在5.13-5.21步驟中所述的步驟，測(cè)定在5.24中所制備每個(gè)稀釋樣品的HBsAg濃度，使用這些結(jié)果加之在步驟5.23中所得的校準(zhǔn)曲線，計(jì)算在血清樣品中原有的(未沖淡的)HBsAg濃度。
實(shí)施例6HBsAg測(cè)定；夾層結(jié)構(gòu)分析法；樣品-已知HBsAg濃度的樣品；受體-生物素化的HBsAg之小鼠單克隆抗體；標(biāo)記的HBsAg之小鼠單克隆抗體；標(biāo)記物-過(guò)氧化酶；“一鍋分析法”。
6.1．進(jìn)行在1.1-1.4中所述的過(guò)程。
6.2．用于吡咯電化學(xué)聚合的溶液如2.2中所述制備。
6.3．聚吡咯膜如在2.3中所述由電化學(xué)沉積形成。
6.4．將涂有聚吡咯膜的感應(yīng)電極從澆口窩處移走，用去離子水沖洗，隨后用0.01M磷酸鹽緩沖溶液(pH值7.4)沖洗，并放入含300μl存儲(chǔ)溶液的微管中，將它在+4℃下儲(chǔ)存。
6.5．重復(fù)在6.1-6.4中所述的過(guò)程，得到需要數(shù)量的感應(yīng)電極。
6.6．抗生蛋白鏈菌素的溶液如2.6中所述配制。
6.7．如2.7中所述，將抗生蛋白鏈菌素結(jié)合于覆在該感應(yīng)電極的聚吡咯膜的表面上。
6.8．一系列已知HBsAg濃度的樣品如1.10中所述制備。
6.9．將2.5ml合適滴定量的生物素化的HBsAg之小鼠單克隆抗體的溶液加到17.5ml的0.01M磷酸鹽緩沖溶液中，在一種旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)器中完全混合，然后以200μl等分至微管中。
6.10．將1.7ml適當(dāng)?shù)味康馁?gòu)買的過(guò)氧化酶標(biāo)記的HBsAg之小鼠單克隆抗體的溶液加到18.3ml的0.01M磷酸鹽緩沖溶液中，在一種旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)器中完全混合，然后以200μl等分至微管中。
6.11．工作緩沖溶液N°1如4.11中所述的配制。
6.12．工作緩沖溶液N°2如4.22中所述的配制。
6.13．將10μl生物素化的HBsAg之小鼠單克隆抗體的溶液(來(lái)自步驟6.9)和10μl過(guò)氧化酶標(biāo)記的HBsAg之小鼠單克隆抗體(來(lái)自步驟6.10)加到每個(gè)包含已知HBsAg濃度的樣品中，首先從樣品中移走20μl，然后將微管和樣品放入熱混合器中，并在37±1℃下連續(xù)混合溫育10分鐘，。
6.14．當(dāng)完成6.13時(shí)，將涂有含結(jié)合抗生蛋白鏈菌素的聚吡咯膜的感應(yīng)電極從存儲(chǔ)緩沖溶液中移開，并將每個(gè)電極放入包含已知的HBsAg濃度樣品的微管中(來(lái)自步驟6.13)，然后放入熱混合器中，并在37±1℃下連續(xù)混合5分鐘。
6.15．當(dāng)完成6.14時(shí)，將感應(yīng)電極從微管移開，在0.01M磷酸鹽緩沖溶液中沖洗3-5秒，并將每個(gè)電極放入充滿工作緩沖溶液N°1的微量滴定板的澆口窩中。
6.16．將感應(yīng)電極和參比電極連接到與基于PC的測(cè)量?jī)x器相連的支架的電觸點(diǎn)上，并將該支架定位在充滿N°1工作緩沖溶液微量滴定板澆口窩的上方，以使感應(yīng)電極和參比電極浸入該溶液中。
6.17．啟動(dòng)該常規(guī)軟件，并用來(lái)開始記錄100秒的時(shí)間感應(yīng)電極電勢(shì)相對(duì)于參比電極電勢(shì)的毫伏數(shù)。
6.18．當(dāng)完成6.17時(shí)，以類似于在6.16中所述的方式，將該支架定位在充滿N°2工作緩沖溶液的微量滴定板澆口窩之上。
6.19．用該常規(guī)軟件記錄200秒的時(shí)間感應(yīng)電極電勢(shì)相對(duì)于參比電極電勢(shì)變化的毫伏數(shù)。
6.20．使用該常規(guī)軟件，通過(guò)感應(yīng)電極電勢(shì)變化對(duì)參比電極電勢(shì)的所述曲線，計(jì)算S2(積分的)面積。
6.21．使用在步驟6.8中制備的已知濃度的HBsAg樣品，順序重復(fù)在6.16-6.20中所述的操作。
6.22．基于在步驟6.21所得的結(jié)果，使用該常規(guī)軟件繪制“S2對(duì)樣品HBsAg濃度”的校準(zhǔn)曲線。
6.23．如2.24中所述，制備一系列稀釋的血清樣品。
6.24．使用在6.13-6.21步驟中所述的過(guò)程，測(cè)定在6.23中所制備的每個(gè)稀釋樣品的HBsAg濃度，使用這些結(jié)果加之在步驟6.22中所得的校準(zhǔn)曲線，計(jì)算在血清樣品中原有的(未沖淡的)HBsAg濃度。
實(shí)施例7胰島素測(cè)定；競(jìng)爭(zhēng)分析法；樣品-已知胰島素濃度的樣品；受體-生物素化的胰島素之小鼠單克隆抗體；競(jìng)爭(zhēng)分子-標(biāo)記的多克隆山羊抗小鼠免疫球蛋白G抗體；標(biāo)記物-脲酶。
7.1．進(jìn)行在1.1-1.3中所述的過(guò)程。
7.2．胰島素之小鼠單克隆抗體的生物素化如1.4中所述進(jìn)行。將該生物素化的胰島素之小鼠單克隆抗體的產(chǎn)物溶液分成小容量等分(約10μl)，并在+4℃下儲(chǔ)存。
7.3．用于吡咯電化學(xué)聚合的溶液如2.2中所述制備。
7.4．聚吡咯膜如在2.3中所述由電化學(xué)沉積形成。
7.5．將涂有聚吡咯膜的感應(yīng)電極從澆口窩處移走，用去離子水沖洗，隨后用0.01M磷酸鹽緩沖溶液(pH值7.4)沖洗，并放入含300μl存儲(chǔ)溶液的微管中，將其在+4℃下儲(chǔ)存。
7.6．重復(fù)在7.4-7.5中所述的過(guò)程，得到需要數(shù)量的感應(yīng)電極。
7.7．抗生蛋白鏈菌素的溶液如2.6中所述配制。
7.8．如2.7中所述，將抗生蛋白鏈菌素結(jié)合于覆在該感應(yīng)電極的聚吡咯膜的表面上。
7.9．一系列已知胰島素濃度的樣品制備如下將1.12g氯化鉀和1.0g牛血清白蛋白溶于100ml的去離子水中；將100μl冷凍的胰島素溶于200μl所得的溶液中；將所得的胰島素溶液順序地用含氯化鉀的去離子水和牛血清白蛋白以10、20、50、100、1000、5000和10000倍的稀釋倍數(shù)稀釋；每一稀釋樣品放入分開的200μl等分微管中。
7.10．將0.8ml合適滴定量的生物素化的胰島素之小鼠單克隆抗體的溶液加到19.2ml的0.01M磷酸鹽緩沖溶液中，在一種旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)器中完全混合，然后以200μl等分至微管中。
7.11．將0.02ml購(gòu)買的脲酶綴合的小鼠免疫球蛋白G之山羊多克隆抗體加到19.98ml的0.01M磷酸鹽緩沖溶液中，在一種旋轉(zhuǎn)的搖動(dòng)器中完全混合，并以200μl等分至微管中。
7.12．通過(guò)在200ml的去離子水中溶解2.24g氯化鈉配制N°1工作緩沖溶液。
7.13．通過(guò)在20mlN°1工作緩沖溶液中溶解0.012g尿素配制工作緩沖溶液N°2。
7.14．將涂有含結(jié)合抗生蛋白鏈菌素的聚吡咯膜的感應(yīng)電極從存儲(chǔ)緩沖溶液中移開，并將每個(gè)電極放入含生物素化的胰島素之小鼠單克隆抗體溶液(來(lái)自步驟7.10)的微管中，并溫育10分鐘。
7.15．當(dāng)完成7.14時(shí)，將感應(yīng)電極從包含生物素化抗體的溶液中移開，并放入包含已知胰島素濃度樣品的微管中(來(lái)自步驟7.9)，然后放入熱混合器中，并在37±1℃下連續(xù)混合15分鐘，。
7.16．當(dāng)完成7.15時(shí)，將感應(yīng)電極從包含樣品的微管中移開，并放入包含脲酶綴合小鼠免疫球蛋白G之山羊多克隆抗體溶液(來(lái)自步驟7.11)的微管中，然后放入旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)器中，并在室溫下連續(xù)混合10分鐘。
7.17．當(dāng)完成7.16時(shí)，將感應(yīng)電極從微管移開，在含氯化鉀的去離子水和牛血清白蛋白中沖洗3-5秒，并將每個(gè)電極放入充滿工作緩沖溶液N°1的微量滴定板的澆口窩中。
7.18．將感應(yīng)電極和參比電極連接到與基于PC的測(cè)量裝置相連的支架的電觸點(diǎn)上，并將該支架定位在充滿N°1工作緩沖溶液微量滴定板澆口窩的上方。
7.19．啟動(dòng)該常規(guī)軟件，并用來(lái)開始記錄200秒的時(shí)間感應(yīng)電極電勢(shì)相對(duì)于參比電極電勢(shì)的毫伏數(shù)。
7.20．當(dāng)完成7.19時(shí)，以類似于在7.18中所述的方式，將該支架定位在充滿N°2工作緩沖溶液的微量滴定板澆口窩之上。
7.21．用該常規(guī)軟件記錄400秒的時(shí)間感應(yīng)電極電勢(shì)相對(duì)于參比電極電勢(shì)變化的毫伏數(shù)。
7.22．使用該常規(guī)軟件，通過(guò)感應(yīng)電極電勢(shì)變化對(duì)參比電極電勢(shì)的所述曲線，計(jì)算S2(積分的)面積。
7.23．使用在步驟7.9中制備的已知濃度的胰島素樣品，順序重復(fù)在7.18-7.22中所述的操作。
7.24．基于在步驟7.23所得的結(jié)果，使用該常規(guī)軟件繪制“S2對(duì)樣品中胰島素濃度”的校準(zhǔn)曲線。
實(shí)施例8核酸雜化反應(yīng)。
8.1．進(jìn)行在1.1-1.3中所述的過(guò)程。
8.2．用于吡咯電化學(xué)聚合的溶液如2.2中所述制備。
8.3．聚吡咯膜如在2.3中所述由電化學(xué)沉積形成。
8.4．將涂有聚吡咯膜的感應(yīng)電極從澆口窩處移走，用去離子水沖洗，隨后用0.01M磷酸鹽緩沖溶液(pH值7.4)沖洗，并放入含300μl存儲(chǔ)溶液的微管中，將其在+4℃下儲(chǔ)存。
8.5．重復(fù)在8.3-8.4中所述的過(guò)程，得到需要數(shù)量的感應(yīng)電極。
8.6．通過(guò)在200ml的去離子水中溶解一片磷酸鹽緩沖片，并在所得溶液中溶解5.0mg抗生蛋白鏈菌素，配制抗生蛋白鏈菌素溶液。
8.7．如下所述，將抗生蛋白鏈菌素結(jié)合于覆在該感應(yīng)電極的聚吡咯膜的表面上將抗生蛋白鏈菌素溶液等分至300μl微管中；將涂有聚吡咯膜的感應(yīng)電極從存儲(chǔ)緩沖溶液中移開，將每個(gè)電極放入包含抗生蛋白鏈菌素溶液的微管中，并在+4℃下溫育24小時(shí)；將感應(yīng)電極從包含抗生蛋白鏈菌素溶液的微管中移開，用0.01M的磷酸鹽緩沖溶液沖洗，并用含0.01％疊氮化鈉的去離子水沖洗兩次，然后將每個(gè)感應(yīng)電極放入存儲(chǔ)緩沖溶液中，并在+4℃下儲(chǔ)存。
8.8．單股DNA探針溶液制備如下將1mg冷凍的生物素化雙股DNA探針制劑(長(zhǎng)度約1kb)溶于1ml去離子水中，并將所得的溶液放入微管中；將包含DNA探針溶液的微管放入水浴中，將其在+100℃下溫育5-8分鐘；將包含DNA探針溶液的微管轉(zhuǎn)入含有冰的容器中，將其迅速冷卻至0℃；然后將包含DNA探針溶液的微管轉(zhuǎn)入冰箱中，將其在-20℃下冷凍儲(chǔ)存。
8.9．與生物素化的DNA探針互補(bǔ)的單股DNA的溶液制備如下將10mg冷凍的與生物素化DNA探針互補(bǔ)的雙股DNA制劑溶于1ml去離子水中，并將所得的溶液放入微管中；將包含DNA溶液的微管放入水浴中，將其在+100℃下溫育5-8分鐘；將包含DNA溶液的微管轉(zhuǎn)入含有冰的容器中，將其迅速冷卻至0℃；然后將包含DNA溶液的微管轉(zhuǎn)入冰箱中，將其在-20℃下冷凍儲(chǔ)存。
8.10．與生物素化DNA探針?lè)腔パa(bǔ)的單股DNA溶液如8.9所述制備。
8.11．工作緩沖溶液N°1配制如下將一片磷酸鹽緩沖片溶解于200ml的去離子水中；將2g牛血清白蛋白、0.37g氯化鉀和0.12g檸檬酸鈉溶于所得的溶液中。
8.12．工作緩沖溶液N°2配制如下將一片磷酸鹽緩沖片溶解于200ml的去離子水中；將2g牛血清白蛋白和1g葡聚糖硫酸鈉溶于所得的溶液中。
8.13．將涂有含結(jié)合抗生蛋白鏈菌素的聚吡咯膜的感應(yīng)電極從包含0.01％疊氮化鈉和0.15M氯化鉀的去離子水移開，并將20μl預(yù)先解凍并溫至室溫的單股DNA探針溶液涂敷至每個(gè)感應(yīng)電極工作表面上。
8.14．當(dāng)完成8.13時(shí)，將感應(yīng)電極放入可調(diào)濕度室，在+44℃下溫育60分鐘。
8.15．當(dāng)完成8.14時(shí)，將感應(yīng)電極從可調(diào)濕度室移開，并將每個(gè)電極放入包含200μl用于DNA雜化反應(yīng)的初始緩沖溶液的微管中，將它們?cè)?4℃下保持一個(gè)短時(shí)期。(DNA雜化反應(yīng)緩沖液可以是本領(lǐng)域已知的任何標(biāo)準(zhǔn)雜化反應(yīng)緩沖液，參見Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY，美國(guó))8.16．包含與生物素化DNA探針互補(bǔ)的單股DNA的樣品制備如下將10mg冷凍的來(lái)自鮭魚精液DNA制劑溶于10ml用于DNA雜化反應(yīng)的初始緩沖溶液中；將10μl預(yù)先解凍并溫至室溫的與生物素化DNA-探針互補(bǔ)的單股DNA溶液加至0.99ml所得的溶液中；將所得溶液在旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)器中完全混合，并等分至200μl微管中。
8.17．包含與生物素化DNA探針?lè)腔パa(bǔ)的單股DNA樣品制備如下將10mg來(lái)自鮭魚精液的冷凍DNA制劑溶于10ml用于DNA雜化反應(yīng)的初始緩沖溶液中；將100μl預(yù)先解凍并溫至室溫的與生物素化DNA探針?lè)腔パa(bǔ)的單股DNA溶液加至0.9ml所得的溶液中；將所得溶液在旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)器中完全混合，并等分至200μl微管中。
8.18．將半數(shù)含被固定的生物素化單股DNA探針的感應(yīng)電極從包含用于DNA雜化反應(yīng)初始的緩沖溶液的微管中移開，并放入含有包含DNA互補(bǔ)至生物素化DNA-探針的樣品的微管中；然后將包含感應(yīng)電極的微管放入熱混合器中，并在+42℃下連續(xù)混合120分鐘。
8.19．當(dāng)完成8.18時(shí)，將感應(yīng)電極從微管移開，在工作緩沖溶液N°1中沖洗3-5秒，并將每個(gè)電極放入充滿工作緩沖溶液N°1的澆口窩中。
8.20．將感應(yīng)電極和參比電極連接到與基于PC的測(cè)量裝置相連的支架的電觸點(diǎn)上，并將該支架定位在充滿N°1工作緩沖溶液微量滴定板澆口窩的上方，以使感應(yīng)電極和參比電極浸入該溶液中。
8.21．啟動(dòng)該常規(guī)軟件，并用來(lái)開始記錄200秒的時(shí)間感應(yīng)電極電勢(shì)相對(duì)于參比電極電勢(shì)的毫伏數(shù)。
8.22．當(dāng)完成8.21時(shí)，以類似于在8.20中所述的方式，將該支架定位在充滿N°2工作緩沖溶液的微量滴定板的澆口窩之上。
8.23．使用該常規(guī)軟件記錄600秒的時(shí)間感應(yīng)電極電勢(shì)相對(duì)于參比電極電勢(shì)變化的毫伏數(shù)。
8.24．使用該常規(guī)軟件，計(jì)算本底電勢(shì)和最后電勢(shì)之差(δ)。
8.25．使用在步驟4.8中制備的與生物素化DNA探針互補(bǔ)的DNA樣品，順序重復(fù)在8.20-8.24中所述的操作。
8.26．將另外半數(shù)含被固定的生物素化單股DNA探針的感應(yīng)電極從包含用于DNA雜化反應(yīng)初始的緩沖溶液的微管中移開，并放入含有包含與生物素化DNA探針?lè)腔パa(bǔ)的DNA樣品的微管中，然后將包含感應(yīng)電極的微管放入熱混合器中，并在+42℃下連續(xù)混合120分鐘。
8.27．使用包含與生物素化DNA探針?lè)腔パa(bǔ)的DNA樣品，順序重復(fù)在8.19-8.25中所述的過(guò)程。
8.28．基于在8.19-8.26中所得的結(jié)果，使用該常規(guī)軟件繪制由與生物素化DNA探針互補(bǔ)和非互補(bǔ)的DNA樣品得到的δ值的統(tǒng)計(jì)分布曲線。
實(shí)施例9地高新測(cè)定；競(jìng)爭(zhēng)分析法；樣品-已知濃度的地高新樣品；受體-生物素化的地高新之小鼠單克隆抗體；競(jìng)爭(zhēng)分子-標(biāo)記的地高新；標(biāo)記物-過(guò)氧化酶。
9.1．進(jìn)行在1.1-1.4中所述的過(guò)程。
9.2．用于吡咯電化學(xué)聚合的溶液如2.2中所述制備。
9.3．聚吡咯膜如在2.3中所述由電化學(xué)沉積形成。
9.4．將涂有聚吡咯膜的感應(yīng)電極從澆口窩處移走，用去離子水沖洗，隨后用0.01M磷酸鹽緩沖溶液(pH值7.4)沖洗，并放入含300μl存儲(chǔ)溶液的微管中，將其在+4℃下儲(chǔ)存。
9.5．重復(fù)在9.1-9.4中所述的過(guò)程，得到需要數(shù)量的感應(yīng)電極。
9.6．抗生蛋白鏈菌素的溶液如2.6中所述配制。
9.7．如2.7中所述，將抗生蛋白鏈菌素結(jié)合于覆在該感應(yīng)電極的聚吡咯膜的表面上。
9.8．一系列已知地高新濃度的樣品制備如下將250ml乙醇加至750ml的去離子水中；將250mg地高新溶于1000ml所得的乙醇溶液中；將一片磷酸鹽緩沖片和10.0g牛血清白蛋白溶解于200ml的去離子水中；在含牛血清白蛋白的PBS溶液中，將所得的地高新溶液以250、2500、25000、50000、125000、250000和500000倍的稀釋比例順序稀釋；將每一稀釋樣品放入分開的200μl等分微管中。
9.9．將20μl購(gòu)買的生物素綴合地高新之小鼠單克隆抗體的溶液加到19.98ml的0.01M磷酸鹽緩沖溶液(pH值7.4)中，在旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)器中完全混合，然后以200μl等分至微管中。
9.10．根據(jù)前述規(guī)程，參見[21]，將地高新用過(guò)氧化酶綴合。將過(guò)氧化酶標(biāo)記的地高新的產(chǎn)物溶液(最后濃度約0.1mg/ml)用0.01M磷酸鹽緩沖溶液(pH值7.4)以10倍的稀釋比稀釋，然后將其分為小體積等分(10μl)，并在+4℃下儲(chǔ)存。
9.11．工作緩沖溶液N°1如4.11中所述的配制。
9.12．工作緩沖溶液N°2如4.22中所述的配制。
9.13．將涂有含結(jié)合抗生蛋白鏈菌素的聚吡咯膜的感應(yīng)電極從存儲(chǔ)緩沖溶液中移開，并將每個(gè)電極放入包含生物素綴合的地高新之小鼠單克隆抗體溶液(來(lái)自步驟9.9)的微管中，并在室溫下溫育10分鐘。
9.14．與步驟9.13同時(shí)，首先從樣品中移出2μl，然后將2μl過(guò)氧化酶標(biāo)記的地高新溶液(來(lái)自步驟9.10)加至每一已知的地高新濃度(來(lái)自步驟9.8)的樣品中。
9.15．當(dāng)完成9.13和9.14后，將感應(yīng)電極轉(zhuǎn)入包含過(guò)氧化酶標(biāo)記的和未標(biāo)記的地高新的試管(來(lái)自步驟9.14)；將這些試管加感應(yīng)電極放入熱混合器中，并在37±1℃下連續(xù)混合10分鐘。
9.16．當(dāng)完成9.15時(shí)，將感應(yīng)電極從微管移開，在0.01M的PBS中沖洗3-5秒，并將每個(gè)電極放入充滿工作緩沖溶液N°1的微量滴定板的澆口窩中。
9.17．將感應(yīng)電極和參比電極連接到與基于PC的測(cè)量?jī)x器相連的支架的電觸點(diǎn)上，并將該支架定位在充滿N°1工作緩沖溶液的微量滴定板澆口窩之上，以使感應(yīng)電極和參比電極浸入該工作緩沖溶液中。
9.18．啟動(dòng)該常規(guī)軟件，并用來(lái)開始記錄30秒的時(shí)間感應(yīng)電極電勢(shì)相對(duì)于參比電極電勢(shì)的毫伏數(shù)。
9.19．當(dāng)完成9.18時(shí)，以類似于在9.17中所述的方式，將該支架定位在充滿N°2工作緩沖溶液的微量滴定板澆口窩之上。
9.20．用該常規(guī)軟件記錄100秒的時(shí)間感應(yīng)電極電勢(shì)相對(duì)于參比電極電勢(shì)變化的毫伏數(shù)。
9.21．使用該常規(guī)軟件，通過(guò)感應(yīng)電極電勢(shì)變化對(duì)參比電極電勢(shì)的所述曲線，計(jì)算S2(積分的)面積。
9.22．使用在步驟9.8中制備的已知濃度的地高新樣品，順序重復(fù)在9.17-9.21中所述的操作。
9.23．基于在步驟9.22所得的結(jié)果，使用該常規(guī)軟件繪制“S2對(duì)樣品中地高新濃度”的校準(zhǔn)曲線。
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權(quán)利要求
1．一種用于被分析物的電化學(xué)檢測(cè)方法的感應(yīng)電極，該感應(yīng)電極包括一種涂有含銜接分子的導(dǎo)電聚合物層的導(dǎo)電電極，這些銜接分子選自抗生物素蛋白質(zhì)、抗生蛋白鏈菌素、抗-FITC抗體和一種能夠特異性結(jié)合在至少一類被固定在其中或被吸附在其上的受體分子上的分子。
2．如權(quán)利要求1的感應(yīng)電極，其中的導(dǎo)電聚合物層已經(jīng)摻雜大離子半徑的陰離子。
3．如權(quán)利要求1或2的感應(yīng)電極，其中的銜接分子是抗生物素蛋白質(zhì)或者抗生蛋白鏈菌素，經(jīng)由生物素/抗生物素蛋白質(zhì)或者生物素/抗生蛋白鏈菌素結(jié)合相互作用能與所述被分析物結(jié)合的生物素化受體附著其上。
4．如權(quán)利要求1或2的感應(yīng)電極，其中的銜接分子是蛋白質(zhì)A或者蛋白質(zhì)G，經(jīng)由蛋白質(zhì)A/抗體或者蛋白質(zhì)G/抗體結(jié)合相互作用能與所述被分析物結(jié)合的抗體附著其上。
5．如權(quán)利要求1或2的感應(yīng)電極，其中的銜接分子是外源凝集素，經(jīng)由外源凝集素/碳水化合物結(jié)合相互作用能與所述被分析物結(jié)合的受體附著其上。
6．如權(quán)利要求1或2的感應(yīng)電極，其中的銜接分子是抗-FITC抗體，經(jīng)由FITC/抗-FITC結(jié)合相互作用能與所述被分析物結(jié)合的受體附著其上。
7．一種包括權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的感應(yīng)電極和參比電極的電極裝置。
8．一種用于電化學(xué)檢測(cè)被分析物方法的感應(yīng)電極的制備方法，該感應(yīng)電極包括一種涂有含銜接分子的導(dǎo)電聚合物層的導(dǎo)電電極，這些銜接分子選自抗生物素蛋白質(zhì)、抗生蛋白鏈菌素、抗-FITC抗體和一種能夠特異性結(jié)合在至少一類被固定在其中的受體分子上的分子，該方法包括下列步驟(a)制備一種含有導(dǎo)電聚合物單體和銜接分子的電化學(xué)聚合溶液，(b)將欲涂制的電極浸入該電化學(xué)聚合溶液中，和(c)在該電極和該電化學(xué)聚合溶液之間施加一種循環(huán)電勢(shì)，通過(guò)該溶液中聚合物的電化學(xué)合成涂制該電極，所施加的循環(huán)電勢(shì)至少為一個(gè)全循環(huán)。
9．一種用于電化學(xué)檢測(cè)被分析物方法的感應(yīng)電極的制備方法，該感應(yīng)電極包括一種涂有含銜接分子的導(dǎo)電聚合物層的導(dǎo)電電極，這些銜接分子選自抗生物素蛋白質(zhì)、抗生蛋白鏈菌素、抗-FITC抗體和一種能夠特異性結(jié)合在至少一類被固定在其中或被吸附在其上的受體分子上的分子，該方法包括下列步驟(a)制備一種含有導(dǎo)電聚合物單體的電化學(xué)聚合溶液，(b)將欲涂制的電極浸入該電化學(xué)聚合溶液中，(c)在該電極和該電化學(xué)聚合溶液之間施加一種循環(huán)電勢(shì)，通過(guò)該溶液中聚合物的電化學(xué)合成來(lái)涂制該電極，所施加的循環(huán)電勢(shì)至少為一個(gè)全循環(huán)；和(d)將該涂制電極與一種含有銜接分子的溶液接觸，以使該銜接分子被吸附在該電極的導(dǎo)電聚合物涂層上。
10．如權(quán)利要求8或9的方法，其中的銜接分子是抗生物素蛋白質(zhì)或者抗生蛋白鏈菌素，以及該方法更進(jìn)一步包括將該感應(yīng)電極與一種含受體分子的溶液接觸，該受體分子與生物素綴合，以使該生物素化的受體經(jīng)由生物素/抗生物素蛋白質(zhì)或者生物素/抗生蛋白鏈菌素結(jié)合相互作用，與被固定在或被吸附至該電極的導(dǎo)電聚合物涂層上的抗生物素蛋白質(zhì)或抗生蛋白鏈菌素分子結(jié)合。
11．如權(quán)利要求10的方法，其中的受體分子是單克隆抗體、多克隆的抗體、抗體碎片、抗體仿制品、嵌合抗體病毒溶菌產(chǎn)物、重組蛋白質(zhì)、合成肽、激素、激素受體、單股核酸、低分子量分子、與半抗原蛋白質(zhì)綴合的化學(xué)化合物、細(xì)菌碎片、植物或者動(dòng)物細(xì)胞、外源凝聚素、糖蛋白或者碳水化合物。
12．如權(quán)利要求8或9的方法，其中的銜接分子是蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G或者外源凝集素。
13．如權(quán)利要求8至12中任一項(xiàng)的方法，其中的循環(huán)電勢(shì)具有一種鋸齒形式。
14．如權(quán)利要求8至13中任一項(xiàng)的方法，其中所施加的循環(huán)電勢(shì)至少為2個(gè)循環(huán)。
15．如權(quán)利要求8至14中任一項(xiàng)的方法，其中施加在電極的循環(huán)電勢(shì)的峰值小于或等于+2伏特。
16．如權(quán)利要求8至13中任一項(xiàng)的方法，其中具有大離子半徑的陰離子的鹽類被加至該電化學(xué)聚合溶液中。
17．如權(quán)利要求16的方法，其中的鹽類是十二烷基硫酸鈉或者葡聚糖硫酸鈉。
18．如權(quán)利要求8至17中任一項(xiàng)的方法，其中的導(dǎo)電聚合物單體是苯胺、噻吩、呋喃或吡咯。
19．一種樣品中的被分析物的電化學(xué)檢測(cè)方法，該方法包括下列步驟(a)提供一種具有導(dǎo)電聚合物涂層的感應(yīng)電極，該涂層含有被固定于其中或者被吸附于其上的能夠與樣品中待測(cè)的目的被分析物結(jié)合的受體；(b)將該感應(yīng)電極與含有樣品的試液接觸，以使該目的被分析物與所述被固定或者被吸附的受體結(jié)合；(c)將該感應(yīng)電極與一種含有次級(jí)受體的溶液接觸，該次級(jí)受體能夠與該被分析物在空間上不同于被固定或者被吸附的受體的結(jié)合位點(diǎn)的位點(diǎn)上結(jié)合，并且該次級(jí)受體與一種電荷標(biāo)記物綴合；(d)當(dāng)處理過(guò)的感應(yīng)電極與參比電極浸入一種電解液中時(shí)，監(jiān)測(cè)兩者之間的電勢(shì)差；和(e)在恒定pH值下，該電解液的離子強(qiáng)度改變之后，監(jiān)測(cè)該感應(yīng)電極與參比電極之間的電勢(shì)差。
20．一種樣品中的被分析物的電化學(xué)檢測(cè)方法，該方法包括下列步驟(a)提供一種具有導(dǎo)電聚合物涂層的感應(yīng)電極，該涂層具有被固定于其中或者被吸附于其上的能夠與樣品中目的待測(cè)的被分析物結(jié)合的受體；(b)將該感應(yīng)電極與含有樣品的試液接觸，以使該被分析物與所述被固定的或者被吸附的受體結(jié)合；(c)將該感應(yīng)電極與一種含有競(jìng)爭(zhēng)分子的溶液接觸，該競(jìng)爭(zhēng)分子能夠與被固定的或者被吸附的受體結(jié)合，并與一種電荷標(biāo)記物綴合；(d)當(dāng)處理過(guò)的感應(yīng)電極與參比電極浸入一種電解液中時(shí)，監(jiān)測(cè)兩者之間的電勢(shì)差；和(e)在恒定pH值下，改變電解液的離子強(qiáng)度之后，監(jiān)測(cè)感應(yīng)電極與參比電極之間的電勢(shì)差。
21．如權(quán)利要求19或20的方法，其中的電荷標(biāo)記物具有下列性質(zhì)(ⅰ)它在(d)部分電解液的pH值下攜帶凈電荷；和(ⅱ)在恒定pH值下，該電荷數(shù)量隨該電解液離子強(qiáng)度的變化而變化。
22．如權(quán)利要求21的方法，其中的電荷標(biāo)記物是二茂鐵、膠乳微球體或金。
23．如權(quán)利要求19至22中任一項(xiàng)的方法，其中的步驟(b)和(c)是通過(guò)將感應(yīng)電極與已經(jīng)加入與電荷標(biāo)記物綴合的次級(jí)受體或者競(jìng)爭(zhēng)分子的試液接觸而同時(shí)進(jìn)行。
24．一種樣品中的被分析物的電化學(xué)檢測(cè)方法，該方法包括下列步驟(a)提供一種具有導(dǎo)電聚合物涂層的感應(yīng)電極，該涂層含有被固定于其中或者被吸附于其上的能夠與樣品中目的待測(cè)被分析物結(jié)合的受體；(b)將該感應(yīng)電極與含有樣品的試液接觸，以使所述被分析物與所述被固定的或者被吸附的受體結(jié)合；(c)將該感應(yīng)電極與一種含有次級(jí)受體的溶液接觸，該次級(jí)受體能夠與該被分析物在空間上不同于與被固定或者被吸附的受體的結(jié)合位點(diǎn)的位點(diǎn)上結(jié)合，并且該次級(jí)受體與一種酶綴合；(d)當(dāng)處理過(guò)的感應(yīng)電極與參比電極浸入一種電解液中時(shí)，監(jiān)測(cè)兩者之間的電勢(shì)差；和(e)在暴露于一種含有所述酶的底物的電解液之后，監(jiān)測(cè)該感應(yīng)電極與參比電極之間的電勢(shì)差。
25．一種樣品中的被分析物的電化學(xué)檢測(cè)方法，該方法包括下列步驟(a)提供一種具有導(dǎo)電聚合物涂層的感應(yīng)電極，該涂層含有被固定于其中或者被吸附于其上的能夠與樣品中的目的待測(cè)被分析物結(jié)合的受體；(b)將該感應(yīng)電極與含有樣品的試液接觸，以使該目的被分析物與所述被固定的或者被吸附的受體結(jié)合；(c)將該感應(yīng)電極與一種含有競(jìng)爭(zhēng)分子的溶液接觸，該競(jìng)爭(zhēng)分子能夠與被固定的或者被吸附的受體結(jié)合，并與一種酶綴合；(d)當(dāng)處理過(guò)的感應(yīng)電極與參比電極浸入一種電解液中時(shí)，監(jiān)測(cè)兩者之間的電勢(shì)差；和(e)在暴露于一種含有所述酶的底物的電解液之后，監(jiān)測(cè)該感應(yīng)電極與參比電極之間的電勢(shì)差。
26．如權(quán)利要求24或者25的方法，其中的酶能夠?qū)⒁环N直接影響感應(yīng)電極的導(dǎo)電聚合物涂層的氧化還原組成的底物轉(zhuǎn)換成一種對(duì)所述導(dǎo)電聚合物涂層的氧化還原組成沒(méi)有可測(cè)影響的產(chǎn)物。
27．如權(quán)利要求26的方法，其中的酶是過(guò)氧化酶。
28．如權(quán)利要求24或者25的方法，其中的酶能夠?qū)⒁环N對(duì)感應(yīng)電極的導(dǎo)電聚合物涂層的氧化還原組成沒(méi)有可檢測(cè)影響的底物轉(zhuǎn)換成能夠直接或者間接影響所述導(dǎo)電聚合物涂層的氧化還原組成的產(chǎn)物。
29．如權(quán)利要求28的方法，其中能夠間接影響導(dǎo)電聚合物膜的氧化還原組成的產(chǎn)物導(dǎo)致(e)部分電解液的pH值變化。
30．如權(quán)利要求29的方法，其中的酶是脲酶。
31．如權(quán)利要求24或者25的方法，其中酶能夠?qū)⒁环N對(duì)感應(yīng)電極的導(dǎo)電聚合物涂層的氧化還原組成沒(méi)有可檢測(cè)作用的底物轉(zhuǎn)換成第二種酶的底物，第二種酶的作用是產(chǎn)生一種直接或者間接影響該導(dǎo)電聚合物涂層的氧化還原組成的第二種產(chǎn)物。
32．如權(quán)利要求24至31中任一項(xiàng)的方法，其中的步驟(b)和(c)是通過(guò)將感應(yīng)電極與已經(jīng)添加與一種酶標(biāo)記物綴合的次級(jí)受體或者競(jìng)爭(zhēng)分子的試液接觸而同時(shí)進(jìn)行。
33．如權(quán)利要求19至32中任一項(xiàng)的方法，其中能夠與待檢測(cè)的被分析物結(jié)合的受體是被生物素化的并附著于經(jīng)由生物素/抗生物素蛋白質(zhì)或者生物素/抗生蛋白鏈菌素結(jié)合相互作用固定在或者吸附至感應(yīng)電極的導(dǎo)電聚合物涂層上的抗生物素蛋白質(zhì)或者抗生蛋白鏈菌素上。
34．如權(quán)利要求19至32中任一項(xiàng)的方法，其中能夠與待檢測(cè)的被分析物結(jié)合的受體是抗體，并附著于經(jīng)由蛋白質(zhì)A/抗體或者蛋白質(zhì)G/抗體結(jié)合相互作用固定在或者吸附至感應(yīng)電極的導(dǎo)電聚合物涂層上的蛋白質(zhì)A或者蛋白質(zhì)G上。
35．如權(quán)利要求19至32中任一項(xiàng)的方法，其中能夠與待檢測(cè)的被分析物結(jié)合的受體包含糖部分，并附著于經(jīng)由外源凝集素/糖結(jié)合相互作用固定在或者吸附至感應(yīng)電極的導(dǎo)電聚合物涂層上的外源凝集素上。
36．如權(quán)利要求19至32中任一項(xiàng)的方法，其中能夠與待檢測(cè)的被分析物結(jié)合的受體是用FITC標(biāo)記的，并附著于經(jīng)由FITC/抗-FITC結(jié)合相互作用固定在或者吸附至感應(yīng)電極的導(dǎo)電聚合物涂層上的抗-FITC抗體上。
37．如權(quán)利要求19至36中任一項(xiàng)的方法，其中的感應(yīng)電極是根據(jù)權(quán)利要求8至18中任一項(xiàng)的方法生產(chǎn)的。
38．如權(quán)利要求33的方法，其中的步驟(b)和(c)與接觸含有生物素化受體的感應(yīng)電極的步驟同時(shí)進(jìn)行，該含有生物素化受體的感應(yīng)電極是通過(guò)將感應(yīng)電極與已經(jīng)添加與電荷標(biāo)記物或者酶綴合的生物素化受體和次級(jí)受體或者競(jìng)爭(zhēng)分子的試液接觸而得到的。
39．如權(quán)利要求19的方法，其中的次級(jí)受體是多克隆抗體或者單克隆抗體。
40．如權(quán)利要求19至39中任一項(xiàng)的方法，其中的生物學(xué)流體如全血、血清、淋巴、尿、唾液、腦脊髓液流體和精液被用作試液。
41．一種樣品中的被分析物的電化學(xué)檢測(cè)方法，該方法包括下列步驟(a)提供一種含有導(dǎo)電聚合物涂層的導(dǎo)電電極的感應(yīng)電極，該涂層含有被固定在其中或者被吸附在其上的抗生物素蛋白質(zhì)或者抗生蛋白鏈菌素分子，經(jīng)由生物素/抗生物素蛋白質(zhì)或者生物素/抗生蛋白鏈菌素相互作用而附著于受體分子上，被附著于受體分子上的抗生物素蛋白質(zhì)或者抗生蛋白鏈菌素分子能夠與待測(cè)的被分析物結(jié)合；(b)將該感應(yīng)電極與含有樣品的試液接觸，以使該目的被分析物與所述被固定或者被吸附的受體分子結(jié)合；(c)當(dāng)將感應(yīng)電極與參比電極浸入電解液之中時(shí)，監(jiān)測(cè)感應(yīng)電極相對(duì)于參比電極的電勢(shì)差；和(d)在恒定pH值下，改變電解液的離子強(qiáng)度或者組成之后，監(jiān)測(cè)該感應(yīng)電極相對(duì)于參比電極的電勢(shì)差。
42．權(quán)利要求41的方法，其中的待測(cè)被分析物是核酸，并且受體分子是低聚核苷酸。
全文摘要
一種用于電化學(xué)檢測(cè)被分析物方法的感應(yīng)電極,該感應(yīng)電極包括一種涂有含一種被固定在其中或被吸附在其上的銜接分子的導(dǎo)電聚合物膜的導(dǎo)電電極,這些銜接分子選自抗生物素蛋白質(zhì)、抗生蛋白鏈菌素、抗－FITC抗體。通過(guò)該銜接分子與對(duì)被分析物特異性受體的結(jié)合,可將該感應(yīng)電極制成對(duì)受測(cè)被分析物特異性的。
文檔編號(hào)G01N33/535GK1325490SQ9981254
公開日2001年12月5日 申請(qǐng)日期1999年8月24日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月24日
發(fā)明者D·A·法馬科夫斯基, Y·Y·米拉諾夫斯基, V·R·徹爾卡索夫, Y·S·比爾于科夫, O·萊奧納多瓦 申請(qǐng)人:傳感技術(shù)有限公司