一種硫酸鏈霉素的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品安全分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種硫酸鏈霉素的檢測(cè)方法，尤其涉及一種基于有機(jī)小分子焚光探針的硫酸鏈霉素的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]硫酸鏈霉素(Streptomycin sulfate)是常用的氨基糖苷類廣譜抗生素，但其具有一定的毒副作用，主要表現(xiàn)為對(duì)腦神經(jīng)、聽覺及腎臟的損害。因此，許多國(guó)家和機(jī)構(gòu)都明確規(guī)定了該類藥物在食品中的最大殘留限量(MRLs)。
[0003]目前，硫酸鏈霉素常用檢測(cè)方法主要為高效液相色譜法(HPLC)、色譜-質(zhì)譜串聯(lián)(LC-MS)和酶聯(lián)免疫吸附分析法。硫酸鏈霉素儀器分析法準(zhǔn)確度高，但其操作繁瑣，而且需進(jìn)行衍生化，費(fèi)用高，耗時(shí)耗力，不適于大量樣品的快速分析。硫酸鏈霉素的高靈敏度快速檢測(cè)多基于競(jìng)爭(zhēng)性免疫檢測(cè)技術(shù)如酶聯(lián)免疫分析法。例如專利CN 103645322 A，其涉及一種硫酸鏈霉素的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其包含抗原、硫酸鏈霉素單克隆抗體、和化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，該試劑盒能實(shí)現(xiàn)硫酸鏈霉素的檢測(cè)，但此種檢測(cè)方法的核心材料抗體通常制備周期長(zhǎng)，難以獲得，且對(duì)溫度、濕度、溶劑性質(zhì)等環(huán)境條件要求苛刻。
[0004]熒光探針與待測(cè)目標(biāo)物能夠發(fā)生高特異性的化學(xué)反應(yīng)，并產(chǎn)生高靈敏度的熒光信號(hào)，可用于定性定量檢測(cè)微量或痕量待側(cè)目標(biāo)物。基于熒光探針的硫酸鏈霉素快速檢測(cè)具有快速、靈敏高效、高效便捷、成本低等特點(diǎn)，適用于食品中硫酸鏈霉素的快速篩查。由此可見，開發(fā)一種基于探針熒光的硫酸鏈霉素的檢測(cè)方法，是食品安全分析技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展方向，同時(shí)可大幅度提高分析效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的之一在于提出一種硫酸鏈霉素的檢測(cè)方法，其具有快速便捷、靈敏高效、成本低等特點(diǎn)，適用于食品中硫酸鏈霉素的快速篩查。
[0006]為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0007]一種硫酸鏈霉素的檢測(cè)方法，所述方法通過使用化學(xué)熒光探針與硫酸鏈霉素發(fā)生特異性反應(yīng)來(lái)進(jìn)行。
[0008]具體地，所述的硫酸鏈霉素的檢測(cè)方法包括以下步驟:
[0009]I)將化學(xué)熒光探針溶于有機(jī)溶劑制得溶液A，堿溶于水制得溶液B ;
[0010]2)將硫酸鏈霉素溶于水配置一系列不同濃度的硫酸鏈霉素水溶液，制得標(biāo)準(zhǔn)溶液；
[0011]3)將溶液A和溶液B分別與不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液混合、振蕩，靜置分層后移取水層，測(cè)量熒光強(qiáng)度，建立熒光強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度間的相關(guān)曲線；
[0012]4)將溶液A和溶液B與待測(cè)樣品溶液混合、振蕩，靜置分層后移取水層，測(cè)量熒光強(qiáng)度，與步驟3)所建立的曲線進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算樣品的硫酸鏈霉素含量。
[0013]不同于常規(guī)的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)，本方法無(wú)須使用抗原和抗體等物質(zhì)，所用的熒光探針為化學(xué)合成，簡(jiǎn)單易得，成本較低，對(duì)外界環(huán)境條件耐受程度高。優(yōu)選地，所述化學(xué)熒光探針為9，10-菲醌。
[0014]應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明所述的硫酸鏈霉素，包括硫酸鏈霉素的鹽形式。
[0015]在步驟I)中，所述有機(jī)溶劑為與水不相溶、密度比水小，且可以溶解所述化學(xué)熒光探針如9，10-菲醌的有機(jī)溶劑，優(yōu)選乙醚、乙酸乙醋、石油醚，特別優(yōu)選乙醚；
[0016]優(yōu)選地，所述溶液A為9，10-菲醌乙醚溶液，優(yōu)選地，所述溶液A濃度為500ppm，尤其優(yōu)選500ppm的9，10-菲醌乙醚溶液；
[0017]優(yōu)選地，所述堿為無(wú)機(jī)堿，優(yōu)選氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉，特別優(yōu)選氫氧化鈉；
[0018]優(yōu)選地，所述溶液B為濃度IN的堿溶液，尤其優(yōu)選IN氫氧化鈉水溶液。加入溶液B的目的在于中和硫酸鏈霉素中的酸部分，使得鏈霉素游離出來(lái)參與接下來(lái)的反應(yīng)。
[0019]在步驟2)中，所述標(biāo)準(zhǔn)溶液為8種不同濃度的硫酸鏈霉素水溶液；
[0020]優(yōu)選地，所述標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度范圍在Oppm-1OOppm之間，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度分別為 0ppm、0.01ppm、0.05ppm、0.2ppm、lppm、5ppm、25ppm、lOOppm。
[0021 ] 由于我國(guó)規(guī)定在動(dòng)物源食品中鏈霉素最大殘留限量為牛奶200ng/mL，雞肉、肝臟600ng/mL，腎1000ng/mL。因此該標(biāo)準(zhǔn)溶液的范圍可很好的覆蓋食品中鏈霉素的含量值，同時(shí)選取的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度值的分布有利于繪制熒光強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度間的相關(guān)曲線。
[0022]在步驟I)和2)中，所述水為去離子水，由于后續(xù)步驟將移取水層樣品進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)定，所用的水不能對(duì)熒光強(qiáng)度產(chǎn)生影響。
[0023]在步驟3)和步驟4)中，三種溶液混合后，硫酸鏈霉素以游離鏈霉素的形式與溶液A中的化學(xué)熒光探針發(fā)生特異性反應(yīng)，生產(chǎn)新的熒光產(chǎn)物，該產(chǎn)物易溶于水，進(jìn)入水層，而未結(jié)合的游離化學(xué)熒光產(chǎn)物仍停留在有機(jī)相，不會(huì)對(duì)測(cè)量結(jié)果產(chǎn)生影響。產(chǎn)物的熒光信號(hào)的強(qiáng)度與硫酸鏈霉素濃度呈正相關(guān)，因此通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)產(chǎn)物熒光信號(hào)的強(qiáng)度可以建立熒光強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度間的相關(guān)曲線，再對(duì)比待測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度，可計(jì)算樣品中硫酸鏈霉素的含量。
[0024]所述溶液A、溶液B和標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積比與所述溶液A、溶液B和待測(cè)樣品溶液的體積比相同，平行操作，以免水和有機(jī)溶劑的量對(duì)各種化合物的濃度產(chǎn)生影響，從而影響熒光強(qiáng)度的測(cè)量，優(yōu)選地，所述體積比為為5:1:4 ;
[0025]優(yōu)選地，所述振蕩的時(shí)間為30s，以使三種成分完全混勻并發(fā)生反應(yīng)，靜置直至水層和有機(jī)層完全清晰地分離，所需時(shí)間至少為Imin ;
[0026]優(yōu)選地，所述移取水層使用移液管，所移取的水層不能含有有機(jī)層，否則隨后測(cè)得的熒光強(qiáng)度將產(chǎn)生偏差；
[0027]優(yōu)選地，所述測(cè)量熒光強(qiáng)度在278nm下用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量，該波長(zhǎng)的光可激發(fā)產(chǎn)物釋放出熒光信號(hào)，可觀察到黃綠色的熒光。
[0028]作為一種可替代的實(shí)施方案，在使用熒光分光光度計(jì)測(cè)量待測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度之前，可先在360nm紫外燈下用肉眼觀察步驟4)所移取的水溶液是否有黃綠色熒光，以初步判斷待測(cè)樣品中是否含有硫酸鏈霉素。
[0029]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述硫酸鏈霉素的檢測(cè)方法包括以下步驟:
[0030]I)將9，10-菲醌溶于乙醚制得濃度為500ppm的溶液A，將氫氧化鈉溶于去離子水制得濃度為IN的溶液B ；
[0031]2)將硫酸鏈霉素溶于去離子水配置濃度分別為0ppm、0.01ppm、0.05ppm、0.2ppm、lppm、5ppm、25ppm、10ppm的硫酸鏈霉素水溶液，制得標(biāo)準(zhǔn)溶液；
[0032]3)將溶液A和溶液B分別與不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液按體積比5:1:4混合、振蕩30s，靜置lmin，分層后移取水層，在360nm下用熒光分光光度計(jì)測(cè)量熒光強(qiáng)度，建立熒光強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度間的相關(guān)曲線；
[0033]4)將溶液A和溶液B與待測(cè)樣品溶液按體積比5:1:4混合、振蕩30s，靜置lmin，分層后移取水層，在278nm下用熒光分光光度計(jì)測(cè)量熒光強(qiáng)度，與步驟3)所建立的曲線進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算樣品的硫酸鏈霉素含量。
[0034]需特別指出的是，本發(fā)明所述的硫酸鏈霉素檢測(cè)方法用于食品安全分析領(lǐng)域，在使用本發(fā)明所述方法之前，須對(duì)待測(cè)的食品進(jìn)行預(yù)處理，形成待測(cè)樣品溶液。所述樣品包括雞肉、肝臟、牛奶、奶粉和蜂蜜等本領(lǐng)域常需進(jìn)行硫酸鏈霉素檢測(cè)的食品。優(yōu)選地，在本發(fā)明中樣品預(yù)處理的方法包括提取和凈化:
[0035]I)提取:10g樣品均質(zhì)后與20mL 0.1 %磷酸溶液禍旋混合5min ；
[0036]2)凈化:米用SCX固相萃取柱(500mg/3cc)和C18固相萃取柱(500mg/6cc)雙柱凈化。
[0037]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述雙柱進(jìn)化的操作步驟為:a)活化SCX固相萃取柱:將5mL甲醇、5mL水加入SCX固相萃取柱，棄去流出液；b) SCX固相萃取柱上樣:將所述提取所得的樣品注入SCX固相萃取柱，棄去流出液；c)SCX固相萃取柱淋洗:依次用5mL 0.1%磷酸溶液、5mL水淋洗，流出液棄去；d)SCX固相萃取柱洗脫:30mL 0.2mol/L磷酸氫二鉀溶液(磷酸調(diào)節(jié)PH 8.0)，洗脫，收集洗脫液，用磷酸調(diào)節(jié)pH至2，得第一樣品洗脫液，用于C18固相萃取柱凈化；e)活化C18固相萃取柱:將5mL甲醇、5mL水加入C18固相萃取柱(500mg/6CC)，棄去流出液；f)C18固相萃取柱上樣:將所得的第一樣品洗脫液加入C18柱，棄去流出液；j)C18固相萃取柱淋洗:5mL 0.1 %磷酸溶液淋洗C18柱，棄去流出液，抽干C18柱，再用5mL甲基叔丁基醚+正己烷混合溶液(體積比=4:1)淋洗，棄去流出液；h) C18固相萃取柱洗脫:10mL甲醇洗脫，收集第二樣品洗脫液；i)重新溶解:35°C下將第二樣品洗脫液減壓蒸餾至干，使用ImL 2%甲醇-水定容，制得待測(cè)樣品溶液，使用本發(fā)明所述的硫酸鏈霉素檢測(cè)方法進(jìn)行分析。
[0038]本發(fā)明的另一目的還在于提供本發(fā)明所述的硫酸鏈霉素檢測(cè)方法在食品安全分析中的用途。其利用熒光探針與待測(cè)目標(biāo)物硫酸鏈霉素特異性反應(yīng)并生成新的熒光產(chǎn)物，提供了一種快速按檢測(cè)食品中硫酸鏈霉素的方法。由于上述反應(yīng)中，產(chǎn)物熒光信號(hào)的強(qiáng)度與硫酸鏈霉素濃度呈正相關(guān)，因此通過檢測(cè)產(chǎn)物熒光信號(hào)的強(qiáng)度可以對(duì)硫酸鏈霉素進(jìn)行定量檢測(cè)。
[0039]本發(fā)明的目的還在于提供化合物9，10-菲醌在食品安全分析中，作為化學(xué)熒光探針檢測(cè)硫酸鏈霉素的用途。該化合物為化學(xué)合成，資源豐富，較抗體等生物分子更容易獲得，且具有更好的穩(wěn)定性。
[0040]本發(fā)明使用的化學(xué)熒光探針的核心材料為化學(xué)合成，成本較低，對(duì)外界環(huán)境條件耐受程度高。所述硫酸鏈霉素檢測(cè)方法快速便捷、靈敏高效、成本低，無(wú)需進(jìn)行傳統(tǒng)方法的復(fù)雜流程及液相色譜、色譜質(zhì)譜聯(lián)用等大型儀器，一般人員均可操作，適用于食品中硫酸