一種尿液的處理方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及尿液檢測(cè)，尤其涉及的是，一種尿液的處理方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人們對(duì)新生兒遺傳代謝病檢測(cè)的日益重視，越來(lái)越多的方法、技術(shù)被用于檢測(cè)，其中，干尿?yàn)V紙片法是一種較為廣泛的應(yīng)用，其主要是利用濾紙片進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析檢測(cè)尿有機(jī)酸/氨基酸代謝產(chǎn)物的方法。該方法是將濾紙收集的尿液經(jīng)過(guò)洗脫、肟化反應(yīng)、萃取、甲基硅烷化衍生后采用氣相色譜儀-質(zhì)譜儀聯(lián)合對(duì)尿樣進(jìn)行檢測(cè)。氣相色譜-質(zhì)譜分析的方法，具有以下優(yōu)點(diǎn):有機(jī)酸/氨基酸代謝產(chǎn)物回收率高、重復(fù)性好，色譜雜峰少、不至污染色譜毛細(xì)管柱和質(zhì)譜離子源，定性/定量分析條件穩(wěn)定、樣本色譜峰分離效果良好，樣本分析時(shí)間短，適合高通量樣本篩查分析。
[0003]但是，干尿?yàn)V紙片法及其應(yīng)用技術(shù)主要包括以下幾項(xiàng)問(wèn)題。
[0004]1、采樣不規(guī)范:干尿?yàn)V紙片法采樣原理是通過(guò)濾紙片的吸附來(lái)吸取尿液，但往往會(huì)存在尿液吸取不足的現(xiàn)象，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果高低不等；
[0005]2、尿液晾干時(shí)間過(guò)長(zhǎng):使用5X5cm2干尿?yàn)V紙片大約可以吸取尿樣1.2ml，充分晾干需要約4小時(shí)，這樣使得醫(yī)護(hù)人員工作量大增；
[0006]3、容易受到污染:在晾干的過(guò)程中，要嚴(yán)格防止不同患兒尿片間的接觸和保證良好的室內(nèi)環(huán)境；
[0007]4、容易發(fā)霉:沒(méi)有經(jīng)過(guò)充分晾干的尿?yàn)V紙片，容易發(fā)霉，導(dǎo)致尿?yàn)V紙片上待測(cè)物質(zhì)分解，使檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。
[0008]5、洗脫率難以保證:在尿?yàn)V紙片復(fù)溶過(guò)程中，洗脫率沒(méi)辦法得到保證，尤其是一些吸附性強(qiáng)，難以洗脫的物質(zhì)；
[0009]6、定性準(zhǔn)確性下降:色譜柱在使用過(guò)程中，固定相不斷流失，導(dǎo)致柱效降低，保留時(shí)間漂移，造成定性準(zhǔn)確性下降。
[0010]因此，現(xiàn)有技術(shù)需要改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]為了解決干尿?yàn)V紙片法采樣不規(guī)范、尿液晾干時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、容易受到污染、容易發(fā)霉、洗脫率難以保證、定性準(zhǔn)確性下降等技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種新的尿液的處理方法。
[0012]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一種尿液的處理方法，其包括以下步驟:取若干原尿備用；加入尿素酶去除尿素；加入內(nèi)標(biāo)、定容；調(diào)整pH，加入鹽酸羥胺，反應(yīng)后中和；萃取，干燥后進(jìn)行衍生化反應(yīng)；進(jìn)行保留時(shí)間校準(zhǔn)。
[0013]優(yōu)選的，取含0.2毫克肌酐的原尿備用。
[0014]優(yōu)選的，加入尿素酶去除尿素時(shí)，靜置預(yù)設(shè)時(shí)間后加入內(nèi)標(biāo)。
[0015]優(yōu)選的，靜置20至60分鐘后加入內(nèi)標(biāo)。
[0016]優(yōu)選的，靜置30分鐘。
[0017]優(yōu)選的，調(diào)整pH至12±0.2。
[0018]優(yōu)選的，反應(yīng)后加入鹽酸中和。
[0019]優(yōu)選的，采用乙酸乙酯進(jìn)行萃取。
[0020]優(yōu)選的，采用雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺以及三甲基氯硅烷作為衍生化試劑。
[0021]優(yōu)選的，雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺與三甲基氯硅烷的比例為99:1。
[0022]采用上述方案，本發(fā)明采用原尿作為檢測(cè)對(duì)象，避免了干尿?yàn)V紙片法所導(dǎo)致的采樣不規(guī)范、尿液晾干時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、容易受到污染、容易發(fā)霉、洗脫率難以保證、定性準(zhǔn)確性下降等問(wèn)題，并且通過(guò)保留時(shí)間校準(zhǔn)，得到的中間結(jié)果適用于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法，具有很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1為本發(fā)明一實(shí)施例的示意圖；
[0024]圖2為本發(fā)明另一實(shí)施例的示意圖；
[0025]圖3為本發(fā)明一實(shí)施例的檢測(cè)流量控制示意圖；
[0026]圖4為本發(fā)明一實(shí)施例的保留時(shí)間對(duì)比示意圖；
[0027]圖5為本發(fā)明一實(shí)施例的根據(jù)正構(gòu)烷烴保留時(shí)間的漂移計(jì)算待測(cè)有機(jī)酸的漂移情況示意圖；
[0028]圖6為本發(fā)明一實(shí)施例的甲基丙二酸檢測(cè)結(jié)果示意圖；
[0029]圖7為本發(fā)明一實(shí)施例的尿黑酸檢測(cè)結(jié)果示意圖；
[0030]圖8為本發(fā)明一實(shí)施例的戊二酸檢測(cè)結(jié)果示意圖；
[0031]圖9為本發(fā)明一實(shí)施例的鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)結(jié)果示意圖；
[0032]圖10為本發(fā)明一實(shí)施例的苯丙酮酸等檢測(cè)結(jié)果示意圖；
[0033]圖11為本發(fā)明一實(shí)施例的異戊酰甘氨酸檢測(cè)結(jié)果示意圖；
[0034]圖12為本發(fā)明一實(shí)施例的支鏈氨基酸降解酶等檢測(cè)結(jié)果示意圖；
[0035]圖13為本發(fā)明一實(shí)施例的丙酸檢測(cè)結(jié)果示意圖；
[0036]圖14為本發(fā)明一實(shí)施例的多種?；o酶A羧化酶等檢測(cè)結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0037]為了便于理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。需要說(shuō)明的是，當(dāng)元件被表述“固定于”另一個(gè)元件，它可以直接在另一個(gè)元件上、或者其間可以存在一個(gè)或多個(gè)居中的元件。當(dāng)一個(gè)元件被表述“連接”另一個(gè)元件，它可以是直接連接到另一個(gè)元件、或者其間可以存在一個(gè)或多個(gè)居中的元件。本說(shuō)明書所使用的術(shù)語(yǔ)“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”以及類似的表述只是為了說(shuō)明的目的。
[0038]除非另有定義，本說(shuō)明書所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與屬于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本說(shuō)明書中在本發(fā)明的說(shuō)明書中所使用的術(shù)語(yǔ)只是為了描述具體的實(shí)施例的目的，不是用于限制本發(fā)明。本說(shuō)明書所使用的術(shù)語(yǔ)“和/或”包括一個(gè)或多個(gè)相關(guān)的所列項(xiàng)目的任意的和所有的組合。
[0039]如圖1所示，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例是，一種尿液的處理方法，其包括以下步驟:取若干原尿備用；加入尿素酶去除尿素；加入內(nèi)標(biāo)、定容；調(diào)整pH，加入鹽酸羥胺，反應(yīng)后中和；萃取，干燥后進(jìn)行衍生化反應(yīng)；進(jìn)行保留時(shí)間校準(zhǔn)。這樣，得到的樣品非常適用于后續(xù)進(jìn)行有機(jī)酸的檢測(cè)。
[0040]例如，一種尿液的處理方法，其包括以下步驟。
[0041]取若干原尿備用；優(yōu)選的，取含0.2毫克肌酐的原尿備用。原尿即原尿液或者簡(jiǎn)稱尿液，無(wú)需制成干尿?yàn)V紙，應(yīng)用簡(jiǎn)單、方便、快捷。例如，所述尿液包括新生兒尿液。優(yōu)選的，采用紫外分光光度法測(cè)定尿液中的肌酐含量，然后取含0.2毫克肌酐的原尿備用。優(yōu)選的，取若干原尿保溫備用；例如，其溫度保持在32至37攝氏度；優(yōu)選的，保溫備用時(shí)間小于24小時(shí)，例如，保溫備用時(shí)間小于20小時(shí)。又如，取含0.5毫克肌酐的原尿備用。
[0042]加入尿素酶去除尿素；加入內(nèi)標(biāo)、定容；優(yōu)選的，加入尿素酶去除尿素時(shí)，靜置預(yù)設(shè)時(shí)間后加入內(nèi)標(biāo)。優(yōu)選的，靜置20至60分鐘后加入內(nèi)標(biāo)。優(yōu)選的，靜置30分鐘后加入內(nèi)標(biāo)。優(yōu)選的，加入IKu的尿素酶；優(yōu)選的，加入尿素酶時(shí)充分振蕩；例如，采用自動(dòng)振動(dòng)器實(shí)現(xiàn)充分振蕩。為充分反應(yīng)，優(yōu)選的，充分振蕩后，在35°C至40°C條件下，靜置25至50分鐘去除尿素。優(yōu)選的，在37°C條件下，靜置30分鐘去除尿素。優(yōu)選的，內(nèi)標(biāo)包括3-羥基-2-苯基丙酸、十七烷酸和/或二十四烷。優(yōu)選的，加入30ul尿素酶，去除尿素后加入40ul內(nèi)標(biāo)，定容至2ml。
[0043]調(diào)整pH，加入鹽酸羥胺，反應(yīng)后中和；優(yōu)選的，調(diào)整pH至12±0.2±0.2 ;優(yōu)選的，調(diào)整pH至12。優(yōu)選的，反應(yīng)后加入鹽酸中和。優(yōu)選的，充分反應(yīng)后加入鹽酸中和。例如，加入濃度為lmol/L的鹽酸進(jìn)行中和。例如，中和至pH = 7.0。又如，加入濃度為37%的600ul鹽酸進(jìn)行中和，靜置或慢速攪拌10分鐘或者震蕩10分鐘。
[0044]萃取，干燥后進(jìn)行衍生化反應(yīng)；優(yōu)選的，采用乙酸乙酯進(jìn)行萃取。例如，使用6ml乙酸乙酯進(jìn)行萃取。優(yōu)選的，加入鹽酸中和至PH為6.8±0.2后加入乙酸乙酯進(jìn)行萃取。優(yōu)選的，在室溫下進(jìn)行萃取。優(yōu)選的，干燥后升溫進(jìn)行衍生化反應(yīng)，例如，升溫至70±3°C。例如，所述干燥采用氮吹干燥實(shí)現(xiàn)；優(yōu)選的，萃取之后，采用氮吹至干，然后進(jìn)行衍生化反應(yīng)；其中，采用氮吹至完全干燥即可；優(yōu)選的，在60±3°C條件下進(jìn)行氮吹干燥；例如，在60°C條件下采用氮吹儀進(jìn)行氮吹干燥。優(yōu)選的，采用雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺以及三甲基氯硅烷作為衍生化試劑，雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺即BSTFA，三甲基氯硅烷即TMCS。優(yōu)選的，雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺與三甲基氯硅烷的比例為99:1。例如，兩者的比例為質(zhì)量比或者摩爾比。優(yōu)選的，在68至71°C下加入10ul的BSTFA:TMCS(99:1)進(jìn)行30至60分鐘衍生化反應(yīng)。優(yōu)選的，在70°C下加入10ul的BSTFA:TMCS(99:1)進(jìn)行30分鐘衍生化反應(yīng)。
[0045]例如，進(jìn)行衍生化反應(yīng)時(shí)，量取l_5mg樣品于ImL樣品瓶中，選擇含1%或10%TMCS催化劑的BSTFA衍生化試劑，擰緊瓶蓋置于60°C下反應(yīng)20分鐘。酮類物質(zhì)在使用該方法時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生15-20%的烯醇-TMS-酯類，這些酯類產(chǎn)物可通過(guò)預(yù)處理方法消除。氨基酸類的衍生化反應(yīng)需要在密封試管或樣品瓶中進(jìn)行。持續(xù)對(duì)樣品加熱，并控制溫度在衍生化混合試劑的沸點(diǎn)之內(nèi)，直到獲得清澈的反應(yīng)完畢溶液。
[0046]進(jìn)行保留時(shí)間校準(zhǔn)。被分離樣品組分從進(jìn)樣開(kāi)始到柱后出現(xiàn)該組分濃度極大值時(shí)的時(shí)間，也即從進(jìn)樣開(kāi)始到出現(xiàn)某組分色譜峰的頂點(diǎn)時(shí)為止所經(jīng)歷的時(shí)間，為此組分的保留時(shí)間。保留時(shí)間是由色譜過(guò)程中的熱力學(xué)因素所決定，在一定的色譜操作條件下，任何一種物質(zhì)都有一確定的保留時(shí)間，以作為色譜定性分析的依據(jù)。但是色譜柱在使用過(guò)程中，固定相不斷流失，導(dǎo)致柱效降低，保留時(shí)間發(fā)生漂移，從而造成對(duì)待測(cè)物的定性產(chǎn)生影響，如圖4所示，組分保留時(shí)間由9.294分鐘漂移至9.130分鐘。優(yōu)選的，采用正構(gòu)烷烴(即直鏈飽和烷烴)進(jìn)行保留時(shí)間校準(zhǔn)；優(yōu)選的，采用C10-C31的正構(gòu)烷烴進(jìn)行保留時(shí)間校準(zhǔn)，