一種作物脂肪氧化酶同工酶lox-1比活力的定量測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生化檢測方法，具體涉及一種作物脂肪氧化酶同工酶L0X-1比活 力的定量測定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪氧化酶（L0X)是一種含非血紅素鐵的蛋白質(zhì)，專一催化具有順、順-1，4-戊二 烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸加氧反應(yīng)，氧化生成具有共軛雙鍵的過氧化氫物。脂肪氧化酶 具有三種同工酶Lox-3、Lox-2、L0X-1它們廣泛存在于高等植物體內(nèi)，與植物的生長發(fā)育、 植物的衰老、脂質(zhì)過氧化作用和光合作用、損傷反應(yīng)及其他脅迫反應(yīng)等有關(guān)。Lox在成熟的 大豆種子中含量很高（占種子蛋白質(zhì)含量的1%?2% )，可催化不飽和脂肪酸的加氧反 應(yīng)，形成過氧化氫衍生物等揮發(fā)性物質(zhì)，能直接與食品中的蛋白質(zhì)和氨基酸結(jié)合，產(chǎn)生豆 腥味和苦澀味，降低食品的風(fēng)味和營養(yǎng)價值，而且破壞了上述幾種人體必需脂肪酸，是大 豆中的抗?fàn)I養(yǎng)因子。
[0003] 脂肪氧化酶的活力直接影響大豆、花生、水稻等作物種子貯藏期限和加工品質(zhì)，活 力越小其對種子的影響就越小?？蒲泄ぷ髡咭呀?jīng)在研究選育培養(yǎng)出脂肪氧化酶Lox缺失的 農(nóng)作物新品種，因此如何快速準(zhǔn)確地定量檢測出脂肪氧化酶Lox活性，能為研究者提供更 加準(zhǔn)確地檢測數(shù)據(jù)，從而提高工作效率，加快新品種的研究步伐，同時也為農(nóng)作物貯藏、收 購提供準(zhǔn)確實用的數(shù)據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種作物脂肪氧化酶同工酶L0X-1比活力的定量測定方法。
[0005] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0006] -種作物脂肪氧化酶同工酶L0X-1比活力的定量測定方法，其特征在于，包括以 下步驟：
[0007] (1)將作物胚胎磨碎，加入提取液，研磨成勻漿，將勻漿裝入超聲波萃取釜中，將 超聲波發(fā)射頻率設(shè)定在30-40KHZ，溫度調(diào)節(jié)控制在20-25°C，萃取時間5-8分鐘，然后轉(zhuǎn) 至具蓋離心管，再用提取液洗滌3-4次，洗滌液轉(zhuǎn)至具蓋離心管，脫色搖床振蕩8-10min， 8000rpm離心8-10min，靜置3-5min，取上層清液，即酶液；
[0008] ⑵取提取的酶液于比色皿中，加入適量的反應(yīng)液，在660nm處測定吸光值，反應(yīng) 開始時記錄吸光值，取出反應(yīng)體系，至離心管，室溫25°C避光反應(yīng)，測定60min后的吸光值 并記錄，以吸光值的變化表示L0X-1活力，用純水作為參比調(diào)零，以緩沖液代替酶液作為對 昭.
[0009] (3)測定酶液蛋白濃度：
[0010] 取適量酶液，先測定樣品280nm0D值和260nm0D值，再按照以下公式計算酶液蛋 白濃度：
[0011]酶液蛋白濃度（mg/mL) = 280nm0D值 *1. 45-0. 74*260nm0D值；
[0012] (4)計算酶比活力：
[0013] 按照酶比活力測定公式計算出酶比活力，
[0014] 酶比活力=(樣品Omin的0D值-樣品60min的0D值）-(對照Omin的0D值-對 照60min的0D值）/酶液蛋白濃度。
[0015] 所述的作物脂肪氧化酶同工酶L0X-1比活力的定量測定方法，其特征在于：所述 的作物為水稻或花生。
[0016] 所述的作物脂肪氧化酶同工酶L0X-1比活力的定量測定方法，其特征在于：所述 的提取液的配制方法為：取甘油l〇_15ml，Tween-20 2.Oml，用pH9. 0的硼酸緩沖液定容至 100ml，混勻，靜置數(shù)天后使用，即為提取液；
[0017] 所述的PH9. 0硼酸緩沖液的制備：硼酸12. 37g/L，0? 2mol/L;硼砂19. 07g/L， 0? 05mol/L，取2. 474g硼酸，15. 256g硼砂，加水溶解，定容至1000ml即可。
[0018] 所述的作物脂肪氧化酶同工酶L0X-1比活力的定量測定方法，其特征在于：所 述的反應(yīng)液的制備方法為：將pro. 0硼酸緩沖液、亞油酸納、100yM亞甲基蘭、水，按照 5:1:0. 5:1 (v/v)的比例混合，得L0X-1反應(yīng)液，所述的亞油酸鈉的配制方法：定量稱取70mg 亞油酸，再加入等量Tween-20,再加入4ml無氧水，充分混勻，在加入0. 5N的NaOH約0. 55ml 至溶液變澄清，再定容至25ml，等量，分裝至-20°C冷藏，待用。
[0019] 本發(fā)明的原理：利利用脂肪氧化酶L0X-1能偶聯(lián)氧化亞甲基藍產(chǎn)生變色反應(yīng)，該 反應(yīng)在660nm處有一吸收峰，測定其吸光值的變化率可以反映其催化速率。
[0020] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明方法能快速、準(zhǔn)確、定量地檢測出脂肪氧化酶L0X-1比 活力，其過程簡單，成本低，其精確度明顯優(yōu)于已有的相關(guān)檢測技術(shù)；能為研究者提供更加 準(zhǔn)確地檢測數(shù)據(jù)，能提高工作效率，加快L0X-1缺失的新品種選育步伐，同時也為農(nóng)作物貯 藏、收購提供更加準(zhǔn)確實用的數(shù)據(jù)。
【具體實施方式】
[0021] 1、配制反應(yīng)液、提取液
【主權(quán)項】
1. 一種作物脂肪氧化酶同工酶L0X-1比活力的定量測定方法，其特征在于，包括以下 步驟： (1) 將作物胚胎磨碎，加入提取液，研磨成勻漿，將勻漿裝入超聲波萃取釜中，將超聲 波發(fā)射頻率設(shè)定在30-40KHZ，溫度調(diào)節(jié)控制在20-25°C，萃取時間5-8分鐘，然后轉(zhuǎn)至具蓋 離心管，再用提取液洗滌3-4次，洗滌液轉(zhuǎn)至具蓋離心管，脫色搖床振蕩8-10min，8000 rpm 離心8-10min，靜置3-5 min，取上層清液，即為酶液； (2) 取提取的酶液于比色皿中，加入適量的反應(yīng)液，在660nm處測定吸光值，反應(yīng)開始 時記錄吸光值，取出反應(yīng)體系，至離心管，室溫25°C避光反應(yīng)，測定60min后的吸光值并記 錄，以吸光值的變化表示LOX-1活力，用純水作為參比調(diào)零，以緩沖液代替酶液作為對照； (3) 測定酶液蛋白濃度： 取適量酶液，先測定樣品280nm OD值和260nm OD值，再按照以下公式計算酶液蛋白 濃度： 酶液蛋白濃度（1^/1^)=28〇11111〇0值*1.45-〇.74*26〇11111〇0值； (4) 計算酶比活力： 按照酶比活力測定公式計算出酶比活力， 酶比活力=(樣品Omin的OD值-樣品60min的OD值）-(對照Omin的OD值-對照 60min的OD值）/酶液蛋白濃度。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的作物脂肪氧化酶同工酶LOX-1比活力的定量測定方法，其特 征在于：所述的作物為水稻或花生。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的作物脂肪氧化酶同工酶LOX-1比活力的定量測定方法，其特 征在于：所述的提取液的配制方法為：取甘油l〇_15ml，Tween-20 2. 0ml，用pH 9. 0的硼酸 緩沖液定容至l〇〇ml，混勻，靜置數(shù)天后使用，即為提取液； 所述的pH 9. 0的硼酸緩沖液的制備：硼酸12. 37g/L，0. 2mol/L ;硼砂19. 07g/L， 0? 05mol/L，取2. 474g硼酸，15. 256g硼砂，加水溶解，定容至1000ml即可。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的作物脂肪氧化酶同工酶LOX-1比活力的定量測定方法，其特 征在于：所述的反應(yīng)液的制備方法為：將pH 9.0硼酸緩沖液、亞油酸納、lOOyM亞甲基蘭、 水，按照5:1: 0. 5:1 (v/v)的比例混合，得L0X-1反應(yīng)液，所述的亞油酸鈉的配制方法：定 量稱取70mg亞油酸，再加入等量Tween-20,再加入4ml無氧水，充分混勻，在加入0. 5N的 NaOH約0. 55ml至溶液變澄清，再定容至25ml，等量，分裝至-20°C冷藏，待用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種作物脂肪氧化酶同工酶LOX-1比活力的定量測定方法。首先將作物磨碎加入提取液中磨成漿料，離心分離，得到酶液，將酶液放入比色皿中，分別測定反應(yīng)前后在660nm處的吸光值，根據(jù)公式測定酶液蛋白濃度，最后按照酶比活力測定公式計算出酶比活力，本發(fā)明方法能快速、準(zhǔn)確、定量地檢測出脂肪氧化酶LOX-1比活力，其過程簡單，成本低，其精確度明顯優(yōu)于已有的相關(guān)檢測技術(shù)。
【IPC分類】G01N21-31
【公開號】CN104614330
【申請?zhí)枴緾N201510035698
【發(fā)明人】張瑛, 滕斌, 吳敬德, 宣紅, 周俊峰
【申請人】安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2015年1月24日