狂犬病毒均質(zhì)熒光復(fù)合微球的制備方法及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及狂犬病毒均質(zhì)熒光復(fù)合微球的制備方法及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 狂犬病毒（Rabies virus，RV)的糖蛋白（簡稱RVG)是唯一能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗 體的病毒蛋白，同時也是很好的檢測抗原。因此，將狂犬病毒糖蛋白在大腸桿菌中進(jìn)行高效 表達(dá)，經(jīng)Western blot等方法驗證純化后的重組蛋白可與RV陽性血清產(chǎn)生特異性反應(yīng)，這 為RV抗體檢測試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。
[0003] 時間分辨突光分析法（Time-resolved Fluoroimmunoassy，TrFIA)利用綱系兀素 螯合物標(biāo)記抗原、抗體、多肽、激素等，發(fā)生如抗原/抗體免疫反應(yīng)、生物素/親和素反應(yīng)等 反應(yīng)后，加入增強(qiáng)液解離鑭系元素，使其熒光信號得到加強(qiáng)，再經(jīng)外源性脈沖光激發(fā)，并采 用延時讀取等光電技術(shù)檢測鑭系元素的特異熒光，從而達(dá)到對樣品分析檢測的目的。由 于發(fā)光物質(zhì)銪離子和螯合劑結(jié)合后與包被的抗原或抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，形成的抗原-抗 體-銪標(biāo)記物復(fù)合物在弱堿性緩沖液中經(jīng)激發(fā)光激發(fā)所發(fā)生的熒光信號甚弱，須加入增強(qiáng) 液（β-酮體、T0P0、Triton X-100、pH2-3的醋酸和鄰苯酸氫鉀的酸性溶液)，使稀土離子從 絡(luò)合物上離下來，與新的絡(luò)合物結(jié)合形成大分子的微囊，這種微囊將能量傳遞給Eu 3+，阻斷 水所產(chǎn)生的淬滅效應(yīng)，使原來的熒光信號增強(qiáng)近100萬倍，利于熒光測量?？梢?，增強(qiáng)液在 TrIFA中是不可或缺的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供狂犬病毒均質(zhì)熒光復(fù)合微球的制備方法及其檢測方法。
[0005] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 狂犬病毒均質(zhì)熒光復(fù)合微球的制備方法，包括以下步驟： 1) 制備聚苯乙烯納米微球； 2) Eu3+的標(biāo)記：將聚苯乙烯納米微球懸浮于無水乙醇，加入絡(luò)合劑BHHCT，避光反應(yīng) 15~25min，用無水乙醇洗滌，Tris-HCl緩沖液重懸后，加入EuCl 3，避光反應(yīng)16~25min ; 離心，再用無水乙醇重懸沉淀，加入氨基硅烷，避光反應(yīng)1. 5~2. 5小時，洗滌，得均質(zhì)熒光 復(fù)合微球； 3) 抗原的標(biāo)記： a、 取均質(zhì)突光復(fù)合微球，重懸于無水乙醇，加入碳化二亞胺，避光反應(yīng)23~35min ; b、 離心，磷酸鹽緩沖液重懸，加入狂犬病毒抗原，避光反應(yīng)12~20h ; c、 加入20%BSA溶液，反應(yīng)22~35min ; d、 離心，洗滌，得到用于檢測狂犬病毒的標(biāo)記狂犬病毒抗原的均質(zhì)熒光復(fù)合微球。
[0006] 優(yōu)選的，步驟1)中，將聚乙烯吡咯烷酮、過硫酸鉀、苯乙烯以質(zhì)量比25:0. 6:100溶 于乙醇水溶液，氮氣保護(hù)下進(jìn)行聚合反應(yīng)；離心，用無水乙醇重懸沉淀，加入氨基硅烷，避光 反應(yīng)1. 6~3小時，洗漆，制得聚苯乙烯納米微球。
[0007] 優(yōu)選的，超聲條件下，52~65 °C，進(jìn)行聚合反應(yīng)。
[0008] 優(yōu)選的，步驟2)中，BHHCT與聚苯乙烯納米微球的質(zhì)量比為1:50。
[0009] 優(yōu)選的，步驟3)中，均質(zhì)熒光復(fù)合微球與碳化二亞胺的質(zhì)量比為1:1。
[0010] 狂犬病毒的檢測方法，包括以下步驟： 1) 用pH7. 4、0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液將重組金黃色葡萄球菌蛋白A稀釋后，加入到 酶標(biāo)板孔內(nèi)，每孔100 μ L，2~8°C放置13~18小時； 2) 每孔加入200 μ L封閉液，2~8°C放置13~18小時； 3) 棄去板內(nèi)液體，洗板，晾干； 4) 將標(biāo)準(zhǔn)品或待檢樣品加入到酶標(biāo)板孔內(nèi)，每孔100 μ L，37°C孵育； 5) 棄去板內(nèi)液體，洗板，晾干； 6) 將權(quán)利要求1~5任意一項所述方法制備的狂犬病毒均質(zhì)突光復(fù)合微球稀釋后，加 入到酶標(biāo)板孔內(nèi)，每孔100μ L，37°C孵育； 7) 棄去板內(nèi)液體，洗板，晾干； 8) 以多功能酶標(biāo)儀的時間分辨突光模式檢測突光信號，激發(fā)光波長為330nm，發(fā)射光 波長為6IOnm ; 9) 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，測得相對熒光單位的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，獲得標(biāo)準(zhǔn) 曲線，對比待檢樣品的檢測值，判定結(jié)果。
[0011] 優(yōu)選的，步驟1)中，重組金黃色葡萄球菌蛋白A的稀釋濃度為2μ g/mL。
[0012] 優(yōu)選的，步驟6)中，狂犬病毒均質(zhì)熒光復(fù)合微球的稀釋倍數(shù)為5000倍。
[0013] 優(yōu)選的，步驟4)孵育60min，步驟6)孵育。
[0014] 優(yōu)選的，封閉液含pH7. 4、0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液，4%BSA，0. 01%的NaN3。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明在傳統(tǒng)TrFIA基礎(chǔ)上，用納米微球作為熒光物質(zhì)Eu3+的載體，即在功能化內(nèi)核的 聚合作用下形成均質(zhì)熒光復(fù)合微球，然后通過螯合作用交聯(lián)RVG。本發(fā)明使用的雙功能絡(luò) 合劑BHHCT由于只有一個氯磺酞基，一端與稀土元素連接，一端與抗原或抗體連接，避免了 蛋白質(zhì)分子之間的交聯(lián)反應(yīng)，且由于熒光物質(zhì)Eu 3+沒有和生物大分子直接接觸，不會影響 生物活性，不需要進(jìn)行解離和增強(qiáng)。并且，均質(zhì)熒光復(fù)合微球表面覆有氨基硅烷形成的保護(hù) 層，熒光信號受外界環(huán)境影響降低，狂犬病毒均質(zhì)熒光復(fù)合微球的穩(wěn)定常數(shù)高達(dá)1〇 1(1，熒光 壽命達(dá)到幾百微秒，可很好的滿足時間分辨熒光免疫分析的需要。
[0016] 本發(fā)明狂犬病毒均質(zhì)熒光復(fù)合微球的制備方法簡單，檢測成本低，減少了操作步 驟和反應(yīng)時間，更容易實現(xiàn)自動化操作；儀器讀數(shù)更高，線性范圍更寬，檢測靈敏度明顯高 于 ELISA。
【附圖說明】
[0017] 圖1為聚苯乙烯納米微球的掃描電鏡照片。
[0018] 圖2為均質(zhì)熒光復(fù)合微球的Eu3+熒光光譜。
[0019] 圖3為實施例2均質(zhì)熒光復(fù)合微球檢測方法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實施方式】
[0020] 提高TrFIA靈敏度的關(guān)鍵是稀土元素絡(luò)合劑。本發(fā)明使用的雙功能絡(luò)合劑4， 4' -二（1 "，1"，1"，2"，2"，3"，3" -七氟-4"，6" -己二酮-6" -基）-氯磺?；?鄰二苯基 苯（BHHCT)是Yuan等（Yuan，J，etal.，1998)研發(fā)的一種穩(wěn)定的能發(fā)出強(qiáng)烈熒光的Eu 3+ 絡(luò)合劑，它所含有的四配位基團(tuán)比以往的β_二酮類絡(luò)合劑在靈敏度上有了很大的提高。 BHHCT由于只有一個氯磺酞基，一端與稀土元素連接，一端與抗原或抗體連接，避免了蛋白 質(zhì)分子之間的交聯(lián)反應(yīng)。
[0021] 以下實施例中所用金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁的重組蛋白A (重組蛋白SPA)購自北京 義翹神州生物技術(shù)有限公司；熒光螯合物BHHCT、重組狂犬病毒抗原RVG由北京泰普生物技 術(shù)公司饋贈；抗犬溫?zé)岵《究贵w、抗犬細(xì)小病毒抗體購自Hytest ;ELISA試劑盒購自北京北 瑞達(dá)醫(yī)藥科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)控血清由本實驗室保存。
[0022] 實施例1 狂犬病毒均質(zhì)突光復(fù)合微球的制備： (1)功能化內(nèi)核聚苯乙烯納米微球的制備 將2.58聚乙烯吡咯烷酮（？￥?)、0.068過硫酸鉀（即5)、1(^苯乙烯（5〇加入到2501111 無水乙醇/水介質(zhì)中溶解后置于超聲波反應(yīng)器中，通氮氣，開啟超聲波發(fā)生器，60°C下進(jìn)行 聚合反應(yīng)，得到聚苯乙烯納米微球分散液。離心收集沉淀，以無水乙醇懸浮，加入氨基硅烷， 室溫攪拌反應(yīng)，無水乙醇洗滌后收集聚苯乙烯納米微球，無水乙醇懸浮保存?zhèn)溆谩?br>[0023] (2 ) Eu3+標(biāo)記納米微球 將納米微球懸浮液濃縮至20mg/mL，向5mL懸浮液加入0. 5mL的4mg/mL BHHCT的乙 醇溶液，室溫避光攪拌反應(yīng)20min ;以無水乙醇洗滌，Tris-HCl緩沖液重懸，加入0. 5mL的 0. 01mol/L EuCl3溶液，室溫避光攪拌反應(yīng)20min ;離心收集后再以無水乙醇懸浮，