活性染色方法
【專利說明】活性染色方法
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年5月2日提交的共同未決的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?1/641，805 和2013年3月14日提交的共同未決的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?1/784, 759的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益， 將各申請的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明總體上涉及檢測細(xì)胞樣品中的活細(xì)胞的系統(tǒng)和方法，并且特別涉及使用可 透過膜的滲透活細(xì)胞和非活細(xì)胞兩者的熒光標(biāo)記物以及不可透過膜的選擇性地滲透非活 細(xì)胞的淬滅劑來檢測細(xì)胞樣品中的活細(xì)胞的系統(tǒng)和方法。
[0004] 背景
[0005] 例如由革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、以及真菌（例如酵母菌和霉菌）造成的微生 物污染可以導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病，并且在一些情況下甚至導(dǎo)致人類和動物受試者中的死亡。在 某些產(chǎn)業(yè)例如食品、水、化妝品、制藥、以及醫(yī)療器械產(chǎn)業(yè)中的生產(chǎn)商必須符合嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn) 驗(yàn)證他們的產(chǎn)品不包含一定水平的微生物污染物，否則會損害消費(fèi)者或接受者的健康。這 些產(chǎn)業(yè)需要針對微生物污染物的存在進(jìn)行頻繁的、準(zhǔn)確的、和靈敏的測試，以符合某些標(biāo) 準(zhǔn)，例如由美國食品與藥品管理局或美國環(huán)境保護(hù)局規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。
[0006] 取決于情況，區(qū)分活細(xì)胞與非活細(xì)胞的能力還可以是重要的。例如，在藥物制劑和 生物制劑的生產(chǎn)期間，重要的是在生產(chǎn)過程中使用的水是無菌的并且不含污染物。并且，重 要的是在藥物（例如，液體藥物制劑和生物劑型，例如可注射的劑型）中包含的水以及例如 經(jīng)由非腸胃外途徑給予至受試者的液體（例如，鹽水）也是無菌的并且不含污染物。在另一 方面，在飲用水中一些活微生物的存在可以被接受為直到達(dá)到一個(gè)點(diǎn)。為了適于飲用，飲用 水必須符合嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)。即使微生物可以存在于供水中，該水可依然對于人類消費(fèi)來說是可 接受的。然而，一旦細(xì)胞數(shù)超過一個(gè)閾值水平，該水可能不再被視為對人類消費(fèi)是安全的。 并且，在某些食物產(chǎn)品（例如，生鮮產(chǎn)品）和飲品（例如，牛奶）中某些預(yù)定水平的微生物 的存在可以是可接受的。然而，一旦已經(jīng)超過那些水平，食物或飲品可被視為已經(jīng)變質(zhì)并且 對于人類消費(fèi)不再是適當(dāng)?shù)暮?或安全的。
[0007] 用于評估微生物污染的存在和/或微生物污染的程度的傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)方法可 以耗費(fèi)幾天來進(jìn)行，這取決于測試針對的微生物。在此期間，存在懷疑的產(chǎn)品（例如，食物、 飲品、或醫(yī)療產(chǎn)品）可以被檢疫隔離，直至結(jié)果獲得并且產(chǎn)品可以釋放。因此，存在一種快 速檢測（例如，在數(shù)小時(shí)之內(nèi)或更短）樣品中的微生物污染物特別是活的微生物污染物的 存在和/或量的系統(tǒng)和方法的需求。
[0008] 概述
[0009] 本發(fā)明部分地是基于可以用于選擇性地標(biāo)記包含細(xì)胞的樣品中的活細(xì)胞（例如， 原核細(xì)胞或真核細(xì)胞）的染色方法的發(fā)現(xiàn)。該染色方法可以與一種細(xì)胞捕獲系統(tǒng)和/或光 學(xué)檢測系統(tǒng)組合使用以檢測細(xì)胞樣品中活細(xì)胞的存在?？商娲?，該染色程序可以用于對 布置于液體內(nèi)和/或固體支撐物上（例如，在顯微鏡載玻片上，或培養(yǎng)皿、微量滴定板或吸 收池中）的活細(xì)胞進(jìn)行染色。并且，該染色程序可以用于對溶液中的細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記（例 如，在流式細(xì)胞術(shù)之前）。該染色方案可以用于一種用以測量感興趣的特定樣品的生物負(fù)載 (例如，用以測量一種樣品中的活細(xì)胞（例如，活的微生物，如細(xì)菌、酵母菌、以及真菌）的數(shù) 目和/或百分比和/或分?jǐn)?shù)）的方法中。
[0010] 在一方面，本發(fā)明提供了檢測細(xì)胞樣品中的活細(xì)胞的方法。該方法包括將該細(xì)胞 樣品中的細(xì)胞（i)在允許一種可透過膜的熒光染料滲透活細(xì)胞與非活細(xì)胞兩者的條件下， 暴露于該熒光染料，并且（ii)在允許一種不可透過膜的熒光淬滅劑選擇性地滲透非活細(xì) 胞而不是活細(xì)胞的條件下，暴露于該淬滅劑，該淬滅劑能淬滅由該熒光染料產(chǎn)生的熒光。例 如，該淬滅劑選擇性地滲透非活細(xì)胞而不是活細(xì)胞。此后，該方法包括將細(xì)胞暴露于光，例 如一束具有一個(gè)波長的能夠激發(fā)熒光染料產(chǎn)生熒光發(fā)射的光，并且用一個(gè)檢測器對來自細(xì) 胞的熒光發(fā)射（如果有的話）進(jìn)行檢測，由此檢測細(xì)胞樣品中的活細(xì)胞。在選擇的檢測條 件下，與活細(xì)胞內(nèi)的熒光染料相比，在非活細(xì)胞內(nèi)的熒光染料發(fā)射顯著更少的熒光。因此， 與活細(xì)胞相比，非活細(xì)胞發(fā)射顯著更少的熒光。
[0011] 在某些情況下，例如，當(dāng)淬滅劑能夠產(chǎn)生熒光發(fā)射時(shí)，激發(fā)光的波長可以被選擇為 對該淬滅劑不進(jìn)行光激發(fā)或基本上不進(jìn)行光激發(fā)?？商娲?，這種或這些檢測器可以被選 擇和/或配置為優(yōu)先檢測來自染料的發(fā)射事件而非來自淬滅劑的發(fā)射事件。
[0012] 在另一方面，本發(fā)明提供了檢測細(xì)胞樣品中的活細(xì)胞的方法。該方法包括將該細(xì) 胞樣品中的細(xì)胞（i)在允許一種可透過膜的突光染料滲透活細(xì)胞與非活細(xì)胞兩者的條件 下，暴露于該熒光染料，并且（ii)在允許一種不可透過膜的熒光淬滅劑選擇性地滲透非活 細(xì)胞而不是活細(xì)胞的條件下，暴露于該淬滅劑，該淬滅劑能淬滅由該熒光染料產(chǎn)生的熒光。 此后，這些細(xì)胞暴露于具有一個(gè)波長的光，該波長能夠激發(fā)熒光染料產(chǎn)生熒光發(fā)射。用一種 檢測器對來自細(xì)胞的熒光發(fā)射（如果有的話）進(jìn)行檢測，這些檢測器被配置為優(yōu)先檢測來 自熒光染料的可檢測發(fā)射而不是來自淬滅劑的可檢測發(fā)射，從而使得來自淬滅劑的可檢測 發(fā)射（如果產(chǎn)生的話）不高于來自熒光染料的可檢測發(fā)射的50% (例如，不高于40%、不 高于30%、不高于20%、不高于10% )。在采用的檢測條件下，與活細(xì)胞相比，非活細(xì)胞發(fā) 射由檢測器檢測到的顯著更少的熒光。因此，該方法可以用于檢測細(xì)胞樣品中的活細(xì)胞。
[0013] 在某些實(shí)施例中，在暴露于光時(shí)，非活細(xì)胞不發(fā)射或基本上不發(fā)射可由檢測器檢 測的熒光。在某些實(shí)施例中，在暴露于用于激發(fā)熒光染料的光時(shí)，非活細(xì)胞不發(fā)射或基本上 不發(fā)射熒光。
[0014] 在前述方面和實(shí)施例的每一個(gè)中，取決于正被檢測的細(xì)胞和希望的靈敏度，可能 的是將細(xì)胞暴露于多種不同熒光染料和/或多種不同熒光淬滅劑中。并且，取決于待使用 的染料和淬滅劑、以及待檢測的細(xì)胞，可以將這些細(xì)胞暴露于熒光染料中并且然后暴露于 熒光淬滅劑中?？商娲?，可以同時(shí)將這些細(xì)胞暴露于熒光染料和熒光淬滅劑中。在某些 方法中，可以希望的是通過在采用用以激發(fā)熒光染料的光進(jìn)行照射之前對這些細(xì)胞進(jìn)行洗 滌來減少任意的背景熒光。在其他方法中，后續(xù)的洗滌步驟是不必要的，并且洗滌步驟如果 采用的話可以通過經(jīng)由擴(kuò)散到細(xì)胞外面而從活細(xì)胞去除熒光染料。
[0015] 檢測方法可以在單一的細(xì)胞、細(xì)胞簇或細(xì)胞集落上進(jìn)行。在某些情況下，例如，為 了增加測定的靈敏度，可以希望的是在將細(xì)胞暴露于熒光染料和熒光淬滅劑之前和/或期 間和/或之后，在允許細(xì)胞增殖的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。包括生長培養(yǎng)基、溫度、培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間 的選擇的培養(yǎng)條件可以被選擇為允許樣品中的至少一種細(xì)胞具有一次或多次細(xì)胞分裂。
[0016] 在前述方面和實(shí)施例的每一個(gè)中，熒光染料和/或熒光淬滅劑結(jié)合至細(xì)胞內(nèi)的細(xì) 胞組分或細(xì)胞器，例如，核酸。在其他實(shí)施例中，熒光染料和熒光淬滅劑在細(xì)胞中與彼此結(jié) 合。
[0017] 在前述方面和實(shí)施例的每一個(gè)中，用于激發(fā)該熒光染料或這些熒光染料的該束光 具有在以下的范圍內(nèi)的波長：從大約350nrn至大約lOOOnm、從大約350nm至大約900nrn、 從大約350nm至大約800nm、從大約350nm至大約700nm、或從大約350nm至大約600nm。例 如，激發(fā)光的波長是至少處于以下的一個(gè)范圍內(nèi)：從大約350nm至大約500nm、從大約350nm 至大約550nm、從大約350nm至大約600nm、從大約400nm至大約550nm、從大約400nm至大 約600nm、從大約400nm至大約650nm、從大約450nm至大約600nm、從大約450nm至大約 650nm、從大約450nm至大約700nm、從大約500nm至大約650nm、從大約500nm至大約700nm、 從大約500nm至大約750nm、從大約550nm至大約700nm、從大約550nm至大約750nm、從大 約550nm至大約800nm、從大約600nm至大約750nm、從大約600nm至大約800nm、從大約 600nm至大約850nm、從大約650nm至大約800nm、從大約650nm至大約850nm、從大約650nm 至大約900nm、從大約700nm至大約850nm、從大約700nm至大約900nm、從大約700nm至大 約950nm、從大約750至大約900nm、從大約750至大約950nm或從大約750至大約lOOOnm。 某些范圍包括從大約350nm至大約600nm以及從大約600nm至大約750nm。
[0018] 取決于采用的一種或多種熒光標(biāo)記物，光學(xué)檢測器可以檢測處于以下范圍內(nèi)的 發(fā)射光：從大約350nm至大約lOOOnm、從大約350nm至大約900nm、從大約350nm至大約 800nm、從大約350nm至大約700nm、或從大約350nm至大約600nm。例如，可以檢測處于以 下范圍內(nèi)的焚光發(fā)射：從大約350nm至550nm、從大約450nm至大約650nm、從大約550nm 至大約750nm、從大約650nm至大約850nm、或從大約750nm至大約950nm、從大約350nm至 大約450nm、從大約450nm至大約550nm、從大約550nm至大約650nm、從大約650nm至大約 750nm、從大約750nm至大約850nm、從大約850nm至大約950nm、從大約350nm至大約400nm、 從大約400nm至大約450nm、從大約450nm至大約500nm、從大約500nm至大約550nm、從大 約550nm至大約600nm、從大約600nm至大約650nm、從大約650nm至700nm、從大約700nm 至大約750nm、從大約750nm至大約800nm、從大約800nm至大約850nm、從大約850nm至大 約900nm、從大約900nm至大約950nm、或從大約950nm至大約lOOOnrn。在某些實(shí)施例中，檢 測到處于以下范圍的發(fā)射光：從大約660nm至大約690nm、從大約690nm至大約720nm、和/ 或從大約720nm至大約850nm。
[0019] 在前述方面和實(shí)施例的每一個(gè)中，這些細(xì)胞被捕獲在多孔膜上，例如，在此所述的 細(xì)胞捕獲系統(tǒng)的多孔膜上。該多孔膜當(dāng)暴露于具有一個(gè)處于從大約350mn至大約1000 nm 范圍內(nèi)的波長的光時(shí)可以基本上是非自發(fā)熒光的。在某些其他實(shí)施例中，這些細(xì)胞被布置 于固體支撐物例如顯微鏡載玻片上。在某些其他實(shí)施例中，這些細(xì)胞被布置在液體樣品中， 該液體樣品可以存在于光學(xué)池例如流動池或毛細(xì)管中。
[0020] 在前述方面和實(shí)施例的每一個(gè)中，該方法可以進(jìn)一步包括將細(xì)胞暴露于第二不同 的可透過膜的對活細(xì)胞、非活細(xì)胞或活細(xì)胞與非活細(xì)胞組合進(jìn)行標(biāo)記的焚光染料。
[0021] 此外，在前述方面和實(shí)施例的每一個(gè)中，有可能包括用于檢測系統(tǒng)的陽性對照。因 此，該方法可以進(jìn)一步包括將包含這些細(xì)胞的樣品或流體中的這些細(xì)胞與多種顆粒例如熒 光顆粒進(jìn)行組合中，這些顆粒在被一束具有從大約350nm至大約1000 nm范圍內(nèi)（例如，上 文結(jié)合針對一種或多種熒光染料的激發(fā)光討論的波長范圍）的波長的光激活時(shí)發(fā)射熒光 信號。此后，由熒光顆粒中的一個(gè)或多個(gè)產(chǎn)生的熒光信號可以在由檢測系統(tǒng)檢測到任何活 細(xì)胞的同時(shí)得以檢測到。
[0022] 使用在此所述的染色方案，可能的是確定細(xì)胞樣品（例如液體樣品）的至少一部 分中的活細(xì)胞的數(shù)目。液體樣品可以是例如水樣