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      活性染色方法_4

      文檔序號(hào):8344505閱讀:來源:國知局
      2中的表面張力。
      [0095] 在另一個(gè)方法中,如在圖3A中所描繪的,圓形膜組件300包括具有上表面304的 多孔膜202。附著至表面304的中心部分的圓形掩罩306將膜202保持為基本上是平的。 在膜組件300中,流體樣品中的細(xì)胞(如果其中有任何存在的話)被捕獲在由掩罩306覆蓋 的表面304的暴露部分上。膜組件300可以布置在流體可滲透多孔支撐構(gòu)件上,如下文所 述,該支撐構(gòu)件可以在檢測(cè)期間維持膜的希望的平面度。可替代地或另外地,為了將膜202 保持為基本上是平的,可以向掩罩306施加向下的壓力。適用于掩罩306的材料包括塑料、 聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯、以及具有斥水特性的其他材料。
      [0096] 圖3B描繪了類似于圖3A中所示膜組件300的膜組件310。掩罩316類似于掩罩 306,但掩罩316具有允許用戶用手指或鑷子拿起組件310 (包括膜202)的突出物或突嘴 318,并且將組件310轉(zhuǎn)移至另一個(gè)位置,例如在膜固持件上。掩罩316的頂面還限定了一 個(gè)孔320,該孔可以充當(dāng)一個(gè)登記器,使得在膜202的表面304上檢測(cè)到的顆粒或細(xì)胞的位 置可以參照孔320的位置來描述。可替代地或另外地,有待檢測(cè)的對(duì)照顆??梢宰畛醪贾?于孔320中。在某些其他實(shí)施例中,該掩罩可以包括突出物或孔任一者,但不是二者。
      [0097] 在另一個(gè)方法中,如圖4A和4B所描繪的,通過將多孔膜202放置于流體可滲透的 固體支撐構(gòu)件404上,可以將該多孔膜202布置于膜組件400中以將該多孔膜202維持為 基本上平面的配置,而不需要針對(duì)框架204或掩罩306或316維持這種配置。在一個(gè)實(shí)施 例中,當(dāng)該多孔膜202濕潤時(shí),在膜202與固體支撐構(gòu)件404之間的表面張力使得膜202的 底面貼合至支撐構(gòu)件404的配合上表面406。例如,在一個(gè)實(shí)施例中,該支撐構(gòu)件404可以 是一種流體可滲透的固體的基本上是平面的元件,它將膜202保持為基本上平面的配置, 例如,當(dāng)該膜濕潤時(shí)。支撐構(gòu)件404是多孔的,并且配合上表面406是基本上平且光滑的。 在另一個(gè)實(shí)施例中,固體支撐構(gòu)件404被非毒性粘合劑包覆,例如聚異丁烯、聚丁烯、丁基 橡膠、苯乙烯嵌段共聚物、硅酮橡膠、丙烯酸共聚物、或它們的某些組合。當(dāng)例如從一個(gè)真空 施加向下的壓力時(shí),該多孔膜202變成松散地粘附至固體支撐構(gòu)件404,這導(dǎo)致多孔膜貼合 至固體支撐構(gòu)件404的表面406。支撐構(gòu)件404是多孔的,并且配合上表面406是基本上 平且光滑的。例如,在一個(gè)實(shí)施例中,該表面406具有高達(dá)大約IOOym的平面度公差。該 支撐構(gòu)件404的直徑大致與膜202的直徑相同,并且優(yōu)選地該支撐構(gòu)件404具有基本上均 一的厚度。該支撐構(gòu)件可以具有一個(gè)處于選自下組的范圍內(nèi)的厚度,該組由以下各項(xiàng)組成: 大約從0· Imm至10mm、從0· 5mm至5mm、以及從Imm至3mm。適合用于制造該多孔支撐構(gòu)件 404的材料包括塑料、聚碳酸酯、高密度聚乙烯(HDPE)、玻璃、以及金屬。在一個(gè)實(shí)施例中, 該支撐構(gòu)件404是通過對(duì)保持在接近顆粒熔點(diǎn)的溫度下以及足以導(dǎo)致顆粒燒結(jié)以便將它 們?nèi)诤显谝黄鸩⑶倚纬删唤Y(jié)構(gòu)的壓力下的塑料顆粒進(jìn)行燒結(jié)而制成,這些塑料顆粒是由 聚(甲基丙烯酸甲酯)制成,具有〇· 15-0. 2mm的平均直徑。
      [0098] 雖然膜202和支撐構(gòu)件404描繪為圓形,但這僅是說明性的。在其他實(shí)施例中,膜 202和/或支撐構(gòu)件404可以成形為方形、矩形、橢圓形等。總體上,如果使用的話,支撐構(gòu) 件的形狀和表面積被選擇為使得支撐構(gòu)件的表面的大小大致與其上布置的膜的大小相同 或略小。
      [0099] 膜202被布置為與支撐構(gòu)件404的基本上平的光滑表面406接觸,之后樣品流體 被傾倒在膜202上。大體上平的表面406有助于在樣品流體排出后將膜202保持為基本上 是平的。流體可滲透的固體支撐物404還可以充當(dāng)用于穿過膜202和流體可滲透固體支撐 物404的流體的儲(chǔ)器,從而提供防止膜202和布置于其上的活細(xì)胞在檢測(cè)過程中干燥的額 外益處。干燥可不利于保留在膜202上的細(xì)胞的活性。
      [0100] 參照?qǐng)D5A-5E,具有一個(gè)杯502和一個(gè)基座504的杯-基座組件500用于協(xié)助將在 液體樣品中存在的細(xì)胞捕獲在布置于基座504內(nèi)的膜(例如,膜202)上?;?04具有表 面506(參見,圖OT)、外壁508、以及唇緣510。表面506限定了至少一個(gè)開口 512以及可 任選的圓形徑向突出物或凹槽514,以協(xié)助液體穿過膜202的排放。壁508具有在唇緣510 下的周向凹槽516。在某些實(shí)施例中(參見圖OT),杯502包括一個(gè)壁520,該壁具有周向突 出物522,這些突出物被適配為與基座凹槽516配合以可釋放地將杯502與基座504互鎖。 壁520的唇緣節(jié)段524,即在突出物522之下的節(jié)段,向內(nèi)傾斜以形成被適配為接觸多孔膜 202的上表面的周向密封唇緣。唇緣節(jié)段524還將多孔膜202 (并且在某些實(shí)施例中,框架 200和/或支撐構(gòu)件404)捕獲在杯520與基座504之間。
      [0101] 更通常地,膜和用于將該膜保持為大體上平的任何組件,例如具有輻條的固持件 (參考圖2A和2B描述)、掩罩(參考圖3A和3B描述)、和/或支撐構(gòu)件(參考圖4A和4B 描述)可以被接收在杯-基座組件500內(nèi),并且被布置在基座504的表面506上。杯502 進(jìn)而被布置于膜組件上,以使得壁突出物522裝配入基底504的凹槽516中,如圖5E所描 繪。這個(gè)裝配有助于確保在杯502與基座504之間的合適定位,特別是關(guān)于在其間包含的 膜202而言。節(jié)段524的大?。ɡ?,長度、傾斜角等)被選擇為使得該節(jié)段524抵靠布置 于基座504中的膜組件400按壓,以提供流體密封并且確保平膜202。
      [0102] 圖6A-6D描繪了杯-基座組件550的另一個(gè)實(shí)施例。杯-基座組件550具有杯552 和基底554,在許多方面它們的功能類似于杯502和基座504。該杯-基座組件550還可以 可任選地包含蓋556,以便在使用前后將杯552的內(nèi)部保持為受到保護(hù)免受污染物。支撐構(gòu) 件558(例如,支撐物404)布置于基座554中,以用于支撐膜202(描繪于圖9A和9B中)。 在描繪的實(shí)施例中,蓋556基本上是圓形的,以與杯552互相裝配,雖然任何互補(bǔ)形狀可以 是合適的。蓋556被更詳細(xì)地顯示于圖6E和6F中,包括脊560,該脊提供了在杯552的頂 部與蓋556的頂部的底面之間的小的偏移。
      [0103] 圖7A-7D更詳細(xì)地描繪了杯552。杯552包括上部562,該上部基本上是中空的并 且向外朝著頂部逐漸錐形化,從而提供可以傾倒流體于其中的增加的截面積。另外,錐形化 將流體引導(dǎo)為朝向下節(jié)段564,該下節(jié)段被適配為被接收在基座554中。當(dāng)杯552布置于基 座554中時(shí),垂直段566可以提供增加的穩(wěn)定性,一個(gè)唇緣節(jié)段568 (類似于唇緣節(jié)段524) 以一個(gè)角度從該垂直段延伸。另一個(gè)垂直節(jié)段570還被設(shè)置為用于接觸膜202。
      [0104] 圖8A-8D描繪了基座554?;?54包括限定一個(gè)上部574的外壁572,該外壁可 以捕獲外部流體。下部576被適配為接收在一個(gè)平臺(tái)內(nèi)(下文詳細(xì)地描述),并且可以被錐 形化為當(dāng)安裝于其上時(shí)提供緊密抵壓。內(nèi)壁578限定了用于接收杯552并且更具體而言為 垂直段566的一個(gè)中心凹陷580。當(dāng)杯552安裝于基座554上時(shí),在垂直段566與內(nèi)壁578 之間的緊密配合和重疊有助于確保穩(wěn)定的裝配。用于接收膜202的壁架582位于內(nèi)壁578 的底部,并且進(jìn)一步將凹陷584限定于中間以接收支撐構(gòu)件558?;?54、膜202、以及支 撐構(gòu)件558的關(guān)系描繪于圖9A-9D中,連同可任選的蓋588 (透明地描繪于圖9A中)。開口 586可以設(shè)置在基座554的底部中,類似于開口 512。
      [0105] 在某些實(shí)施例中,細(xì)胞捕獲系統(tǒng),特別是多孔膜,具有低于10'10'10'或101勺 無菌保證水平。這可以例如經(jīng)由高壓滅菌法、暴露于電離輻射(例如,Y輻射)或暴露于滅 菌流體或氣體(例如,氧化乙烯或汽化的過氧化氫)通過對(duì)細(xì)胞捕獲系統(tǒng)進(jìn)行滅菌來實(shí)現(xiàn)。 在滅菌之前、期間、或之后,可以將該細(xì)胞捕獲系統(tǒng)可以裝入一個(gè)容器(例如,包)中。在最 終滅菌(例如,經(jīng)由暴露于電離輻射)之前,可以將該細(xì)胞捕獲系統(tǒng)放置于容器(例如,包) 內(nèi)并且密封(例如,不透氣地密封)。
      [0106] 在另一個(gè)實(shí)施例中,本發(fā)明提供了細(xì)胞捕獲杯,該細(xì)胞捕獲杯包括開放圓柱部分 和環(huán)形密封,該環(huán)形密封被適配為與一個(gè)基座配合,該基座包括前述方面和實(shí)施例的任一 個(gè)的細(xì)胞捕獲系統(tǒng)。該細(xì)胞捕獲杯和基座可以具有低于10'10'ΚΓ 8、或KT9的無菌保證 水平,這可以使用在此討論的方法中的任一個(gè)或全部來實(shí)現(xiàn)。
      [0107] (II)細(xì)胞捕獲方法
      [0108] 圖IOA描繪了示例性杯-基座組件550的部件。將多孔支撐構(gòu)件558和膜202布 置于基座554的中心中。然后,將該杯552安裝在膜202的頂部,有助于將膜202維持為處 于平位置??梢詫⑸w556設(shè)置在杯552的頂部以保護(hù)杯552的內(nèi)部免于受到污染。圖IOB 描繪了部件(沒有膜202和支撐物558)的裝配。
      [0109] 在使用期間,將樣品流體傾倒在杯552內(nèi)。由于杯552的錐形化,流體將膜組件潤 濕并且穿過膜202。典型地流體朝向基座554穿過膜組件(例如,穿過膜202,以及多孔支 撐構(gòu)件558,如果使用一個(gè)的話)??梢杂欣夭捎秘?fù)壓例如真空來將流體抽吸通過膜202 至開口 586(例如,在圖5E的實(shí)施例中,經(jīng)由凹槽514),并且有助于將膜保持為基本上是平 的。在流體被抽吸通過杯-基座組件550之后,不能穿過膜202的流體中的任何顆粒和/ 或細(xì)胞保留在膜202的暴露的上表面上。在將流體傾倒入杯組件中之后,杯552可以與基 座554分離,如在圖IOC中描繪的,并且與放置于基座554的頂部上的蓋558分離。蓋588 可以設(shè)置在基座554的頂部上,從而在將基座轉(zhuǎn)移至平臺(tái)802(圖11B)時(shí)或在孵育包含膜 202的基座例如持續(xù)15分鐘至8個(gè)小時(shí)以允許捕獲的活細(xì)胞增殖時(shí),保護(hù)潤濕的膜202和 支撐物558免受污染。
      [0110] 示出用于在一個(gè)示例性光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)中使用的細(xì)胞捕獲系統(tǒng)的組件、流體樣品通 過細(xì)胞捕獲系統(tǒng)的通道、以及膜固持件的組件的示例性流程圖顯示于圖IlA中。
      [0111] 參照?qǐng)D11A,在步驟601中,提供了杯-基座組件550。在步驟603中,該杯-基座 組件550與一個(gè)真空系統(tǒng)(例如,真空歧管606)連接,并且將負(fù)壓施加至杯-基座組件550 的下側(cè)。在步驟605中,將液體樣品傾倒在杯-基座組件550中,并且存在于液體樣品中的 任何細(xì)胞被保留在多孔膜202的暴露的上表面上。這個(gè)傾倒步驟可以在步驟603之前、同 時(shí)、或之后進(jìn)行。應(yīng)考慮到基本上非自發(fā)熒光的膜允許在大約5托或大約10托的真空下通 過其的流率為至少5或至少10mL/ Cm2/min。然后將這些細(xì)胞用活性染色劑或活性染色系統(tǒng) 進(jìn)行染色,例如,如在III節(jié)中討論的,從而使得有可能選擇性地檢測(cè)活細(xì)胞并區(qū)分活細(xì)胞 與非活細(xì)胞。可以可任選地將細(xì)胞用生理學(xué)上可接受的鹽和/或緩沖溶液進(jìn)行洗滌,以將 殘留的非特異性地結(jié)合的熒光染料和/或淬滅劑去除。
      [0112] 在步驟607中,將膜組件典型地與基座554組合從杯552移除,雖然獨(dú)立于基座 554的移除可以是可能的。在步驟609中,基座554(因此還有膜202)布置于平臺(tái)802上。 在步驟611中,平臺(tái)802布置于卡盤804上。在下
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