一種電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀用緩沖液及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)療診斷儀器用試劑，尤其涉及一種電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀用緩沖液 及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，針對人體中疾病相關(guān)痕量物質(zhì)的定量檢測常用的方法有化學(xué)發(fā)光免疫法和 電化學(xué)發(fā)光免疫法，化學(xué)發(fā)光免疫發(fā)和電化學(xué)發(fā)光免疫法不但對檢測者身體無害，檢測敏 感度和精密度較高，而且試劑穩(wěn)定，并可進(jìn)行全自動(dòng)分析，是理想的標(biāo)記免疫測定方法。
[0003] 然而電化學(xué)發(fā)光免疫法以其高靈敏度(可達(dá)KTn~l(r17mol/L)和良好的重復(fù)性得 到了廣泛的應(yīng)用。電化學(xué)發(fā)光免疫法分為有機(jī)化合物的發(fā)光體系和無機(jī)物的發(fā)光體系。有 機(jī)發(fā)光物有酰肼類化合物、吖啶酯和光澤精等，無機(jī)化合物電化學(xué)發(fā)光體系中，最典型的發(fā) 光試劑是釕聯(lián)吡啶化合物，該試劑在水溶液和有機(jī)溶液中的溶解度好，發(fā)光效率高，可進(jìn)行 可逆的單電子反應(yīng)，在電化學(xué)發(fā)光理論和應(yīng)用研究中占有重要的地位。
[0004] 電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的原理為：電化學(xué)發(fā)光（electro - chemiluminescence, ECL)是 一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，實(shí)際上包括了電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩 個(gè)過程。化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3] 2+和電子供體三丙胺（TPA)在陽電極表面同 時(shí)各失去一個(gè)電子發(fā)生氧化反應(yīng)。二價(jià)的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三價(jià)，后者是一種強(qiáng)氧 化劑。TPA被氧化成陽離子自由基TPA+%后者很不穩(wěn)定，自發(fā)地失去一個(gè)質(zhì)子（H+ )，形成 自由基TPA%這是一種非常強(qiáng)的還原劑。這兩個(gè)高反應(yīng)基團(tuán)在電極表面迅速反應(yīng)，三價(jià)的 [Ru(bpy)3] 3+被還原形成激發(fā)態(tài)的二價(jià)[Ru(bpy)3] 2+%能量來源于[Ru(bpy)3]3+和TPA*之 間存在的高電化學(xué)電位差。TPA #自身被氧化成二丙胺和丙醛。接著激發(fā)態(tài)的[Ru(bpy)3] 2+* 衰減成基態(tài)的[Ru (bpy) 3]2+，同時(shí)發(fā)射一個(gè)波長620nm的光子。這一過程在電極表面周而復(fù) 始地進(jìn)行，產(chǎn)生許多光子，使光信號(hào)得以增強(qiáng)；以三聯(lián)吡啶釕作為標(biāo)記物，標(biāo)記抗原或抗體， 通過免疫反應(yīng)及ECL反應(yīng)，即可進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光免疫測定。
[0005] 羅氏電化學(xué)發(fā)光免疫三丙胺清洗緩沖液（簡稱羅氏緩沖液）是適用于羅氏電化學(xué) 發(fā)光分析儀的緩沖液，該緩沖液不需要專門灌注或定標(biāo)，可以長期使用延長測量池壽命。羅 氏的電化學(xué)發(fā)光分析儀用緩沖液通過以三聯(lián)吡啶釕作為標(biāo)記物，標(biāo)記抗原或抗體，檢測激 素、甲狀腺功能、腫瘤標(biāo)記物、傳染病、心肌標(biāo)記物和其他的骨標(biāo)志，糖尿病和貧血等等疾病 的指標(biāo)，在臨床上有十分重要的意義。目前美國羅氏公司（ROCHE)實(shí)現(xiàn)了三丙胺（TPA)緩沖 液的工業(yè)化，該三丙胺緩沖液配方為磷酸鹽緩沖液300mmol/L、三丙胺180mmol/L、去垢劑 =0. 1%、防腐劑，pH6. 8。該配方三丙胺的濃度為25g/L，使用的三丙胺濃度較高，三丙胺的 蒸氣或霧對眼、粘膜和上呼吸道有和皮膚都有很強(qiáng)的刺激性，而且三丙胺的揮發(fā)性很強(qiáng)，對 操作人員和環(huán)境存在均較大的危害，不利于該試劑的推廣和應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀用緩沖液長期依賴進(jìn)口的現(xiàn)狀，試劑成 本高，三丙胺用量多的缺陷，本發(fā)明目的在于提供一種成本低廉、三丙胺量少，試劑性能優(yōu) 越的電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀用緩沖液及其制備方法。
[0007] 本發(fā)明提供的電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀用緩沖液，其組分和含量包括：磷酸二 氫鉀40. 0-50.0 g/L、吐溫20 0.5-3. Og/L、十二烷基聚乙二醇醚0.1-1. 0 g/L、聚多卡 醇1.0-5.(^/1、三丙胺12.0-16.(^/1、檸檬酸0.1-1.0§/1，所述的緩沖液的口11值為 6. 5-7. 0。
[0008] 本發(fā)明的電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀用緩沖液，優(yōu)選的組分和含量為：磷酸二氫 鉀45. 0-48.0 g/L、吐溫20 0.5-1. 5g/L、十二烷基聚乙二醇醚0.4-0. 6g/L、聚多卡醇 1. 0-2. Og/L、三丙胺14. 0-16. 0 g/L、檸檬酸0? 5-0. 8g/L，所述的緩沖液的pH值為6. 5-7. 0。
[0009] 本發(fā)明的電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀用緩沖液，進(jìn)一步優(yōu)選的組分和含量為：磷酸二 氫鉀46.8 g/L、吐溫20 l.Og/L、十二烷基聚乙二醇醚0.5g/L、聚多卡醇1.009g/L、三丙胺 15g/L、檸檬酸0. 6085g/L，所述的緩沖液的pH值為6. 8。
[0010] 另外，本發(fā)明還提供了一種電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀用緩沖液的制備方法，包括如 下步驟： 按配方稱取所需磷酸二氫鉀、檸檬酸、聚多卡醇、吐溫20和十二烷基聚乙二醇醚放入 燒杯中，加入適量的去離子水，加熱攪拌至完全溶解，冷卻后加入三丙胺，攪拌20min，攪拌 均勻后用去離子水定容至1L，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為6. 5-7.0,過濾，即為緩沖液。
[0011] 本發(fā)明的緩沖液經(jīng)研究新加入聚多卡醇和吐溫20,同時(shí)減少三丙胺的用量，三丙 胺的濃度為為12. 0-16. Og/L，而羅氏的三丙胺的濃度達(dá)25g/L，檢測人員長期接觸該緩沖 液，對其身體造成極大的影響，所以，降低毒性較大，揮發(fā)性強(qiáng)的三丙胺的濃度是保證檢測 人員身體健康的重要保障。
[0012] 本發(fā)明的磷酸二氫鉀主要起緩沖液的作用，維持反應(yīng)體系的pH值，而且本發(fā)明聚 多卡醇、吐溫20和十二烷基聚乙二醇醚主要是起增強(qiáng)發(fā)光的作用，提高發(fā)光效率，可以減 少三丙胺的用量。
[0013] 甲胎蛋白（AFP)是一種糖蛋白，正常情況下，這種蛋白主要來自胚胎的肝細(xì)胞， 胎兒出生后約兩周甲胎蛋白從血液中消失，因此正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20 微克/升，AFP主要是檢測診斷原發(fā)性肝癌的一個(gè)特異性臨床指標(biāo)，本發(fā)明實(shí)施例2的電 化學(xué)發(fā)光免疫分析儀用緩沖液與羅氏緩沖液的AFP項(xiàng)目的測試結(jié)果對比相關(guān)線性R達(dá)到 0.9984。
[0014] 癌胚抗原（CEA)是大腸癌組織產(chǎn)生的一種糖蛋白，作為抗原可引起患者的免疫反 應(yīng)?？蓮V泛存在于內(nèi)胚葉起源的消化系統(tǒng)癌，也存在于正常胚胎的消化管組織中，在正常人 血清中也可有微量存在。癌胚抗原是一個(gè)廣譜性腫瘤標(biāo)志物，它能向人們反映出多種腫瘤 的存在，對大腸癌、乳腺癌和肺癌的療效判斷、病情發(fā)展、監(jiān)測和預(yù)后估計(jì)是一個(gè)較好的腫 瘤標(biāo)志物，本發(fā)明實(shí)施例2的電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀用緩沖液與羅氏緩沖液的CEA項(xiàng)目的 測試結(jié)果對比相關(guān)線性R達(dá)到0. 9987。
[0015] 血清游離三碘甲腺原氨酸（FT3)，是診斷甲亢最靈敏的一項(xiàng)指標(biāo)，血清游離甲狀 腺素（FT4)，是反應(yīng)甲狀腺功能狀態(tài)的標(biāo)志物，促甲狀腺激素（TSH)等項(xiàng)目，本發(fā)明實(shí)施例2 的電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀用緩沖液與羅氏緩沖液的FT3項(xiàng)目和FT4項(xiàng)目的測試結(jié)果對比相 關(guān)線性R均達(dá)到0. 99以上，表現(xiàn)為良好的相關(guān)性。
[0016] 孕酮（PROG)是內(nèi)分泌失調(diào)檢查中重要的一項(xiàng)檢查，如果過低則表明垂體和卵巢功 能低下，可能為無排卵或月經(jīng)不調(diào)，或者先兆流產(chǎn)。本發(fā)明實(shí)施例2的電化學(xué)發(fā)光免疫分析 儀用緩沖液與羅氏緩沖液的PR0G項(xiàng)目的測試結(jié)果對比相關(guān)線性R達(dá)到0. 9999。
[0017] 本發(fā)明實(shí)施例1制備的電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀用緩沖液與羅氏緩沖液的AFP、 CEA、FT3、FT4、TSH和PR0G項(xiàng)目的測試結(jié)果對比相關(guān)線性R可以達(dá)到0. 98以上，本發(fā)明實(shí) 施例3制備的電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀用緩沖液與羅氏緩沖液的AFP