免疫特征分析:通向早期診斷和健康監(jiān)測(cè)的途徑的制作方法
【專利說(shuō)明】免疫特征分析：通向早期診斷和健康監(jiān)測(cè)的途徑 奪叉引用
[0001] 本申請(qǐng)要求2012年8月29日提交的、名稱為"免疫特征分析：通向早期診斷和健 康監(jiān)測(cè)的途徑"的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/694, 598的權(quán)益，該臨時(shí)申請(qǐng)通過(guò)引用整體并入本文。
[0002] 本說(shuō)明書中提及的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)均通過(guò)引用并入本文，其程度如 同特別且單獨(dú)地指出每個(gè)單獨(dú)的出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)通過(guò)引用而并入。
【背景技術(shù)】
[0003]監(jiān)測(cè)個(gè)體的健康是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。狀況的早期檢測(cè)可能對(duì)疾病的結(jié)果具有顯著 影響，然而，對(duì)于大多數(shù)狀況，并不存在可在主要癥狀出現(xiàn)前檢測(cè)出疾病的單一測(cè)試。許多 研宄小組曾嘗試開(kāi)發(fā)可以診斷特定狀況的測(cè)試；然而此類測(cè)試僅限于特定疾病或診斷。此 外，對(duì)目前可用的診斷測(cè)試而言，在一段時(shí)間內(nèi)監(jiān)測(cè)健康耗費(fèi)太多的成本和時(shí)間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本文公開(kāi)了用于監(jiān)測(cè)受試者的健康的方法、陣列和試劑盒。在本文公開(kāi)的實(shí)施方 案中，本發(fā)明提供了一種快速、穩(wěn)健且可再現(xiàn)的健康監(jiān)測(cè)方法，從而允許在一段時(shí)間內(nèi)監(jiān)測(cè) 個(gè)體的健康。在一些實(shí)施方案中，該方法包括：a)使復(fù)雜生物樣品與肽陣列接觸，其中所述 肽陣列包含能夠脫靶結(jié)合所述生物樣品中的至少一種抗體的不同的肽；b)測(cè)定所述抗體 與所述肽陣列中的多個(gè)不同的肽的脫革G結(jié)合以形成免疫特征（immunosignature);以及c) 將所述免疫特征與健康狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。
[0005] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種提供治療的方法，該方法包括：a)接收來(lái) 自受試者的復(fù)雜生物樣品；b)使所述復(fù)雜生物樣品與肽陣列接觸，其中所述肽陣列包含能 夠脫靶結(jié)合所述生物樣品中的至少一種抗體的不同的肽；c)測(cè)定所述抗體與多個(gè)不同的 肽的脫靶結(jié)合以形成免疫特征；d)將所述免疫特征與狀況相關(guān)聯(lián)；以及e)提供針對(duì)所述狀 況的治療。
[0006] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種預(yù)防狀況的方法，該方法包括：a)提供來(lái) 自受試者的復(fù)雜生物樣品；b)使所述復(fù)雜生物樣品與肽陣列接觸，其中所述肽陣列包含能 夠脫靶結(jié)合所述復(fù)雜生物樣品中的至少一種抗體的不同的肽；c)測(cè)定所述復(fù)雜生物樣品 與多個(gè)不同的肽的脫靶結(jié)合以形成免疫特征；d)將所述免疫特征與狀況相關(guān)聯(lián)；以及e)接 受針對(duì)所述狀況的處理。
[0007] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種診斷方法，該方法包括：a)接收來(lái)自受試 者的復(fù)雜生物樣品；b)使所述復(fù)雜生物樣品與肽陣列接觸，其中所述肽陣列包含能夠脫靶 結(jié)合所述生物樣品中的至少一種抗體的不同的肽；c)測(cè)定所述抗體與所述肽陣列中的多 個(gè)不同的肽的脫靶結(jié)合以形成免疫特征；以及d)基于所述免疫特征診斷狀況。
[0008] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于接收、記錄（log)和稀釋來(lái)自受試者 的生物樣品的系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，用于接收、記錄和稀釋來(lái)自受試者的生物系統(tǒng)的系 統(tǒng)是完全自動(dòng)化的。
[0009] 在一些實(shí)施方案中，一種免疫特征分析（immunosignaturing)系統(tǒng)包含自動(dòng)化裝 置，該自動(dòng)化裝置由下列組件組成：1)用于接收、記錄和稀釋來(lái)自受試者的生物樣品的自 動(dòng)化系統(tǒng)；2)用于自動(dòng)化的免疫特征分析測(cè)試的隔室，所述免疫特征分析測(cè)試包括：a)將 稀釋的樣品施加至肽陣列，b)孵育特定時(shí)間，c)洗滌并除去未結(jié)合的樣品，d)施加第二抗 體溶液特定時(shí)間，e)除去第二抗體，以及f)干燥并掃描所述陣列，以測(cè)定各個(gè)斑點(diǎn)的熒光； 以及3)用檢測(cè)器檢測(cè)所述熒光。
[0010] 本文提供了用于產(chǎn)生可與本文所述的免疫特征測(cè)試結(jié)合使用的新型陣列的方法 和裝置。在一些實(shí)施方案中，制造所述陣列以減少在陣列上生成雜聚物所必需的圖案化步 驟的數(shù)目。在其他實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的方法和裝置采用新型圖案化算法來(lái)同時(shí)添加多 個(gè)單體。在一些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的算法可顯著減少合成大陣列所需的圖案化步驟的 數(shù)目，從而導(dǎo)致更低的成本和更短的制造時(shí)間。
[0011] 在一些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的方法和裝置提供了一種陣列，該陣列包含多個(gè)固 定至固體支持體上不同位置的、原位合成的具有可變長(zhǎng)度的聚合物，其中聚合物的原位合 成包括以下步驟：將第一單體添加至所述固體支持體上預(yù)定部分的位置；將第二單體添加 至所述固體支持體上預(yù)定部分的位置，其中用于第二單體的預(yù)定部分的位置包括含有第一 單體的位置和不含單體的位置；將第三單體添加至所述固體支持體上預(yù)定部分的位置，其 中用于第二單體的預(yù)定部分的位置包括含有第一和第二單體的位置、含有第二單體的位置 以及不含單體的位置；以及用限定的一組單體重復(fù)步驟a- c，直到所述聚合物達(dá)到所期望 的平均長(zhǎng)度并且所述部分的總和總計(jì)至少為100%。
[0012] 在其他實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的方法和裝置還提供了一種制造陣列的方法，該陣 列包含多個(gè)固定至固體支持體上不同位置的、原位合成的具有可變長(zhǎng)度的聚合物，該方法 包括以下步驟：提供基底作為在其上合成聚合物的固體支持體；將第一單體添加至所述固 體支持體上預(yù)定部分的位置；將第二單體添加至所述固體支持體上預(yù)定部分的位置，其中 用于第二單體的預(yù)定部分的位置包括含有第一單體的位置和不含單體的位置；將第三單體 添加至所述固體支持體上預(yù)定部分的位置，其中用于第二單體的預(yù)定部分的位置包括含有 第一和第二單體的位置、含有第二單體的位置以及不含單體的位置；以及用限定的一組單 體重復(fù)步驟b-d，直到所述聚合物達(dá)到所期望的平均長(zhǎng)度并且所述部分的總和總計(jì)至少為 100%〇
[0013] 在另外的其他實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的方法和裝置提供了一種使用本文所述的陣 列來(lái)監(jiān)測(cè)受試者的健康狀態(tài)的方法，該方法包括以下步驟：從所述受試者采集生物樣品； 將所述生物樣品與所述陣列雜交；確定所述樣品中與所述陣列雜交的成分；評(píng)估雜交程 度；以及確定所述受試者的健康狀態(tài)。所公開(kāi)的陣列可用于產(chǎn)生如本文所述的免疫特征，而 且還可用于使用微芯片陣列確定復(fù)雜生物樣品中靶標(biāo)的結(jié)合活性的其他診斷和治療測(cè)試。
[0014] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種試劑盒。試劑盒可包含用于從受試者抽取 少量血液的手指刺破裝置和用于收集血液樣品的接收表面。在一些實(shí)施方案中，該試劑盒 包含關(guān)于其使用的書面說(shuō)明。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1為測(cè)試#1中的組間和組內(nèi)相對(duì)差異的視覺(jué)表示。對(duì)120個(gè)肽和120個(gè)患 者樣品中的每一個(gè)的值作圖，藍(lán)色指示低結(jié)合而紅色指示高結(jié)合。使用歐幾里德距離 (Euclidean distance)作為相似性度量的分級(jí)聚類用來(lái)對(duì)肽（Y軸）和患者（X軸）進(jìn)行聚 類（cluster)。最左邊的層級(jí)就是基于這種聚類。
[0016] 圖2示出了來(lái)自測(cè)試#1的樣品的熱圖。A圖示出了使用120個(gè)選定特征（feature) 的訓(xùn)練數(shù)據(jù)集的熱圖。B圖示出了使用相同的120個(gè)肽進(jìn)行聚類的未混合的測(cè)試數(shù)據(jù)。
[0017] 圖3示出了來(lái)自測(cè)試#2的樣品的熱圖。1516個(gè)樣品（X軸）與255個(gè)預(yù)測(cè)肽（Y 軸）中的每一個(gè)的值一起示出。每種疾病與患者總數(shù)（在括號(hào)內(nèi)注明）一起列出。
[0018] 圖4為測(cè)試#1的受試者工作特征（R0C)曲線的圖形表示。針對(duì)來(lái)自測(cè)試#1的測(cè) 試數(shù)據(jù)的各個(gè)疾病組群（cohort)，計(jì)算靈敏度和特異性。對(duì)于每個(gè)分類算法，針對(duì)每種疾病 繪制單獨(dú)的R0C曲線并計(jì)算曲線下面積（AUC)值。SVM的AUC以灰色顯示。A圖為針對(duì)乳 腺癌的SVM圖的特異性/靈敏度AUC的圖形表示。B圖為針對(duì)腦癌的SVM圖的特異性/靈 敏度AUC的圖形表示。C圖為針對(duì)食管癌的SVM圖的特異性/靈敏度AUC的圖形表示。D 圖為針對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的SVM圖的特異性/靈敏度AUC的圖形表示。E圖為針對(duì)健康對(duì)照 的SVM圖的特異性/靈敏度AUC的圖形表示。F圖為針對(duì)胰腺癌的SVM圖的特異性/靈敏 度AUC的圖形表示。
[0019] 圖5為測(cè)試#1的受試者工作特征（R0C)曲線的圖形表示。PCA的曲線下面積（AUC) 以灰色顯示。A圖為針對(duì)乳腺癌的PCA圖的特異性/靈敏度AUC的圖形表示。B圖為針對(duì) 腦癌的PCA圖的特異性/靈敏度AUC的圖形表示。C圖為針對(duì)食管癌的PCA圖的特異性/ 靈敏度AUC的圖形表示。D圖為針對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的PCA圖的特異性/靈敏度AUC的圖形 表示。E圖為針對(duì)健康對(duì)照的PCA圖的特異性/靈敏度AUC的圖形表示。F圖為針對(duì)胰腺 癌的PCA圖的特異性/靈敏度AUC的圖形表示。
[0020] 圖6為測(cè)試#1的受試者工作特征（R0C)曲線的圖形表示。NB的曲線下面積（AUC) 以灰色顯示。A圖為針對(duì)乳腺癌的NB圖的特異性/靈敏度AUC的圖形表示。B圖為針對(duì)腦 癌的NB圖的特異性/靈敏度AUC的圖形表示。C圖為針對(duì)食管癌的NB圖的特異性/靈敏 度AUC的圖形表示。D圖為針對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的NB圖的特異性/靈敏度AUC的圖形表示。 E圖為針對(duì)健康對(duì)照的NB圖的特異性/靈敏度AUC的圖形表示。F圖為針對(duì)胰腺癌的NB 圖的特異性/靈敏度AUC的圖形表示。
[0021] 圖7為測(cè)試#1的受試者工作特征（R0C)曲線的圖形表示。LDA的曲線下面積（AUC) 以灰色顯示。A圖為針對(duì)乳腺癌的LDA圖的特異性/靈敏度AUC的圖形表示。B圖為針對(duì) 腦癌的LDA圖的特異性/靈敏度AUC的圖形表示。C圖為針對(duì)食管癌的LDA圖的特異性/ 靈敏度AUC的圖形表示。D圖為針對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的LDA圖的特異性/靈敏度AUC的圖形 表示。E圖為針對(duì)健康對(duì)照的LDA圖的特異性/靈敏度AUC的圖形表示。F圖為針對(duì)胰腺 癌的LDA圖的特異性/靈敏度AUC的圖形表示。
[0022] 圖8為測(cè)試#1的受試者工作特征（R0C)曲線的圖形表示。k-NN的曲線下面積 (AUC)以灰色顯示。A圖為針對(duì)乳腺癌的k-NN圖的特異性/靈敏度AUC的圖形表示。B圖 為針對(duì)腦癌的k-NN圖的特異性/靈敏度AUC的圖形表示。C圖為針對(duì)食管癌的k-NN圖的 特異性/靈敏度AUC的圖形表示。D圖為針對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的k-NN圖的特異性/靈敏度 AUC的圖形表示。E圖為針對(duì)健康對(duì)照的k-NN圖的特異性/靈敏度AUC的圖形表示。F圖 為針對(duì)胰腺癌的k-NN圖的特異性/靈敏度AUC的圖形表示。
[0023] 圖9為四個(gè)分類器（classifier)的圖形表示。A圖為PCA的圖形表示，對(duì)前兩個(gè) 主分量作圖。B圖為L(zhǎng)DA的圖形表示，X和Y軸描繪了前兩個(gè)線性判別量（discriminant)。 C圖為NB的圖形表示，對(duì)預(yù)測(cè)變量作圖。D圖為k-NN的圖形表示，對(duì)組間距離（groupwise distance)作圖。
[0024] 圖10為來(lái)自測(cè)試#2的255個(gè)分類器肽中的3個(gè)分類器肽的線型圖。該強(qiáng)度譜在 X軸上顯示了個(gè)體，疾病用空格隔開(kāi)，并且在Y軸上顯示了各個(gè)肽的log 1(l強(qiáng)度。A圖示出了 對(duì)疾病6和9為高而對(duì)所有其他疾病為低的肽的線型圖。B圖示出了對(duì)疾病11為高的肽的 線型圖。C圖示出了對(duì)疾病1和部分疾病9為高的肽。
[0025] 圖11為示出了可與本發(fā)明的示例實(shí)施方案結(jié)合使用的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的第一示例架 構(gòu)的框圖。
[0026] 圖12為示出了可與本發(fā)明的示例實(shí)施方案結(jié)合使用的計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)的示意圖。
[0027] 圖13為示出了可與本發(fā)明的示例實(shí)施方案結(jié)合使用的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的第二示例架 構(gòu)的框圖。
[0028] 圖14示出了具有不同肽密度的本發(fā)明的示例性陣列。
[0029] 圖15為示出了多名受試者在接受流感疫苗后一段時(shí)間內(nèi)的免疫特征譜的熱圖。
[0030] 圖16為示出了免疫特征分析結(jié)合模式的熱圖。A圖示出了在1天的過(guò)程中來(lái)自同 一受試者的不同生物樣品的免疫特征。B圖示出了 A圖的一部分的特寫圖。
[0031] 圖17為示出了在數(shù)月內(nèi)監(jiān)測(cè)的1名受試者的免疫特征分析結(jié)合模式的熱圖。
[0032] 圖18為示出了 3名受試者在21天的時(shí)程中的免疫特征分析結(jié)合模式的熱圖。A 圖示出了當(dāng)檢測(cè)到IgM免疫球蛋白的結(jié)合時(shí)，具有約10, 000個(gè)肽的肽微陣列的聚類。B圖 示出了當(dāng)檢測(cè)到IgM免疫球蛋白的結(jié)合時(shí)，具有50個(gè)個(gè)人肽（personal peptides)的肽微 陣列的聚類。C圖示出了當(dāng)檢測(cè)到IgG免疫球蛋白的結(jié)合時(shí)，具有約10, 000個(gè)肽的肽微陣 列的聚類。D圖示出了當(dāng)檢測(cè)到IgG免疫球蛋白的結(jié)合時(shí)，具有50個(gè)個(gè)人肽的肽微陣列的 聚類。
[0033] 圖19為示出了采用免疫特征分析結(jié)合模式分析對(duì)兩名受試者進(jìn)行的30天健康監(jiān) 測(cè)分析的熱圖。
[0034] 圖20為示出了在30天時(shí)程中的第17天接受流感疫苗的受試者的免疫特征分析 結(jié)合模式的熱圖。在不同的時(shí)間范圍（time-frame)上示出了該受試者對(duì)22個(gè)所選肽序列 的免疫特征分析結(jié)合譜。
[0035] 圖21為示出了在圖20中表征的受試者在2013年3月5日被診斷為支氣管炎的 熱圖。
[0036] 圖22為示出了在圖20中表征的受試者在2011年12月11日被癥狀后診斷為流 感的熱圖。
[0037] 圖23為示出了接受肝炎疫苗治療并在此后3個(gè)月接受第一次加強(qiáng)治療的受試者 的免疫特征分析結(jié)合模式的熱圖。
[0038] 圖24示出了多種傳染病的分類的匯總。A圖為示出了登革熱、西尼羅病毒（WNV)、 梅毒、乙型肝炎病毒（HBV)、正常血液、溪谷熱和丙型肝炎病毒的聚類免疫特征分析結(jié)合譜 的熱圖。B圖為PCA分類的圖形表示。
[0039] 圖25為本發(fā)明的免疫特征分析系統(tǒng)的組件的示意圖。
[0040] 圖26 :A圖不出了嗤囷體展不文庫(kù)。B圖不出了狀微陣列。
[0041] 圖27示出了作為圖案化步驟數(shù)的函數(shù)的合成肽的平均長(zhǎng)度。X軸為圖案化循環(huán)的 數(shù)目，而Y軸為平均肽長(zhǎng)度。通過(guò)使用任意數(shù)目的圖案化循環(huán)，本文公開(kāi)的圖案化算法將圖 案化步驟減少了幾乎2倍。
[0042] 圖28示出了使用標(biāo)準(zhǔn)的逐層法（layer by layer approach)與新型圖案化算法 相比，通過(guò)以單體形式施加所有20種氨基酸而產(chǎn)生的結(jié)果。
[0043] 圖29示出了免疫特征分析實(shí)施方案的結(jié)果，在該實(shí)施方案中用少于60個(gè)步驟即 獲得平均12個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
[0044] 圖30示出了使用16種不同的氨基酸由優(yōu)化算法的70個(gè)步驟產(chǎn)生的分布。
[0045] 圖31示出了在肽陣列產(chǎn)生后選擇的肽的長(zhǎng)度分布。
[0046] 圖32為示出了 3個(gè)、4個(gè)或5個(gè)氨基酸長(zhǎng)的可能序列的分布的圖。
[0047] 圖33示出了對(duì)于所選擇的肽文庫(kù)，作為肽中的位置的函數(shù)的氨基酸組成。 發(fā)明詳沭
[0048] "健康"是一種復(fù)雜的狀態(tài)，其代表了幾乎所有人類活動(dòng)和交互的不斷變化的結(jié) 果。這使得難以定量地定義健康狀態(tài)。必須系統(tǒng)性地測(cè)量數(shù)以千計(jì)的生化和物理屬性。健 康監(jiān)測(cè)中的一大挑戰(zhàn)是受試者對(duì)各種刺激的響應(yīng)的復(fù)雜性。大多數(shù)生物每天暴露于多種不 同的刺激，然而一些生物具有能夠響應(yīng)于此類刺激并防止引發(fā)或形成疾病的生物結(jié)構(gòu)和過(guò) 程的系統(tǒng)。為了適當(dāng)?shù)匦惺构δ埽祟愊到y(tǒng)必須檢測(cè)很多種刺激，如病毒或寄生蟲(chóng)的存在， 并在體內(nèi)引發(fā)針對(duì)這些物質(zhì)、異常細(xì)胞和/或組織的響應(yīng)。
[0049] 健康監(jiān)測(cè)中的一個(gè)必然的挑戰(zhàn)是受試者對(duì)復(fù)雜刺激的響應(yīng)的復(fù)雜性。例如，由自 身體內(nèi)的病變細(xì)胞產(chǎn)生的生理響應(yīng)可以不同于對(duì)感染的生理響應(yīng)。然而，檢測(cè)、處理、識(shí)別 和作用于例如感染或癌癥的早期體征的能力可對(duì)受試者的健康具有顯著影響。如果在腫瘤 細(xì)胞有時(shí)間繁殖、抑制免疫系統(tǒng)、形成轉(zhuǎn)移性集落并造成組織損傷前診斷出癌癥，則人們可 有望更有利地對(duì)治療作出響應(yīng)。
[0050] 類似地，如果在感染后不久檢測(cè)出受試者體內(nèi)存在病原體，則可在宿主炎癥阻止 侵入物進(jìn)入之前以及在病原體負(fù)荷變得在免疫上具有壓倒性優(yōu)勢(shì)之前施用抗微生物劑。如 果早期檢測(cè)到諸如狼瘡的自身免疫疾病，而自身抗體水平低，則用以減弱免疫爆發(fā)的治療 可能有效得多。幸運(yùn)的是，免疫系統(tǒng)持續(xù)監(jiān)測(cè)受試者的健康狀態(tài)。然而，用于健康監(jiān)測(cè)和早 期檢測(cè)的穩(wěn)健、可靠且有效的方法仍然是一個(gè)尚未得到滿足的需求。
[0051] 免疫特征分析是微陣列和噬菌體技術(shù)的結(jié)合體，其展示了體液免疫應(yīng)答的復(fù)雜性 并將其轉(zhuǎn)化成機(jī)器可讀的、定量的形式。免疫特征分析在早期準(zhǔn)確地檢測(cè)健康狀態(tài)的甚至 微小的擾動(dòng)。對(duì)于抗體組庫(kù)（repertoires)的這些綜合性測(cè)量提供了用于快速、廉價(jià)及早 期診斷任何患病狀態(tài)的手段；最終，對(duì)免疫特征的持續(xù)監(jiān)測(cè)可提供在癥狀出現(xiàn)之前檢測(cè)危 險(xiǎn)疾病狀態(tài)的手段。