高效液相色譜法測定設施番茄土壤低分子量有機酸的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種高效液相色譜法測定設施番茄土壤低分子量有機酸的方法，屬于 土壤低分子量有機酸的檢測方法的技術領域。
【背景技術】
[0002] 低分子量有機酸（LOAs)是一類廣泛存在于自然界中的含羧基官能團化合物，它 們主要來源于有機殘體的分解、微生物代謝、植物根系分泌以及施入土壤中的有機物的轉 化。研宄表明，由于植物根系自身具有分泌有機酸的作用，低分子量有機酸顯著存在于土 壤-根系界面中，它們能夠加速土壤礦物的溶解，促進養(yǎng)分元素的釋放，加速土壤酸化，改 變土壤理化性質，進而影響植物的生長發(fā)育（張錫洲，2007 ;Walker，2003)。
[0003] 目前國內外測定有機酸的方法主要有化學法、離子色譜法、氣相色譜法、液相色譜 法以及毛細管電泳等方法（高向陽，2013 ;唐美華，2009 ;鐘穎，2009 Joanna，2014)。高效 液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，簡稱HPLC)是一種區(qū)別于經(jīng)典液 相色譜的方法，基于儀器的高效能分離手段，因其高速、高效、高靈敏度、高自動化的特點， 廣泛應用于各個領域，也是目前用于有機酸測定的重要方法。
[0004] 番前（Lycopersicon esculentum)作為人們最常食用的主要蔬菜品種，是我國主 要設施作物之一。有研宄表明，根系分泌的低分子量有機酸可以調控設施番前的生長發(fā)育、 對土壤養(yǎng)分的利用及對環(huán)境的適應（Kravchenko, 2003 ;Imas，1997)。因此，明確番前分泌 低分子量有機酸的特征及生長環(huán)境對其分泌有機酸的影響，可為揭示番茄對土壤養(yǎng)分的利 用及其對環(huán)境的適應機制，調控其生長發(fā)育，提高其產(chǎn)量和品質提供理論依據(jù)。本發(fā)明主要 解決了在利用高效液相色譜法測定番茄土壤中低分子量有機酸時，土壤樣品前處理方法、 流動相的選擇和色譜條件的設置等問題，為利用HPLC法測定設施番茄土壤中低分子量有 機酸提供一種可靠快速方法。
[0005] 低分子量有機酸的分析方法由于其靈活性，近年來成為研宄的熱點。目前國內外 的分析方法主要有化學法、離子色譜法、氣相色譜法、液相色譜法以及毛細管電泳等方法 (高向陽，2013 ;唐美華，2009 ;鐘穎，2009 Joanna，2014)?；瘜W法多采用滴定方法，容易受 到多種因素干擾且只能測定有機酸的總量，分析精度低誤差大；色譜法能一次測量多種有 機酸，實現(xiàn)較好的分離，但薄層色譜法定量精度低對含量較低的低分子有機酸的測定顯然 很難滿足需求；氣相色譜（GC)測定有機酸的樣品前處理過程較為繁瑣，需將有機酸酯化后 才可測定，衍生化過程必須保證高分辨率和靈敏度，耗時較長（Adams MA，1999);毛細管電 泳技術（CE)具有很好的分離效果，由于CE很難和質譜檢測聯(lián)用而沒有得到廣泛應用（Chen ZL，1999);高效液相色譜具有分析靈敏度高、定量精度高等特點，但對流動相、色譜條件要 求較高。不同的流動相、色譜條件會影響有機酸的分離及檢測，且由于土壤中根系分泌的 低分子量有機酸量少，所以目前沒有一種適合的方法能夠用于土壤中低分子量有機酸的測 定。

【發(fā)明內容】

[0006] 發(fā)明目的：為了克服現(xiàn)有技術中存在的不足，本發(fā)明提供一種用于HPLC法測定設 施番茄栽培土壤中低分子量有機酸含量的方法。
[0007] 技術方案：為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為：
[0008] 一種高效液相色譜法測定設施番茄土壤低分子量有機酸的方法，包括以下步驟：
[0009] 1)樣品收集與預處理；
[0010] 2)配置流動相及設置色譜條件；
[0011] 3)配置標準溶液并建立回歸方程；
[0012] 4)樣品待測溶液檢測；
[0013] 所述標準溶液為有機酸溶液；所述流動相由甲醇與pH 2. 6的lOmmol/L 1^#04溶 液按體積比為3:97組成。
[0014] 進一步的，在本發(fā)明中，步驟2)所述色譜條件為流速0. 8mL/min，檢測波長220nm， 柱溫25°C，進樣量20 μ L。
[0015] 進一步的，在本發(fā)明中，步驟2)所述流動相的配置方法為：首先配制lOmmol/L KH 2PO4溶液，并用lmol/L H 3P04溶液調節(jié)所述KH 2P04溶液pH至2. 6,再將甲醇與調節(jié)過pH 的KH2PO4溶液分別進行抽濾及超聲波震動30min，按體積比為3:97配制流動相。
[0016] 進一步的，在本發(fā)明中，步驟1)所述樣品收集的具體方法為：采集設施番茄距離 根系0. 5cm以內的厚層土壤樣品，并于-24°c下冷凍保存。
[0017] 進一步的，在本發(fā)明中，步驟1)所述樣品預處理的具體方法為：
[0018] 1-1)浸提：稱取土壤樣品，加入體積比為3:1的0. lmol/L NaOH溶液和飽和NaCl 溶液浸提20h ;
[0019] 1-2)離心：將步驟1-1)所得浸提液離心，取上清液過濾；
[0020] 1-3)調節(jié)pH :將步驟1-2)所得濾液用lmol/L HCl溶液調節(jié)pH至2. 6,室溫下靜 置 16h ;
[0021] 1-4)抽濾：將步驟1-3)所得上清液通過0. 45 μ m濾膜抽濾；
[0022] 1-5)萃?。喝〔襟E1-4)所得濾液用乙酸乙酯萃取，棄去水相，合并酯相；
[0023] 1-6)旋轉蒸發(fā)：將步驟1-5)所得的剩余酯相在40°C下旋轉蒸發(fā)，所得殘渣溶于 ImL超純水中即得土壤樣品待測溶液。
[0024] 進一步的，在本發(fā)明中，步驟3)所述標準溶液包括11種有機酸標準溶液，其中，分 別為lmg/mL的酒石酸、甲酸、蘋果酸、丙二酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸和丙酸標 準溶液，以及3mg/mL的草酸標準溶液。由于土壤樣品中草酸的濃度較高，因此草酸標樣的 系列濃度范圍需更大。
[0025] 進一步的，在本發(fā)明中，所述建立回歸方程的具體方法為：在相應的色譜條件下分 別測定所述有機酸標準溶液，用保留時間對有機酸的種類進行定性判定；將標準液配制成 系列濃度梯度的標準混合溶液并進行檢測，以混合標準液峰高與其質量濃度進行線性回歸 分析；以峰高為縱坐標，以各進樣濃度為橫坐標，得到相應的有機酸的線性回歸方程及其檢 測限。
[0026] 進一步的，在本發(fā)明中，所述系列濃度梯度的標準混合溶液的具體配制方法為：根 據(jù)混合后的標準混合溶液的總體積和其中各組分的最終濃度，得出各標準溶液所需量，將 配置好的標準溶液進行混合，制成標準混合溶液后進行檢測，根據(jù)結果制成標準曲線。
[0027] 進一步的，在本發(fā)明中，樣品待測溶液檢測后，進行重現(xiàn)性和精密度的檢驗：取同 一批次土壤樣品待測溶液，加入已知濃度的混合標準溶液后，測定其中的有機酸含量，計算 加標回收率及相對標準偏差。
[0028] 進一步的，在本發(fā)明中，所述標準溶液和樣品待測溶液在進行測定前均需用 0. 45 μ m濾膜過濾。
[0029] 有益效果：本發(fā)明提供的高效液相色譜法測定設施番茄土壤低分子量有機酸的方 法，與現(xiàn)有技術相比，可快速、準確、同時測定土壤中常見的11種低分子量有機酸（草酸、酒 石酸、甲酸、蘋果酸、丙二酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸、丙酸）的含量。根據(jù)該方 法測定的11種土壤低分子量有機酸的回收率在85. 57%~100. 20%之間，相對標準偏差為 0. 17%~5. 84%之間，檢測限較低，測定的重現(xiàn)性和精密度較好，說明該方法能夠滿足土壤 中低分子量有機酸mg kg<級痕量檢測要求。
【附圖說明】
[0030] 圖1為本發(fā)明方法的流程示意圖；
[0031] 圖2為本發(fā)明實施例中的11種有機酸混合標樣色譜圖，其中1.草酸；2.酒石酸； 3.甲酸；4.蘋果酸；5.丙二酸；6乳酸；7.乙酸；8.檸檬酸；9.富馬酸；10.琥珀酸；11.丙 酸。
【具體實施方式】
[0032] 下面結合附圖對本發(fā)明作更進一步的說明。
[0033] 如圖1所示為一種高效液相色譜法測定設施番茄土壤低分子量有機酸的方法的 流程示意圖，為探索利用高效液相色譜法測定設施番茄土壤低分子量有機酸的適宜色譜條 件，本發(fā)明以NaOH和NaCl混合溶液為提取劑提取11種土壤低分子量有機酸，通過優(yōu)化影 響低分子量有機酸分離度的流動相濃度、pH、流速、有機改良劑的添加比例、檢測波長等條 件，確定了高效液相色譜法測定設施番茄土壤低分子量有機酸的最佳色譜條件，并考察了 該方法的重現(xiàn)性和精密度。技術方案如下：
[0034] 采集設施番茄土壤樣品，于_24°C冰柜中冷凍保存，并用適當?shù)姆椒ㄌ崛〕鐾寥廊?液，待測；配制一系列濃度梯度的有機酸標準溶液在最適色譜條件下先定性分析得出各有 機酸的種類及相應的出峰時間，再利用各濃度梯度，定量分析得到11種有機酸峰高和其濃 度的回歸方程；在適宜的色譜條件下測定提取出的土壤溶液，得到土壤中各有機酸的含量， 并對其進行加標回收率以及相對標準偏差實驗，以檢測該方法的精密度和重現(xiàn)性。
[0035] 實施例
[0036] 第一步：設施番茄土壤樣品收集
[0037] 采集設施栽培番茄距離根系0. 5cm以內的厚層土，并于_24°C下冷凍保存，以防止 土壤中低分子量有機酸的分解。
[0038] 第二步：儀器設備與藥品準備
[0039] (1)儀器設備
[0040] 10-1000 μ L DRAGONLAB可調式移液槍，上海萬島儀器科技有限公司；
[0041] TDL-5A沉淀離心器，江蘇正基儀器有限公司；
[0042] KH2200B超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；
[0043] QL-Ol溶劑過濾器，天津旗美科技有限公司；
[0044] W201旋轉蒸發(fā)器，南京科爾儀器設備有限公司；
[0045] LC-600高效液相色譜儀，南京科捷儀器有限公司。
[0046] (2)藥品試劑
[0047] 草酸，分析純，凌峰化學試劑有限公司，上海；
[0048] 酒石酸，分析純，凌峰化學試劑有限公司，上海；
[0049] 甲酸，分析純，西隴化工股份有限公司，上海；
[0050] 蘋果酸，生化試劑，惠興生化試劑有限公司，上海；
[0051] 丙二酸，分析純，凌峰化學試劑有限公司，上海；
[0052] 乳酸，分析純，西隴化工股份有限公司，上海；
[0053] 乙酸，分析純，中博化工