一種穩(wěn)定的丙型肝炎病毒核心抗原酶結(jié)合物稀釋液的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及丙型肝炎病毒核心抗原檢測(cè)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（HepatitisCvirus,HCV)感染而引起的一種全球 性傳染病。據(jù)估計(jì)目前全世界有1. 7億丙肝病毒感染者，我國(guó)的丙肝感染率大約為30%，目 前至少有4000~6000萬(wàn)丙肝患者。其中有80~85%的感染者將發(fā)展為慢性丙型肝炎，其中又 有20%可發(fā)展為肝纖維化，最終有4~5%的肝纖維化患者發(fā)生肝細(xì)胞性肝癌，危害十分嚴(yán)重。
[0003]目前，尚無(wú)針對(duì)丙型肝炎病毒的特效治療藥物，丙型肝炎疫苗的研制也因HCV快 速變異而困難重重，短期內(nèi)難有突破進(jìn)展。因此，HCV的早期診斷對(duì)于篩查HCV傳染源、指 導(dǎo)臨床治療和預(yù)后判斷有重大意義。
[0004] 現(xiàn)有HCV常用檢測(cè)方式主要有：（1)間接檢測(cè)：用來(lái)檢測(cè)體內(nèi)抗HCV抗體，由于HCV 感染后到抗HCV抗體的出現(xiàn)有一個(gè)約40~70天的"窗口期"，所以抗HCV不能作為HCV感染 的早期診斷指標(biāo)；（2)直接檢測(cè)：通過(guò)定性或定量檢測(cè)HCV病毒粒子的組成成分以確定病毒 的存在。由于HCV感染后6 ~15天感染者血液中即有HCV-RNA的出現(xiàn)，并在血清陽(yáng)轉(zhuǎn)之前 達(dá)到一個(gè)較高的水平，因此采用該檢測(cè)技術(shù)對(duì)獻(xiàn)血員進(jìn)行常規(guī)篩選可以大大降低"窗口期" 感染的危險(xiǎn)，雖然定性或定量檢測(cè)HCV病毒粒子的方法具有早期、敏感和特異等特點(diǎn)，但由 于該技術(shù)需要昂貴精密的儀器、較高的實(shí)驗(yàn)技巧、昂貴的試劑，且容易導(dǎo)致交叉污染導(dǎo)致假 陽(yáng)性偏高，導(dǎo)致其很難推廣到單個(gè)獻(xiàn)血員，在發(fā)展中國(guó)家的應(yīng)用也受到很大程度的限制。
[0005] 鑒于以上HCV病毒檢測(cè)方法的局限性，盡快研制出快速、準(zhǔn)確、低廉并在各大醫(yī)院 可普及的HCV檢測(cè)方法成為必要。目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上已有兩家體外診斷試劑公司生產(chǎn)的丙型 肝炎病毒核心抗原檢測(cè)試劑盒（ELISA)是針對(duì)于HCV核心抗原的檢測(cè)，從而使HCV感染的 "窗口期"大大縮短的相關(guān)報(bào)道。然而由于丙型肝炎病毒核心抗原檢測(cè)試劑盒（ELISA)酶結(jié) 合物不穩(wěn)定常出現(xiàn)對(duì)樣品檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確的現(xiàn)象。所以需要在酶結(jié)合物稀釋液中加入穩(wěn)定 劑，傳統(tǒng)的酶稀釋液常用含有無(wú)關(guān)高濃度蛋白1%BSA或10%動(dòng)物血清等來(lái)作為酶的穩(wěn)定劑， 然而B(niǎo)SA市場(chǎng)價(jià)格較高，動(dòng)物血清運(yùn)輸、保存不方便。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)于丙型肝炎病毒核心抗原檢測(cè)試劑盒（ELSA)酶結(jié)合物不穩(wěn)定問(wèn)題，本發(fā)明提 供一種穩(wěn)定高效的酶結(jié)合物稀釋液配方，保證試劑能在2~8°C條件下穩(wěn)定放置1年并且降 低了成本。
[0007] 本發(fā)明是通過(guò)以下措施實(shí)現(xiàn)的： 一種丙型肝炎病毒核心抗原檢測(cè)試劑盒（ELSA)酶結(jié)合物稀釋液 ① 液：用PBST為緩沖液，BSA無(wú)關(guān)蛋白為穩(wěn)定劑的酶結(jié)合物稀釋液的試劑盒為第一組 合； ② 液：用PBST為緩沖液，BSA和Casein無(wú)關(guān)蛋白為穩(wěn)定劑的酶結(jié)合物稀釋液的試劑盒 為第二組合； ③ 液：用Tris-HCl為緩沖液，BSA和Casein無(wú)關(guān)蛋白為穩(wěn)定劑的酶結(jié)合物稀釋液的試 劑盒為第三組合； ④ 液：用PBST為緩沖液，Casein無(wú)關(guān)蛋白為穩(wěn)定劑的酶結(jié)合物稀釋液的試劑盒為第四 組合。
[0008] 四種酶結(jié)合物稀釋液編號(hào)和內(nèi)容如下： ①PBST+BSA+防腐劑（酶用量1:15〇00 ) ② PBST+BSA+Casein+ 防腐劑（酶用量 1:10000) ③ TBST+BSA+Casein+ 防腐劑（酶用量 1:10000) ④PBST+Casein+防腐劑（酶用量1:6000 ) 用四種組合的HCV抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒分別對(duì)質(zhì)控血清進(jìn)行檢測(cè)。按中國(guó)生物 制品規(guī)程要求分別進(jìn)行對(duì)40°C放置試劑盒的檢測(cè)和37°C放置3d試劑盒的破壞性穩(wěn)定性檢 測(cè)。
[0009] 本發(fā)明的有益效果： 本發(fā)明提供的酶結(jié)合物稀釋液，不僅可以在2~8°C和37°C環(huán)境中穩(wěn)定長(zhǎng)期保存，穩(wěn)定 性良好，可以長(zhǎng)久應(yīng)用，而且也節(jié)約了成本，既經(jīng)濟(jì)又好用。
[0010] 為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明。
[0011] 實(shí)施例1 酶結(jié)合物稀釋液的組分及濃度為 (1)組分1 (PBST緩沖液） KH2P04 0. 2g Na2HP04 ? 12H20 2. 9g KC1 0. 2g NaCl 8.Og Tween-20 0. 05% 0. 5mL 加蒸餾水至l〇〇〇mL，4°C存放備用； 組分2 (穩(wěn)定劑） 牛血清白蛋白（BSA) 0.lg 加洗滌緩沖液至100mL，4°C存放備用； 組分3 無(wú)。
[0012] (2)用該組合的HCV核心抗原檢測(cè)試劑盒（ELISA)對(duì)質(zhì)控血清進(jìn)行檢測(cè)。按中國(guó) 生物制品規(guī)程要求分別進(jìn)行對(duì)40°C放置試劑盒的檢測(cè)和37°C放置3d試劑盒的破壞性穩(wěn)定 性檢測(cè)。
[0013] 實(shí)施例2 組分1 (PBST洗滌緩沖液） KH2P04 0. 2g Na2HP04 ? 12H20 2. 9g KC1 0. 2g NaCl 8. Og Tween-20 0. 05% 0. 5mL 加蒸餾水至l〇〇〇mL，4°C存放備用； 組分2 牛血清白蛋白（BSA)+Casein 0?lg。
[0014] 實(shí)施例3 組分1 (TBST緩沖液） Tris-HCl(50mM) 6.05g NaCl 8.Og Tween-20 0. 05% 0. 5mL 加蒸餾水至l〇〇〇mL，4°C存放備用； 組分2 牛血清白蛋白（BSA)BSA+Casein0.lg加洗滌緩沖液至100mL，4°C存放備用； 組分3 硫柳汞 0. 1%。
[0015] 方法同實(shí)施例1 加洗滌緩沖液至l〇〇mL，4°C存放備用。
[0016] 實(shí)施例4 組分1 (PBST洗滌緩沖液） KH2P04 0. 2g Na2HP04 ? 12H20 2. 9g KC1 0. 2g NaCl 8.Og Tween-20 0. 05% 0. 5mL 加蒸餾水至l〇〇〇mL，4°C存放備用； 組分2 Casein 0.lg 加洗滌緩沖液至100mL，4°C存放備用； 組分3 硫柳汞 0. 1%。
[0017] 方法同實(shí)施例1。
[0018] 操作時(shí)為保證酶結(jié)合物稀釋液為同一條件下進(jìn)行對(duì)比，用同一批丙型肝炎病毒核 心抗原檢測(cè)試劑（ELISA)。同時(shí)配制以上四種不同酶稀液的抗HCV酶結(jié)合物，組成四組試劑 盒，對(duì)這四組試劑盒作平行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。
[0019] 實(shí)驗(yàn)時(shí)嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，每一組合加陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各3孔，加 1Ncu/ml，2Ncu/mlHCV血清各10孔，1份陽(yáng)性質(zhì)控血清（以P表示）加10孔，40份HCV 陰性血清各加1孔，共加樣76份。計(jì)算出陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、1Ncu/ml，2Ncu/ml、陽(yáng)性質(zhì) 控血清P的平均S/C0值和40份抗HCV陰性血清的平均S/C0值。
[0020] 酶標(biāo)抗體活性驗(yàn)證： 表1四種試劑盒放置4°c檢測(cè)質(zhì)控血清的S/C0平均值及實(shí)驗(yàn)結(jié)果
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種穩(wěn)定的丙型肝炎病毒核心抗原酶結(jié)合物稀釋液，其特征在于包括組分1、組分2 和組分3,各組分原料含量如下： 組分I (TBST緩沖液） Tris-HCl(50mM) 6. 05g NaCl 8.Og Tween-20 0. 05% 0. 5mL 加蒸餾水至l〇〇〇mL，4° C存放備用； 組分2 牛血清白蛋白（BSA) BSA+Casein 0.1 g 加洗滌緩沖液至100mL，4° C存放備用； 組分3 硫柳汞 0. 1%。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種穩(wěn)定的丙型肝炎病毒核心抗原酶結(jié)合物稀釋液，其特征 在于包括組分1中緩沖液為PH7. 4TBST緩沖液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種穩(wěn)定的丙型肝炎病毒核心抗原酶結(jié)合物稀釋液，其特征 在于包括組分2中穩(wěn)定劑牛血清白蛋白（BSA) BSA+Casein。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種穩(wěn)定的丙型肝炎病毒核心抗原酶結(jié)合物稀釋液，其特征 在于包括組分3中防腐劑硫柳汞。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明一種穩(wěn)定的丙型肝炎病毒核心抗原酶結(jié)合物稀釋液涉及臨床體外檢測(cè)試劑技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種穩(wěn)定的丙肝核心抗原酶結(jié)合物稀釋液，包括組分1、組分2和組分3，組分1中含有PBST緩沖液，組分2中含ＢＳＡ和Casein；組分3中含１％硫柳汞。本發(fā)明提供一種穩(wěn)定高效的酶結(jié)合物稀釋液配方，保證試劑能在2～8℃條件下穩(wěn)定放置1年并且降低了成本。
【IPC分類(lèi)】G01N33-576
【公開(kāi)號(hào)】CN104849460
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510287239
【發(fā)明人】魏海明, 侯亞蘭, 甘宜梧, 王春艷, 李靜
【申請(qǐng)人】山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司
【公開(kāi)日】2015年8月19日
【申請(qǐng)日】2015年5月29日