一種基于梅毒血清學(xué)檢測蛋白芯片制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種用于檢測梅毒的蛋白質(zhì)芯片及其制 備與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 梅毒由蒼白（梅毒）螺旋體引起的慢性、系統(tǒng)性性傳播疾病。其傳播途徑主要是 性傳播、母嬰傳播，很少通過器官移植傳播。梅毒分為一期梅毒、二期梅毒、潛伏期、三期梅 毒。一期梅毒通常是透過直接和他人的感染病灶做性接觸而感染，在初次接觸約3到90天 后（平均21天），在接觸點會出現(xiàn)稱為硬下疳的皮膚病灶。硬下疳是一個堅硬、不痛、不癢、 底部明確、邊緣清楚的皮膚潰瘍。二期梅毒約在第一期感染四到十星期后發(fā)生，在軀干及四 肢包括手掌及腳掌等部位可能會出現(xiàn)紅至粉紅色、不搔癢的對稱性皮瘆。一期及二期梅毒 癥狀可以不經(jīng)治療自動消失。二期梅毒若不經(jīng)治療，感染癥狀可能會進入潛伏的、無癥狀的 階段幾個月、幾年或數(shù)十年。這個階段包括早期潛伏期（2年之內(nèi)出現(xiàn)感染）和晚期潛伏期 (感染時間持續(xù)2年）。一期和二期梅毒具有較強的傳染性。少數(shù)潛伏期梅毒患者進入三 期梅毒，其癥狀包括神經(jīng)梅毒、心血管疾病和損傷皮膚、骨骼和內(nèi)臟（稱為梅毒瘤）。
[0003] WHO估計每年的發(fā)病率為每年1200萬例，超過90%的病例在發(fā)展中國家，東歐的 發(fā)病率也在顯著增加。先天性梅毒導(dǎo)致自然流產(chǎn)、死胎、新生兒死亡及疾病。對于全球健康 問題特別重要的一點是意識到梅毒可增加2. 3-8. 6%患HIV的風(fēng)險率。梅毒晚期疾病高度 破壞的性質(zhì)，使梅毒成為全球重要的健康問題。
[0004] 梅毒的實驗室檢測方法包括：（1)直接檢測暗視野顯微鏡法（DFM)和直接熒光法 (DFA)檢查梅毒螺旋體；(2)梅毒血清學(xué)檢測方法：非螺旋體抗原和梅毒螺旋體特異性抗原 檢測方法。由于梅毒螺旋體不能子在體外培養(yǎng)和取血方便，因此血清學(xué)檢測方法是檢測梅 毒最主要的方法。非螺旋體抗原檢測方法包括：微量沉淀反應(yīng)（MPR)、玻片沉淀試驗（MSP)、 快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗（RPR)、性病研宄實驗室試驗（VDRL)、甲苯胺紅不加熱血清 試驗（TRUST)。梅毒螺旋體特異性抗原檢測方法包括：酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA)、梅毒 螺旋體顆粒凝集試驗（TPPA)、梅毒螺旋體血凝試驗（TPHA)、血清熒光抗體吸收試驗（FTA ABS)、免疫印跡法、酶免疫測定（EIA)、微量血凝法檢測梅毒螺旋體（MHA-TP)和化學(xué)發(fā)光法 (CLIA)。兩種血清學(xué)檢測方法都不能單獨作出正確的診斷，非螺旋體抗原檢測方法可作為 治療監(jiān)測，但其敏感性和特異性較低，需要梅毒螺旋體特異性抗原檢測方法驗證。另一方面 由于梅毒螺旋體特異性抗原檢測方法監(jiān)測陽性可能會持續(xù)一生，所以不能辨別梅毒感染是 近期或以前感染和治療或未治療，又需要非螺旋體抗原檢測方法確診。因此，使用梅毒螺 旋體特異性抗原測試篩選和非螺旋體抗原血清學(xué)測試確認測試是一個長期實踐的逆轉(zhuǎn)。
[0005] 因此，需要繼續(xù)尋找一種簡單、快速、可靠、經(jīng)濟的診斷梅毒的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的第一目的在于提供一種用于檢測梅毒的 蛋白質(zhì)芯片，所述蛋白質(zhì)芯片可以分別檢測出梅毒患者血清中的IgG和IgM抗體，操作簡 單，檢測結(jié)果穩(wěn)定，效率更高，僅需2. 5小時即可及時準確地確認被檢測者是否患有梅毒。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述用于檢測梅毒的蛋白質(zhì)芯片的制備及其應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0009] 將梅毒螺旋體重組抗原rTpN15-17_47固定于固相載體表面，形成蛋白質(zhì)芯片，用 于梅毒的檢測。
[0010] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于檢測梅毒的蛋白質(zhì)芯片，所述蛋白質(zhì)芯片的 固相載體表面點陣固定有梅毒螺旋體重組抗原rTpN15-17-47。
[0011] 優(yōu)選地，所述固相載體采用金箔芯片。
[0012] 本發(fā)明的優(yōu)選實施例中所采用的金箔芯片的基底為玻璃片，其上覆蓋一層l〇nm 厚度的純金（純度99.9% )，金箔之上為一區(qū)域化的50ym的TEFLON膜的陣列（96孔*2， 8行*12列），陣列孔徑為1. 25mm。
[0013] 更優(yōu)選地，所述固相載體采用表面進行了DSU修飾的金箔芯片。所述DSU亦即二 硫雙（琥珀酰亞氨基十一酸酯）。
[0014] 優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)芯片的固相載體表面還點陣固定有陰性對照。
[0015] 所述陰性對照是PBST溶液或陰性血清。
[0016] 所述PBST溶液是由濃度0? 01M，PH7. 2-7. 4的磷酸緩沖液PBS與Tween20混合 配置而成的，PBS與Tween20的體積比為100:1。
[0017] 所述陰性血清為臨床確診未感染梅毒螺旋體的健康人的血清。
[0018] 優(yōu)選地，所述的蛋白質(zhì)芯片的固相載體表面還點陣固定有陽性對照。
[0019] 所述的陽性對照選用人免疫球蛋白IgG、IgM或陽性血清。
[0020] 所述的陽性血清是臨床確診為感染梅毒螺旋體的梅毒患者的血清。
[0021] 本發(fā)明的第二方面，提供了上述用于檢測梅毒的蛋白質(zhì)芯片的制備方法，包括如 下步驟：
[0022] 將梅毒螺旋體重組抗原rTpN15-17-47進行稀釋，獲得rTpN15-17-47溶液；采用常 規(guī)方法將rTpN15-17-47溶液點陣于固相載體表面，并固定。
[0023] 優(yōu)選地，所述rTpN15-17-47溶液的終濃度為0? 19~200yg/mL。
[0024] 優(yōu)選地，所述固相載體優(yōu)選DSU修飾的金箔芯片。更優(yōu)選地，所述rTpN15-17_47 溶液的終濃度為50yg/mL。
[0025] 優(yōu)選地，采用PBST溶液對rTpN15-17-47進行稀釋。
[0026] 所述PBST溶液是由濃度0. 01M，PH7. 2-7. 4的磷酸緩沖液PBS與Tween20混合 配置而成的，PBS與Tween20的體積比為100:1。
[0027] 優(yōu)選地，所述固定的條件優(yōu)選室溫條件下將點樣好的芯片置于黑暗條件下固定 1~16小時。
[0028] 優(yōu)選地，還可將陰性對照和陽性對照點樣于固相載體表面。
[0029] 所述陰性對照為PBST溶液或陰性血清。
[0030] 所述的陰性血清為臨床確診未感染梅毒螺旋體的健康人的血清。
[0031] 優(yōu)選地，還將陽性對照點樣于固相載體表面。
[0032] 所述陽性對照是指臨床確診為感染梅毒螺旋體的梅毒患者的血清。
[0033] 本發(fā)明的第三方面還公開了前述蛋白質(zhì)芯片在制備梅毒檢測試劑中的用途。
[0034] 本發(fā)明的第四方面提供了一種梅毒檢測試劑盒，所述試劑盒包括前述蛋白質(zhì)芯 片。
[0035] 優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)芯片的固相載體表面點陣固定有梅毒螺旋體重組抗原 rTpN15-17-47〇
[0036] 優(yōu)選地，所述固相載體為金箔芯片。更優(yōu)選地，所述固相載體為DSU修飾的金箔芯 片。
[0037] 特殊抗原和金箔芯片的選用是本發(fā)明試劑盒的關(guān)鍵。基于本發(fā)明的所述試劑盒采 用的是熒光方法來進行定量檢測，所以試劑盒中還可以包括其他一些試劑。例如：標準品， 稀釋液，清洗液中的一種或多種。具體需要將哪些試劑裝配入試劑盒，可以根據(jù)實際需要配 置。
[0038] 所述標準品包括抗梅毒螺旋體重組抗原rTpN15-17_47的IgG或IgM抗體。
[0039] 優(yōu)選地，所述的試劑盒還包括陰性對照。
[0040] 所述陰性對照是PBST溶液或陰性血清。
[0041] 所述的陰性血清為臨床確診未感染梅毒螺旋體的健康人的血清。
[0042] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括陽性對照。
[0043] 所述陽性對照是指臨床確診為感染梅毒螺旋體的梅毒患者的血清。
[0044] 優(yōu)選地，所述的試劑盒還包括熒光素標記的IgG二抗、熒光素標記的IgM二抗。
[0045] 優(yōu)選地，所述熒光素標記為Cy3標記或Cy5標記。
[0046] 本發(fā)明的第五方面還提供了所述試劑盒的使用方法，包括如下步驟：
[0047] 將血清樣本點于蛋白質(zhì)芯片上，孵育，清洗，再點加將熒光素標記的IgG二抗和熒 光素標記的IgM二抗。
[0048] 優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)芯片上，梅毒螺旋體重組抗原rTpN15-17_47的終濃度為 50yg/mL〇
[0049] 優(yōu)選地，所述孵育具體為室溫條件下孵育1~16個小時。
[0050] 清洗用于將未完全反應(yīng)的血清從芯片上除去，可選用本領(lǐng)域常規(guī)的用于抗原抗體 反應(yīng)的洗液。優(yōu)選地，可選用PBST作為洗液。
[0051] 優(yōu)選地，清洗時，PBST清洗3次，每次2分鐘，氮氣吹干。
[0052] 優(yōu)選地，所述熒光素標記的IgG二抗和所述熒光素標記的IgM二抗的濃度為 2. 5yg/mL〇
[0053] 優(yōu)選地，所述熒光素標記的IgG二抗為Cy3標記的IgG抗體。更優(yōu)選為Cy3標記 驢抗人IgG抗體。
[0054] 優(yōu)選地，所述熒光素標記的IgM二抗為Cy5標記的IgM抗體。更優(yōu)選為Cy5標記 羊抗人IgM抗體。
[0055]本發(fā)明所具有的有益效果為：
[0056] (1)蛋白質(zhì)芯片可以分別檢測出梅毒患者血清中的IgG和IgM抗體，靈敏度高：可 視檢測限低至0. 19yg/mL;陽性率高達99. 0 %，均高于傳統(tǒng)的TRUST和TPPA檢測法。
[0057] (2)本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片檢測重復(fù)性好，特異性尚，能夠滿足醫(yī)院臨床實驗室快速 篩檢的需要。有助于判斷患者是否處于急性感