檢測動物源食品中殘留藥物的方法及液質數據庫的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測領域，具體而言，涉及一種用于檢測動物源食品中殘留藥物 的液質數據庫及其使用方法。
【背景技術】
[0002] 動物源食品在國際農產品貿易中占相當比重，針對動物源食品中藥物殘留的法規(guī) 限制越來越嚴格，以日本06年5月實施的"肯定列表"制度為例，其對236種獸藥和飼料添 加劑制定了具體限量標準，而在國內食品安全領域，從早期的"氯霉素、硝基呋喃"到后來的 "孔雀石綠、瘦肉精"，因藥物殘留導致的食品安全事件頻發(fā)凸顯我國食品安全監(jiān)管控制體 系技術支撐能力不足，迫切需要建立多種類殘留快速篩選方法。目前，針對動物源食品中藥 物殘留檢測技術和方法已由單殘留分析發(fā)展到了單種類多殘留分析，03年以來，以物質種 類界分的多殘留檢測標準占據了殘留分析國家和行業(yè)標準的70%以上。同時期，質譜分析 已經成為多殘留檢測的主要技術手段，以歐盟2002/657/EC法規(guī)為藍本的技術指標規(guī)則也 為國際上所承認和接受。隨著殘留分析技術的發(fā)展，多種類殘留分析在信息量、檢測效率等 多方面具有優(yōu)勢使其成為研發(fā)熱點，且質譜設備領域如Q-TOF，Q-Trap等串聯質譜儀的實 用化，以高級質譜技術為基礎的譜庫比對分析逐漸成熟也為多種類殘留快速分析提供了技 術可能。然而，無論是在方法開發(fā)、驗證和標準化還是在法規(guī)完善等方面，同時檢測多種類 殘留都存在較多困難：
[0003] (1)不同種類獸藥物化性質差別很大，極性覆蓋范圍寬，在不同基質中殘留形態(tài)不 一，個別獸藥尚需衍生化方能有效檢測，因此在通用前處理方法和色譜一次進樣分析上難 以實現有效突破；
[0004] (2)法規(guī)對不同獸藥（禁用藥物和限用藥物）的限量要求和使用規(guī)定不一，多種類 殘留檢測驗證規(guī)則尚未完善；
[0005] (3)方法開發(fā)需要的空白基質難以獲得，混合標準溶液制備困難；
[0006] (4)儀器的分析能力。在構建液質譜庫方面，盡管有商業(yè)化譜庫如AB公司法醫(yī)毒 物數據庫（1250種目標分析物）、獸藥數據庫（139種目標分析物）；Freiburg大學醫(yī)院的 小分子藥物數據庫等，但存在如下應用局限：
[0007] 1)僅有MS/MS數據，無色譜體系信息特征；
[0008] 2)無在線信息特征；
[0009] 3)無統一前處理方法和儀器分析相偶聯；
[0010] 4)缺乏基質標準數據。
[0011] 因此，在現有條件下，很難有效實現基于液質譜庫技術的多種類殘留快速篩查分 析。

【發(fā)明內容】

[0012] 鑒于目前國內外在動物源食品多種類殘留藥物分析中存在的樣品通用性前處理、 儀器快速分析和篩選方法驗證等技術難點。本發(fā)明以建立動物源食品中高風險藥物多種 類殘留快速篩選檢測體系為目的，通過采用多溶劑體系分段組合提取、建立樣品高通量通 用性前處理技術、綜合優(yōu)化色譜體系實現多目標分析物寬極性范圍液相色譜有效保留與分 離、并通過構建涵蓋色譜-質譜多維信息的液相色譜-質譜/質譜數據庫及依據法規(guī)要求 和檢測實踐進行篩選方法驗證等關鍵技術內容的研發(fā)，突破多種類殘留分析技術難關，建 立一個以多種類殘留通用性前處理技術、快速分離體系和液質譜庫為技術特征的開放性快 速分析平臺和有效篩查檢測技術體系。
[0013] 本發(fā)明針對12種限量值在1.0yg/kg以下高風險殘留藥物（A類殘留物質）作為 檢測目標，該組藥物分別為，
[0014] (1)留體激素類化合物：睪酮（T)、潑尼松龍（PNSL)、倍他米松（BTS)、地塞米松 (DTS)；
[0015](2)硝基咪唑類藥物及其代謝產物：甲硝噠唑（MNZ)、咯硝噠唑（RNZ)、二甲硝咪唑 (DMZ)；
[0016] (3)Beta_受體激動劑類物質：克倫特羅（CLB)、妥布特羅（TUL)、西馬特羅（CIM);
[0017] (4)染料類物質：結晶紫（CV)和隱色結晶紫（LCV);
[0018] 本發(fā)明首先涉及一種檢測動物源食品中高風險藥物多種類殘留的快速篩選液質 譜庫的構建方法，所述的動物源食品為禽蛋類食品或蜂蜜類食品，具體包括如下步驟，
[0019] (1)標準工作溶液的制備；
[0020] 留體激素類化合物、硝基咪唑類藥物及其代謝產物、Beta-受體激動劑類物質：采 用乙腈分類配制其混合標準儲備溶液（〇.〇lg/L);
[0021] 染料類等物質采用甲醇分類配制其混合標準儲備溶液（0. 〇lg/L);
[0022] 混合和標準工作溶液（0.lmg/L)，分別移取睪酮、潑尼松龍、倍他米松、地塞米松、 甲硝挫、咯硝噠挫、二甲硝咪挫、克倫特羅、妥布特羅、西馬特羅、結晶紫和隱色結晶紫標準 儲備溶液適量，用乙腈配制濃度為〇.lmg/L的混合標準溶液；
[0023] (2)分析前處理，采用快速酶解（釋放結合態(tài)殘留）+快速固相萃?。⊿PE)的提取 凈化技術進行待測樣本分析前處理工作，具體的提取凈化過程如下：
[0024] 1)提?。悍Q取均質樣品5g，置于50mL聚四氟乙烯離心管中，加入乙酸銨緩沖液 (0. 2mol/L，pH5. 2)15mL，0-葡糖苷酸/硫酸酯酶50yL，渦旋混勾，50°C水浴振蕩2h，放 冷至室溫，于〇°C，15000rpm離心5min，轉移上清至另一干凈離心管中，用NaOH溶液（5mol/ L)調節(jié)pH至9. 0,再加入乙酸乙醋20mL,氯化鈉6g，振蕩禍旋5min，于0°C，15000rpm離心 5min，取上層有機相35°C旋蒸至近干，氮氣吹干，殘渣使用5mL0.lmol/L鹽酸溶液溶解，超 聲lmin，留待上柱凈化；
[0025] 2)凈化：MCX柱（WatersOasisMCXSPE小柱）安裝于固相萃取裝置上（該裝置在 實用新型專利CN201020014620.X中有詳細記載），依次使用甲醇3mL，水3mL，3mL0.lmol/ L鹽酸溶液活化。將提取溶液加載在固相萃取柱上，在重力作用下流出，依次使用3mL水， 3mL甲醇和5mL正己燒淋洗小柱，抽干2min，加入6mL洗脫液（乙酸乙醋50mL，甲醇45mL， 氨水5mL，混勻）洗脫。洗脫液35°C下氮氣流吹干，使用樣品溶解液（量取0.1%甲酸乙腈 (V/V)溶液5mL，與甲酸銨（5mmol/L)-甲酸（0. 1 % )-水溶液95mL混勻）0. 5mL溶解殘渣， 超聲lmin，過0. 22yM微孔濾膜；所述的固相萃取裝置整合試劑架、氮吹儀的功能且操作壓 力相對均勻，其由試劑架、操作臺、8個玻璃倉、8個梨形瓶和1個自動吸氣裝置組成，可實現 目標分析物的快速SPE過程。
[0026] (3) -次性進樣色譜分析
[0027] 使用色譜柱為KinetexC18柱，采用乙腈為有機相，甲酸作為離子化增強劑，甲酸 鹽作為峰形優(yōu)化劑，以水相/酸性乙腈的組合作為優(yōu)化的流動相體系；
[0028] 具體條件為：色譜柱：KinetexC18, 2. 6ym，2.ImmX100mmi.d.;
[0029] 流速：0? 2mL/min；
[0030] 進樣量：10yL;
[0031] 柱溫：3(TC;
[0032] 梯度洗脫程序：(A:0. 1 %甲酸-乙腈溶液；B:甲酸銨（5mmol/L)-甲酸 (0? 1% )-水溶液）
[0033] 0 ~2min:5%A;
[0034] ~8min:20%A;
[0035] ~15min:95%A;
[0036] ~16min:100%A;
[0037] ~19min:100%A;
[0038] 20min：5%A；
[0039] (4)構建液質譜庫
[0040] 采用四級桿/離子阱串聯質譜的高級采集模式：預設定多反應檢測（sMRM)-信息 依賴性采集（IDA)-增強子離子掃描（EPI);
[0041] 質譜參數確定過程如下：使用初始流動相按目標分析物類別稀釋混標儲備溶液至 濃度為〇. 2mg/L，然后使用恒流注射泵以5yL/min的流速注入質譜離子源中進行參數優(yōu) 化，
[0042] 分別使用QlMS、QlMultipleIons、ProductIon、MRM等掃描模式確定目標分析物 的母離子，子離子，并使用Ramp功能優(yōu)化并確定解聚電壓（DP)、碰撞室入口電壓（EP)、碰撞 能量（CE)、碰撞室出口電壓（CXP)等化合物參數；
[0043] 質譜條件（API4000 和API4000Q-TRAP):
[0044] a)離子源：電噴霧離子源；
[0045] b)掃描方式：正離子掃描；
[0046] c)檢測方式：sMRM-IDA-EPI
[0047] d)電噴霧電壓：5500V ;
[0048] e)霧化氣壓力：40psi ;
[0049] f)氣簾氣壓力：30psi ;
[0050] g)輔助氣壓力：45psi ;
[0051] h)離子源溫度：475°C ;
[0052] i)sMRM參數設置：MRM檢測窗口設為60s，目標物掃描時間設為1. 4s;
[0053] j)IDA規(guī)則：響應閾值：3000cps;動態(tài)背景扣除；最強離子選擇為1到3 ;
[0054]k)增強子離子掃描（EPI)參數設置：掃描質量數范圍為70~lOOODa;掃描速度為 10000Da/S ;掃描累加次數為1 ;碰撞能量為35eV;擴展碰撞能量為15eV;