一種開(kāi)發(fā)fus蛋白病藥物新靶點(diǎn)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種用于開(kāi)發(fā)FUS蛋白病(FUSprοte inopathi es )診斷手段及治療藥物的新革巴點(diǎn)。
【背景技術(shù)】
[0002]FUS蛋白病(FUS proteinopathies),是一組致命性的、累及多種神經(jīng)元包括運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的神經(jīng)退行性疾病。銅/鋅超氧化物歧化酶I (Cu/Zn SODl)基因在家族性ALS患者中發(fā)生突變，是第一個(gè)被鑒定出的ALS相關(guān)基因。接下來(lái)又發(fā)現(xiàn)了 10多個(gè)與ALS有關(guān)聯(lián)的基因，其中包括RNA/DNA結(jié)合蛋白TDP-43和FUS。FUS即肉瘤融合蛋白(fused insarcoma)ο許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病檢測(cè)到具有FUS免疫陽(yáng)性的包涵體，因此從病理角度講，這些疾病可以歸類為FUS蛋白病。這些疾病在遺傳上和臨床上都是異質(zhì)性的。根據(jù)累及的區(qū)域不同，F(xiàn)US蛋白病可以表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病(如ALS-FUS)、額顳葉變性病(FTLD-FUS)、非典型FTLD-泛素病理(aFTLD-U)、神經(jīng)元中間絲包涵體病(NIFID)和嗜堿性包涵體病。有意思的是，盡管在ALS-FUS患者中發(fā)現(xiàn)了 30多個(gè)FUS基因突變，但是在絕大多數(shù)散發(fā)性或家族性FTLD-FUS病例中還沒(méi)有檢測(cè)到任何FUS本身的基因突變。最近，在ALS-FUS患者的FUS基因3’非翻譯區(qū)鑒定出幾個(gè)與FUS表達(dá)增加有關(guān)的突變，提示FUS表達(dá)的增加可能是FUS蛋白病的一種發(fā)病機(jī)制。
[0003]有幾個(gè)模型被用來(lái)模擬FUS蛋白病，這些模型包括從單細(xì)胞的酵母到多細(xì)胞的果蠅及脊椎動(dòng)物。包括Lanson及其同事和我們團(tuán)隊(duì)在內(nèi)的幾個(gè)研究組建立了表達(dá)人源FUS蛋白野生型和ALS突變型的轉(zhuǎn)基因果蠅。在我們的果蠅模型中，野生型或ALS突變型的FUS蛋白在特定亞群神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致年齡依賴的神經(jīng)退化和功能缺失，表現(xiàn)出FUS蛋白病的典型特征。在大鼠轉(zhuǎn)基因模型中，野生型FUS的過(guò)表達(dá)即可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的逐漸衰退。雖然FTLD-FUS患者FUS基因沒(méi)有發(fā)生突變，但是卻檢測(cè)到FUS蛋白水平的上升，所以野生型FUS表達(dá)的上升有助于我們理解FTLD-FUS ;而FUS的突變?nèi)鏟525L則與ALS-FUS密切相關(guān)。
[0004]為了弄清哺乳動(dòng)物FUS蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)中的生物功能，我們研究了與FUS相互作用的蛋白。使用FUS特異性單克隆抗體，我們發(fā)展了一種免疫純化與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合使用的方法，在腦組織中鑒定出包括HSP60在內(nèi)的幾個(gè)線粒體蛋白是與FUS相互作用的候選蛋白。單純用質(zhì)譜方法也在純化的線粒體中檢測(cè)到了 FUS蛋白，進(jìn)一步支持FUS與線粒體可能存在相互作用的推測(cè)。這些結(jié)果促使我們利用FUS蛋白病模型詳細(xì)檢查線粒體的變化。
[0005]HSP60蛋白屬于進(jìn)化上保守并依賴于ATP的分子伴侶家族，在應(yīng)激反應(yīng)、蛋白質(zhì)折疊和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。HSP60存在于細(xì)胞質(zhì)和線粒體基質(zhì)中，既組成型表達(dá)，也受脅迫信號(hào)誘導(dǎo)表達(dá)。據(jù)報(bào)道，HSP60與HSP10、HSP70等其他熱激蛋白一起，促進(jìn)蛋白質(zhì)復(fù)合體的正確折疊和裝配并運(yùn)輸至線粒體中。Typel3痙攣性截癱(SPG13)是一種晚發(fā)型常染色體顯性遺傳的神經(jīng)退行性疾病，其特征是進(jìn)行性衰弱和下肢痙攣，研究發(fā)現(xiàn)這種疾病患者的HSP60基因，即HSHH，存在基因突變。
[0006]ALS中的線粒體損傷已有廣泛研究，特別是在SODl動(dòng)物模型中。過(guò)表達(dá)TDP-43的轉(zhuǎn)基因小鼠，在其運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中觀察到線粒體發(fā)生聚集。兩例ALS-FUS患者的脊髓樣本(其中一例攜帶P525L突變)切片的電子顯微鏡研究顯示，細(xì)胞內(nèi)的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變得雜亂不規(guī)則。另外兩個(gè)與ALS有關(guān)的FUS突變體(R521G或R521H)在胞質(zhì)中異常定位，研究發(fā)現(xiàn)與體外培養(yǎng)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的線粒體發(fā)生縮短有關(guān)。這些研究說(shuō)明線粒體損傷可能是ALS-FUS的共同特征。但是，有關(guān)FUS的線粒體定位和FTLD-FUS患者神經(jīng)細(xì)胞線粒體損傷仍然沒(méi)有報(bào)道。盡管FUS的表達(dá)直接造成線粒體損傷有待進(jìn)一步確定，但是我們的研究數(shù)據(jù)顯示，線粒體的片段化不僅在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞中發(fā)生，在FUS轉(zhuǎn)基因果蠅的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中也存在。野生型FUS(Wt-FUS)和ALS突變型FUS(P525L-FUS)都與HSP60相互作用。我們?cè)贔TLD-FUS患者的腦組織樣本中檢測(cè)到線粒體損傷，且FUS的蛋白水平上升。出乎意料的是，在其中兩個(gè)樣本中檢測(cè)到HSP60表達(dá)上升。使用RNAi技術(shù)沉默培養(yǎng)細(xì)胞中的HSP60，則導(dǎo)致線粒體中FUS的水平下降。有意思的是，RNAi調(diào)節(jié)的HSP60同源物的下調(diào)，在一定程度上緩解FUS轉(zhuǎn)基因果蠅的神經(jīng)退行性表型。因此，F(xiàn)US表達(dá)的增加和線粒體的損傷可能是FTLD-FUS的顯著病理特征。我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還揭示了一種以前未被發(fā)現(xiàn)的FUS調(diào)節(jié)方式，即分子伴侶蛋白HSP60調(diào)節(jié)FUS的亞細(xì)胞定位。我們的研究結(jié)果說(shuō)明，通過(guò)調(diào)節(jié)FUS的線粒體定位是治療FUS蛋白病、防止FUS誘發(fā)線粒體損傷的一條途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種用于開(kāi)發(fā)FUS蛋白病(FUSprοte inopathi es)診斷手段及治療藥物的新革巴點(diǎn)。
[0008]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是:提供一種用于開(kāi)發(fā)FUS蛋白病(FUS proteinopathies)診斷手段及治療藥物的新靶點(diǎn)，包括FUS蛋白、HSP60蛋白及FUS蛋白和HSP60蛋白之間的相互作用。
[0009]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述FUS蛋白野生型和突變型的序列分別為SeqN0.1及2，所述HSP60蛋白的序列為Seq N0.3。
[0010]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，在FUS蛋白病(FUS proteinopathies)中表現(xiàn)為FUS免疫信號(hào)增加，F(xiàn)US表達(dá)量上升，線粒體出現(xiàn)損傷或損傷加重；在體內(nèi)過(guò)表達(dá)Wt-或P525L-突變型FUS蛋白，導(dǎo)致線粒體缺陷。
[0011]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述FUS蛋白和所述HSP60蛋白之間的相互作用是在胞質(zhì)中和線粒體上發(fā)生的；所述FUS蛋白和所述HSP60蛋白之間的相互作用為直接相互作用；所述HSP60蛋白對(duì)所述FUS蛋白在線粒體上的定位有調(diào)節(jié)作用。
[0012]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述HSP60蛋白與所述FUS蛋白之間的相互作用使得FUS富集和定位到線粒體上，引發(fā)線粒體膜電位降低和活性氧升高，神經(jīng)細(xì)胞的線粒體出現(xiàn)碎片化并引發(fā)神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生。
[0013]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，以所述新靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)的診斷手段及治療藥物能用于診斷、預(yù)防和治療FUS蛋白病(FUS proteinopathies)。
[0014]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述藥物為小分子化合物、FUS蛋白抗體、HSP60蛋白抗體、融合蛋白或基因藥物。
[0015]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述藥物能與FUS蛋白或HSP60蛋白結(jié)合、降低或阻斷FUS蛋白與HSP60蛋白之間的相互作用，或者降低FUS基因和HSP60基因的表達(dá)。
[0016]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述藥物包括siHSP60，所述siHSP60是以HSP60蛋白為對(duì)象，合成抑制HSP60基因表達(dá)的小RNA片段RNA1:siHSP60。
[0017]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述siHSP60的序列為Seq N0.4。
[0018]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在多種FUS蛋白病(FUS proteinopathies)患者腦組織中FUS蛋白高表達(dá)，HSP60蛋白可以和FUS蛋白相互作用，從而可以調(diào)節(jié)FUS的線粒體定位，引發(fā)線粒體碎片化或損傷，進(jìn)而發(fā)生神經(jīng)退行性疾病，如非肌萎縮側(cè)索硬化癥(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS-FUS)及 FTLD-FUS 等 FUS 蛋白病(FUSproteinopathies)ο
[0019]本發(fā)明提供的數(shù)據(jù)顯示，在FUS蛋白病(FUS proteinopathies)患者中FUS表達(dá)量上升和線粒體出現(xiàn)損傷；并且FUS基因突變易導(dǎo)致FUS蛋白表達(dá)量升高，該蛋白與HSP60蛋白相互作用后定位于線粒體，導(dǎo)致線粒體損傷，進(jìn)而導(dǎo)致FUS蛋白病(FUSproteinopathies)的發(fā)生。以該FUS蛋白或HSP60蛋白為靶點(diǎn)可以開(kāi)發(fā)FUS蛋白病(FUSproteinopathies)的診斷手段及治療藥物。
【附圖說(shuō)明】
[0020]為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖，其中:
圖1是本發(fā)明中在三例FUS蛋白病(FUS proteinopathies)患者樣本組織中發(fā)現(xiàn)FUS蛋白表達(dá)升尚和線粒體損傷；
圖2是本發(fā)明中HSP60蛋白可以與FUS蛋白相互作用，調(diào)節(jié)FUS蛋白在線粒體上的定位；
圖3是本發(fā)明中提高野生型或突變型(P525UFUS基因在細(xì)胞中的表達(dá)，導(dǎo)致線粒體膜電位降低和線粒體活性氧增加；
圖4是本發(fā)明中在小鼠原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞中和果蠅運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)野生型或突變型(P525L) FUS基因，導(dǎo)致細(xì)胞線粒體碎片化(mitochondrial fragmentat1n)等線粒體損傷表型；
圖5是本發(fā)明中在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)野生型或突變型(P525UFUS基因，觀察到FUS蛋白在線粒體上的定位并且導(dǎo)致細(xì)胞線粒體損傷；
圖6是本發(fā)明中F