濃度為0.005Μ?0.1M的磷酸鹽(PBS)緩沖液、
[0045]ρΗ7.0?9.0，濃度為0.005Μ?IM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖液；
[0046]步驟⑵中采用的保存緩沖液選自以下緩沖液中的任一種:
[0047]ρΗ5.0?8.0，濃度為0.005Μ?0.1M的磷酸鹽(PBS)緩沖液、
[0048]ρΗ7.0?9.0，濃度為0.005Μ?IM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖液；
[0049]步驟(3)中采用的洗脫緩沖液選自以下緩沖液含0.10-0.15M NaCl:
[0050]ρΗ5.0?7.0，濃度為0.05Μ?0.15Μ的磷酸鹽(PBS)緩沖液；
[0051]步驟(3.2)中采用的標(biāo)記緩沖液選自以下緩沖液含0.10-0.15Μ NaCl:
[0052]ρΗ7.0?10.0，濃度為0.05Μ?0.15Μ的磷酸鹽(PBS)緩沖液；
[0053]步驟(5)所述清洗緩沖液選自以下緩沖液中的任一種或者還含0.05-0.2%吐溫的該種緩沖液:
[0054]ρΗ5.0?8.0，濃度為0.005Μ?0.1M的磷酸鹽(PBS)緩沖液、
[0055]ρΗ7.0?9.0，濃度為0.005Μ?IM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖液。
[0056]所述步驟(1.3)中采用含0.05%吐溫的清洗緩沖液則效果最佳。
[0057]所述步驟⑵中采用含0.1%吐溫的清洗緩沖液則效果最佳。
[0058]所述步驟(4)中采用含0.05%吐溫的清洗緩沖液則效果最佳。
[0059]步驟(I)中采用的ΗΕ4單克隆抗體為Meridian、Hytest、或Abcam公司產(chǎn)品。
[0060]步驟(3.2)中，吖啶酯溶液濃度為0.05-lmM，HE4標(biāo)記抗體的投入量為50-500 μ g。反應(yīng)的條件具體為:取吖啶酯溶液和HE4標(biāo)記抗體溶液，用標(biāo)記緩沖液混合，置于搖床中，在20-25°C條件下，以150?250rpm的轉(zhuǎn)速反應(yīng)10?30分鐘；加入賴氨酸鹽溶液，再次置于搖床中，在20-25°C條件下，以150?250rpm的轉(zhuǎn)速反應(yīng)20?50分鐘；采用的標(biāo)記抗體是吖啶酯或吖啶磺酰胺類化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的鼠單克隆HE4抗體。
[0061]步驟(4)反應(yīng)的條件為:將待檢樣品和吖啶酯標(biāo)記的HE4抗體加入金磁微粒中，置于搖床，在25-40°C條件下，以150?250rpm的轉(zhuǎn)速反應(yīng)30?90分鐘。
[0062]上述標(biāo)記用吖啶酯類化學(xué)發(fā)光物質(zhì)是4-(2-琥珀酰亞氨基羧基)苯基-10-甲基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸鹽、B丫啶酯-NSP-DMAE-NHS，或采用吖啶磺酰胺NSP-SA-NHS。
[0063]步驟￠)中采用的化學(xué)發(fā)光底物是含有雙氧水和氫氧化鈉的溶液，或者在所述含有雙氧水和氫氧化鈉的溶液中還含有曲拉通-100和硝酸。具體操作過(guò)程中采用的化學(xué)發(fā)光底物可以分為使用前獨(dú)立存在的發(fā)光激發(fā)液A和發(fā)光激發(fā)液B，其中發(fā)光激發(fā)液A中含有0.1% (體積分?jǐn)?shù))雙氧水、0.05-0.5M硝酸，發(fā)光激發(fā)液B中含有0.25M氫氧化鈉、
0.5% -5% (體積分?jǐn)?shù))的曲拉通-100。
[0064]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0065]本發(fā)明以金磁微粒為載體，結(jié)合化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)系統(tǒng)，建立了基于金磁微粒的化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測(cè)HE4的方法。使用的抗體為單克隆抗體，與抗原之間反應(yīng)特異性好，有效避免交叉反應(yīng)，且由于金磁微粒對(duì)蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)具有的高吸附能力，加之抗體、抗原免疫反應(yīng)的高特異性，同時(shí)還兼具吖啶酯化學(xué)發(fā)光法的高靈敏度和標(biāo)記物穩(wěn)定、無(wú)污染的特點(diǎn)。在制備過(guò)程中不同步驟使用適當(dāng)?shù)木彌_溶液和PH值，使得抗體與固相載體之間有效結(jié)合，并有效進(jìn)行位點(diǎn)封閉，避免的了非特異性反應(yīng)的產(chǎn)生。
[0066]該方法檢測(cè)靈敏度高、特異性好、線性范圍寬、精密度高、穩(wěn)定性好、無(wú)放射性污染，操作安全，方法簡(jiǎn)便快速。尤其在檢測(cè)靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度及精密度方面均比酶參與的免疫檢測(cè)有顯著提高。
【附圖說(shuō)明】
[0067]圖1是本發(fā)明吖啶醋標(biāo)記抗體的原理示意圖；
[0068]圖2是實(shí)施例一中本發(fā)明抗體標(biāo)記洗脫組分的吖啶酯發(fā)光值和抗體濃度檢測(cè)結(jié)果;
[0069]圖3是實(shí)施例一中本發(fā)明定量檢測(cè)HE4的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0070]以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方案以具體實(shí)驗(yàn)操作的形式示例，其中的實(shí)驗(yàn)條件和設(shè)定參數(shù)不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明基本技術(shù)方案的局限；本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠基于本發(fā)明的原理在合理的范圍內(nèi)確定實(shí)驗(yàn)條件和設(shè)定參數(shù)，仍可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的。
[0071]實(shí)施例一:一種基于金磁微粒的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測(cè)人附睪分泌蛋白4(HE4)的方法
[0072](I)包被
[0073](1.1)預(yù)處理:取 10mg/ml 的金磁微粒 100 μ 1，用 ρΗ7.4,0.02Μ Tris-HCl 平衡緩沖液200 μ I清洗2次，平衡磁粒的pH。
[0074](1.2)偶聯(lián):將 50 μ g 的 HE4 包被抗體溶解于 200 μ I ρΗ7.4，0.02Μ Tris-HCl 偶聯(lián)緩沖液中，混勻后加入預(yù)處理過(guò)的金磁微粒中，于37°C，180rpm，搖床中反應(yīng)30min。反應(yīng)完畢后取出，磁性分離，棄上清。
[0075](1.3)清洗:加入300 μ I ρΗ7.4，含0.05%吐溫-20的0.0lM PBS清洗緩沖液，磁性分離，棄上清，清洗3次。
[0076](2)封閉:向上述反應(yīng)后的金磁微粒中加入Iml含5%脫脂奶粉和2%胎牛血清的pH7.4,0.0lM PBS緩沖液中，于37°C，180rpm，搖床中反應(yīng)2h，磁性分離，棄上清。用ImlpH7.4，含0.1 %吐溫-20的0.0lM PBS緩沖液清洗3次，磁粒懸于Iml pH7.4的含I %牛血清白蛋白的0.0lM PBS的保存緩沖液中，4°C備用。
[0077](3)抗體的標(biāo)記:
[0078](3.1)預(yù)處理:將G-25葡聚糖凝膠脫鹽柱用25mL洗脫緩沖液進(jìn)行平衡。
[0079](3.2) 口丫啶酯的標(biāo)記:取250 μ g的HE4抗體，加入0.5mM的吖啶醋(4- (2-琥珀酰亞氨基羧基)苯基-10-甲基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸鹽)溶液50μ1，加入pH8.0的含0.15ΜNaCL的0.1M PBS標(biāo)記緩沖液使總反應(yīng)體積為1000 μ 1，避光于25°C，180rpm，搖床中反應(yīng)20min。反應(yīng)完畢后取出，加入10%的賴氨酸鹽溶液100 μ 1，繼續(xù)避光于25°C，180rpm，搖床中反應(yīng)30min。
[0080](3.3)過(guò)柱純化:將上述反應(yīng)物上樣在已經(jīng)平衡好的G-25脫鹽柱中，用pH 6.3的含0.15M NaCL的0.1M PBS洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫并收集，洗脫速度為120drops/min，用
1.5mL試管收集洗脫液，每管收集500 μ I共收集24管，并對(duì)收集管內(nèi)洗脫組分的發(fā)光值和抗體濃度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2所示，收集第4、5、6管混合作為標(biāo)記有吖啶酯的ΗΕ4抗體，加入I %牛血清白蛋白和50%甘油于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0081](4)與待測(cè)物結(jié)合:取出包被有HE4抗體的金磁微粒，于室溫下平衡15min，取出發(fā)光檢測(cè)試管，依次加入上述金磁微粒30 μ 1、待測(cè)樣本(0ng/ml、0.3ng/ml、0.6ng/ml、
1.25ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、25ng/ml)各 100 μ 1、50 倍稀釋的標(biāo)記有吖啶酯的HE4抗體100 μ 1，置搖床中37°C，180rpm，反應(yīng)40min，形成雙抗體夾心復(fù)合物。
[0082](5)清洗:取出離心管置于磁性分離器上，棄上清，用pH7.4含0.05%吐溫-20的
0.0lM PBS清洗緩沖液清洗3次，磁性分離，棄上清。
[0083](6)化學(xué)發(fā)光檢測(cè):向經(jīng)過(guò)步驟(5)處理后形成的雙抗體夾心復(fù)合物的金磁微粒，加入0.1M HNO3,0.1 % H2O2發(fā)光激發(fā)液A 100 μ 1，立即放入化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)儀內(nèi)，調(diào)整儀器自動(dòng)加入0.25Μ NaOH, 2% Triton-100發(fā)光激發(fā)液BlOO μ 1，檢測(cè)累計(jì)時(shí)間15s，檢測(cè)各孔的發(fā)光強(qiáng)度(RLU)，其發(fā)光強(qiáng)度與待測(cè)樣本濃度關(guān)系如圖3所示，在0.3ng/ml?25ng/ml的范圍內(nèi)線性較好，最低檢出限可達(dá)0.069ng/mlo
[0084]結(jié)論:在抗體的吖啶