效率高達(dá)1.73，即每分子抗體上平均標(biāo)記有1.73個(gè)吖啶酯分子；
[0115]該基于金磁微粒的化學(xué)發(fā)光檢測HE4方法的濃度-發(fā)光值標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示，在0.05ng/ml?25ng/ml的范圍內(nèi)具有良好線性，且通過計(jì)算后最低檢測限可達(dá)0.12ng/ml。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于金磁微粒的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測HE4的方法，包括以下步驟: (1)包被 以金磁微粒作為免疫反應(yīng)和固相分離的載體，將HE4包被抗體偶聯(lián)在金磁微粒的表面；具體過程如下: (1.D預(yù)處理:取金磁微粒，用平衡緩沖液清洗平衡I?3遍； (1.2)偶聯(lián):將HE4包被抗體與偶聯(lián)緩沖液混合，將所得混合液加入經(jīng)過預(yù)處理的金磁微粒中，置于搖床，在25-40°C，150?250rpm條件下充分反應(yīng)，反應(yīng)完后，置于磁性分離器上，磁性分離，棄上清； (1.3)清洗:用清洗緩沖液清洗3-5次，磁性分離，棄上清； (2)封閉 在步驟(I)的產(chǎn)物中加入封閉液，置于搖床中，在25-40°C條件下，以150?250rpm的轉(zhuǎn)速反應(yīng)I?2小時(shí)，封閉金磁微粒表面未與HE4包被抗體結(jié)合的空白位點(diǎn)；然后磁性分離，棄上清，用清洗緩沖液清洗后懸于保存緩沖液中保存?zhèn)溆茫? (3)抗體的標(biāo)記 (3.1)預(yù)處理:用洗脫緩沖液對脫鹽柱進(jìn)行平衡； (3.2)抗體標(biāo)記:取吖啶酯溶液和HE4標(biāo)記抗體溶液，在標(biāo)記緩沖液環(huán)境中進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)，最后加入賴氨酸鹽溶液再次進(jìn)行反應(yīng)； (3.3)純化收集:將步驟(3.2)反應(yīng)得到的抗體溶液上樣脫鹽柱，用洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫收集，通過收集物的發(fā)光值和抗體濃度篩選抗體純化產(chǎn)物，即標(biāo)記有吖啶酯的HE4抗體； (4)與待測物結(jié)合 將待檢樣品和能與HE4抗原發(fā)生特異性結(jié)合的標(biāo)記有吖啶醋的HE4抗體，加入經(jīng)過步驟(2)封閉后的結(jié)合有HE4包被抗體的金磁微粒中進(jìn)行反應(yīng)，待測樣品中所含的HE4抗原被金磁微粒上的HE4包被抗體捕獲，同時(shí)與吖啶醋標(biāo)記HE4抗體結(jié)合，形成“雙抗體夾心復(fù)合物”； (5)清洗 用清洗緩沖液清洗雙抗體夾心復(fù)合物，磁性分離，棄上清； (6)化學(xué)發(fā)光檢測 向經(jīng)過步驟(5)處理后形成的雙抗體夾心復(fù)合物中加入化學(xué)發(fā)光底物液，在化學(xué)發(fā)光底物液加入后立即測定待測各孔的發(fā)光強(qiáng)度；發(fā)光強(qiáng)度與待測樣本的濃度成正比關(guān)系。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于金磁微粒的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測HE4的方法，其特征在于: 步驟(1.D平衡緩沖液選自以下緩沖液中的任一種: ρΗ5.0?8.0，濃度為0.005Μ?0.1M的磷酸鹽(PBS)緩沖液、 ΡΗ7.0?9.0，濃度為0.005Μ?IM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖液、 步驟(1.2)偶聯(lián)緩沖液選自以下緩沖液中的任一種: ρΗ5.0?8.0，濃度為0.005Μ?0.1M的磷酸鹽(PBS)緩沖液、 ΡΗ7.0?9.0，濃度為0.005Μ?IM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖液；步驟(1.3)中采用的清洗緩沖液選自以下緩沖液中的任一種或含0.05-0.2%吐溫的該種緩沖液: ρΗ5.0?8.0，濃度為0.005Μ?0.1M的磷酸鹽(PBS)緩沖液、 ΡΗ7.0?9.0，濃度為0.005Μ?IM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖液；步驟(2)中采用的清洗緩沖液選自以下緩沖液中的任一種或含0.05-0.2%吐溫的該種緩沖液: ρΗ5.0?8.0，濃度為0.005Μ?0.1M的磷酸鹽(PBS)緩沖液、 ΡΗ7.0?9.0，濃度為0.005Μ?IM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖液；步驟(2)所述封閉液為牛血清白蛋白、脫脂奶粉、酪蛋白、明膠或動物血清之中的任一種或其中2-3種的混合物，該封閉液的質(zhì)量體積濃度(g/mL)為1-5% ;所述動物血清為胎牛血清或馬血清，封閉劑配置緩沖溶液為偶聯(lián)緩沖液； 所述封閉劑配置緩沖液選自以下緩沖液中的任一種: ρΗ5.0?8.0，濃度為0.005Μ?0.1M的磷酸鹽(PBS)緩沖液、 ΡΗ7.0?9.0，濃度為0.005Μ?IM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖液； 步驟⑵中采用的保存緩沖液選自以下緩沖液中的任一種: ρΗ5.0?8.0，濃度為0.005Μ?0.1M的磷酸鹽(PBS)緩沖液、 ΡΗ7.0?9.0，濃度為0.005Μ?IM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖液；步驟(3)中采用的洗脫緩沖液為:ρΗ5.0?7.0，濃度為0.05Μ?0.15Μ的磷酸鹽(PBS)緩沖液，其中還含有0.10-0.15Μ NaCl ； 步驟(3.2)中采用的標(biāo)記緩沖液為:ρΗ7.0?10.0，濃度為0.05Μ?0.15Μ的磷酸鹽(PBS)緩沖液，其中還含有0.10-0.15Μ NaCl ； 步驟(5)所述清洗緩沖液選自以下緩沖液中的任一種或者還含0.05-0.2%吐溫的該種緩沖液: ρΗ5.0?8.0，濃度為0.005Μ?0.1M的磷酸鹽(PBS)緩沖液、 pH 7.0?9.0，濃度為0.005M?IM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖液。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于金磁微粒的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測HE4的方法，其特征在于: 所述步驟(1.3)中的清洗緩沖液是含0.05%吐溫的該種緩沖液； 所述步驟(2)中的清洗緩沖液是含0.1 %吐溫的該種緩沖液； 所述步驟(5)中的清洗緩沖液是含0.05%吐溫的該種緩沖液。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于金磁微粒的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測HE4的方法，其特征在于: 步驟(I)中采用的HE4單克隆抗體為Meridian、Hytest、或Abcam公司產(chǎn)品。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于金磁微粒的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測HE4的方法，其特征在于: 步驟(3.2)中，卩丫啶酯溶液濃度為0.05-lmM，HE4標(biāo)記抗體的投入量為50-500 μ g。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于金磁微粒的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測HE4的方法，其特征在于: 步驟(3.2)反應(yīng)的條件為:取吖啶酯溶液和HE4標(biāo)記抗體溶液，用標(biāo)記緩沖液混合，置于搖床中，在20-25°C條件下，以150?250rpm的轉(zhuǎn)速反應(yīng)10?30分鐘；加入賴氨酸鹽溶液，再次置于搖床中，在20-25°C條件下，以150?250rpm的轉(zhuǎn)速反應(yīng)20?50分鐘；HE4抗體標(biāo)記采用的標(biāo)記物是吖啶酯類化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或吖啶磺酰胺類化學(xué)發(fā)光物質(zhì)； 步驟(4)反應(yīng)的條件為:將待檢樣品和吖啶酯標(biāo)記的HE4抗體加入金磁微粒中，置于搖床，在25-40°C條件下，以150?250rpm的轉(zhuǎn)速反應(yīng)30?90分鐘。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于金磁微粒的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測HE4的方法，其特征在于: 所述吖啶酯類化學(xué)發(fā)光物質(zhì)為4-(2-琥珀酰亞氨基羧基)苯基-10-甲基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸鹽、B丫啶酯-NSP-DMAE-NHS，所述吖啶磺酰胺類化學(xué)發(fā)光物質(zhì)為吖啶磺酰胺NSP-SA-NHSo8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于金磁微粒的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測HE4的方法，其特征在于: 步驟￠)中采用的化學(xué)發(fā)光底物是含有雙氧水和氫氧化鈉的溶液，或者在所述含有雙氧水和氫氧化鈉的溶液中還含有曲拉通-100和硝酸。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的基于金磁微粒的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測HE4的方法，其特征在于: 步驟(6)中采用的化學(xué)發(fā)光底物包括使用前獨(dú)立存在的發(fā)光激發(fā)液A和發(fā)光激發(fā)液B，其中發(fā)光激發(fā)液A中含有0.1 %雙氧水、0.05-0.5M硝酸，發(fā)光激發(fā)液B中含有0.25M氫氧化鈉、0.5% -5%的曲拉通-100。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種基于金磁微粒的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測人附睪分泌蛋白4(HE4)的方法，主要包括以下步驟：(1)以金磁微粒作為免疫反應(yīng)和固相分離的載體，將HE4包被抗體偶聯(lián)在金磁微粒的表面；(2)用封閉液封閉金磁微粒表面未與HE4包被抗體結(jié)合的空白位點(diǎn)；(3)用吖啶酯(AE)對HE4標(biāo)記抗體進(jìn)行標(biāo)記；(4)將待檢樣品和能與HE4抗原發(fā)生特異性結(jié)合吖啶酯標(biāo)記的HE4抗體加入封閉后的包被有HE4抗體的金磁微粒中進(jìn)行反應(yīng)，形成雙抗體夾心復(fù)合物；(5)清洗；(6)化學(xué)發(fā)光檢測。本發(fā)明檢測靈敏度高、特異性好、線性范圍寬、精密度高、穩(wěn)定性好、無放射性污染、操作安全、方法簡便快速。
【IPC分類】G01N33/577, G01N33/68, G01N21/76, G01N33/543
【公開號】CN104897901
【申請?zhí)枴緾N201510240537
【發(fā)明人】馬樂, 郭博陽, 崔亞麗
【申請人】西安金磁納米生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2015年5月12日