一種快速檢測牛奶過敏原的免疫膠體金法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種快速檢測牛奶過敏原的免疫膠體金 法。
【背景技術(shù)】
[0002] FA0/WH0認(rèn)定的導(dǎo)致人類食物過敏的八大類食品中，牛乳及其制品就是其中之 一。在歐美的食品標(biāo)簽法中也規(guī)定了牛乳是必須標(biāo)示的食物過敏原成分。乳球蛋白 (0-lactoglobulin，0LG)是牛乳中的主要過敏原，牛乳過敏原0LG的檢測方法目前主要 是針對牛乳中特異性過敏原蛋白質(zhì)或編碼過敏原的DNA片段。以DNA片段為檢測目標(biāo)的 檢測的手段，依賴聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)來擴(kuò)增特定的DNA片段，檢測食品中過敏原基因的 DNA殘留，這種技術(shù)是把編碼過敏原蛋白的DNA作為食物過敏物質(zhì)的檢測目標(biāo)而不是檢測 過敏原蛋白本身。這類方法目前應(yīng)用比較廣泛是定性PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)。Real-time PCR可以利用特異性探針提高檢測的特異性。目前，PCR技術(shù)已用于不同 食品過敏原的檢測。但食物過敏反應(yīng)主要是由于食物中過敏原蛋白所引起，并不是蛋白對 應(yīng)的基因本身，PCR出現(xiàn)陽性結(jié)果也不能說明食物中含有對應(yīng)的過敏原蛋白。因此，以檢測 過敏原基因?yàn)榛A(chǔ)的方法并不是理想的檢測方法，在實(shí)際檢測中應(yīng)用較少。
[0003] 檢測食物中特異性過敏原蛋白質(zhì)的方法主要是基于蛋白與特異抗體的免疫反 應(yīng)性。制備高效價(jià)的特異性抗體是過敏原蛋白檢測的關(guān)鍵。在牛乳過敏原的免疫檢測 中就是利用抗原和抗體的特異結(jié)合的原理。目前，最主要的免疫檢測方法就是ELISA法 (Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。有兩種半定量的 ELISA 方法：分別是雙 抗體夾心法（Double antibody sandwich method ELISA，S_ELISA)和競爭法（Competitive ELISA，C-ELISA)，其中雙抗體夾心法靈敏高，也最為常用。ELISA的蛋白檢測方法主要是檢 測食品中的牛乳總蛋白或牛乳主要過敏原（0 LG，CNs，BSA)，S-ELISA的檢出限（L0D) -般 是約為2. 5ppm，C-ELISA的L0D -般約為lppm。ELISA的檢測所用時(shí)間大約2h~4h。純化 的抗0LG多克隆抗體已經(jīng)用于雙抗體夾心法檢測嬰幼兒奶粉和人乳中低劑量的0LG，其 檢出限可達(dá)到0.002 mg* mL'目前，基于抗0LG單克隆抗體的雙抗體夾心法也用于檢測 天然或變性的0LG，可檢測熱處理后變性的牛乳及其制品?？估业鞍锥嗫寺】贵w和單克隆 抗體也已用于牛乳中酪蛋白的檢測，主要用于評價(jià)水解嬰幼兒奶粉蛋白的免疫反應(yīng)性。近 年來，雙抗體夾心法還用于檢測不含牛乳成分的食品中的牛乳過敏原，如果汁、餅干和巧克 力中是否含有酪蛋白成分，其檢出限可達(dá)到5 mg*kg'但是，ELISA的方法耗時(shí)，耗力；需 要專業(yè)的設(shè)備，并且檢測人員需經(jīng)一定的專業(yè)培訓(xùn)才能操作。
[0004] 除了 ELISA方法外，電泳法（SDS-PAGE)、質(zhì)譜法（LC/MS/MS)，免疫印跡法（Western Blotting)也用于水解牛乳中牛乳過敏原的檢測。但與傳統(tǒng)的ELISA方法相比，這些方法的 靈敏度不高，對低劑量的過敏原檢測不出或成本太高。
[0005] 基于抗0 LG多克隆和單克隆抗體酶鏈免疫檢測牛乳主要過敏原0 LG牛乳的研宄 也有研宄報(bào)道。雖然酶鏈免疫檢測方法具有高特異性和高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，但是，這些方法用 于食品過敏原的檢測上，需要較長的時(shí)間和較大的工作量，還需要一定的實(shí)驗(yàn)條件和專業(yè) 技術(shù)人員進(jìn)行操作。
[0006] 因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進(jìn)和發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測牛奶過敏原的免 疫膠體金法，旨在解決現(xiàn)有檢測方法耗時(shí)耗力，靈敏度低，且需專業(yè)人員才能操作的問題。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 一種快速檢測牛奶過敏原的免疫膠體金法，其中，包括步驟： A、 以牛乳0 LG作為抗原，免疫動(dòng)物，獲得雜交瘤細(xì)胞； B、 通過雜交瘤細(xì)胞，制備單克隆抗體； C、 對單克隆抗體進(jìn)行鑒定，并得到單克隆抗體的表位信息； D、 選取兩株不同表位的單克隆抗體分別作為包被單抗和檢測單抗制備膠體金測試紙 條，所述膠體金測試紙條包括吸水纖維、硝酸纖維素膜和吸水濾紙三部分，其中，吸水纖維 部分噴抗牛乳0LG的包被單克隆抗體-膠體金結(jié)合物，硝酸纖維素膜上噴涂抗牛乳0LG 的檢測單抗；放于室溫下進(jìn)行反應(yīng)，得到檢測結(jié)果。
[0009] 所述的快速檢測牛奶過敏原的免疫膠體金法，其中，所述步驟A具體包括：4-6周 齡BALB/c小鼠作為免疫動(dòng)物，經(jīng)免疫、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞的篩選與克隆，得到雜交瘤細(xì) 胞克隆株。
[0010] 所述的快速檢測牛奶過敏原的免疫膠體金法，其中，通過有限稀釋法對雜交瘤細(xì) 胞孔進(jìn)行克隆。
[0011] 所述的快速檢測牛奶過敏原的免疫膠體金法，其中，所述步驟B具體包括：取 BALB/c小鼠，腹腔內(nèi)注射石蠟油，1~2周后注射雜交瘤細(xì)胞；7-9天后，收集腹水，離心，吸取 上清，然后對收集的上清進(jìn)行抗體純化，得到抗牛乳0 LG的單克隆抗體。
[0012] 所述的快速檢測牛奶過敏原的免疫膠體金法，其中，所述步驟C還包括：對單克隆 抗體的純度及免疫印跡、單克隆抗體的亞類、單克隆抗體的效價(jià)及單克隆抗體的交叉性進(jìn) 行鑒定。
[0013] 所述的快速檢測牛奶過敏原的免疫膠體金法，其中，所述單克隆抗體的效價(jià)為：以 間接ELISA方法測定單克隆抗體的效價(jià)，同時(shí)以NS-1細(xì)胞融合細(xì)胞腹水作為陰性對照，以 P/N值> 2. 1單克隆抗體最大稀釋度作為單克隆抗體的效價(jià)。
[0014] 所述的快速檢測牛奶過敏原的免疫膠體金法，其中，所述步驟C中，所述鑒定通過 合成多肽，然后將合成的多肽與單克隆抗體特異結(jié)合，采用ELISA和Immuno dot-blotting 檢測出單克隆抗體的表位信息。
[0015] 所述的快速檢測牛奶過敏原的免疫膠體金法，其中，所述步驟D中，所述單克隆抗 體-膠體金結(jié)合物的制備步驟具體包括： 將氯金酸煮沸后，加入檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)煮沸l(wèi)〇~20min ;冷卻后，加入1(20)3調(diào) pH至8. 0~8. 5 ;加入抗牛乳過敏原0 LG的包被單抗并快速攪拌；加入0VA并快速攪拌，加 入NaCl溶液，離心，棄沉淀，上清液再離心；棄上清液，得到單克隆抗體-膠體金結(jié)合物。 [0016] 所述的快速檢測牛奶過敏原的免疫膠體金法，其中，所述步驟D中，所述膠體金測 試紙條的制備步驟具體包括：膠體金測試紙條包括吸水纖維、硝酸纖維素膜和吸水濾紙三 部分；其中，吸水纖維部分噴抗牛乳0LG的包被單克隆抗體-膠體金結(jié)合物，硝酸纖維素膜 上噴涂抗牛乳0 LG的檢測單抗和羊抗鼠IgG包被成兩條0. 8~1. 2mm寬的線條，風(fēng)干后用含 OVA的PBS封閉，干燥后依次粘在支持物上，切成0. 2 cm X 8 cm的條。
[0017] 所述的快速檢測牛奶過敏原的免疫膠體金法，其中，所述步驟D中，牛乳的檢測結(jié) 果包括：以測試條纖維素膜上出現(xiàn)兩條紅色線為陽性結(jié)果，僅出現(xiàn)一條紅色線為陰性結(jié)果， 無紅色線條出現(xiàn)則視為檢測失效。
[0018] 有益效果：本發(fā)明利用制備的已知表位的高效價(jià)的抗牛乳0 LG的單克隆抗體，然 后通過制備的雙抗體夾心的膠體金測試紙條，即可快速簡便的檢測出牛乳主要過敏原蛋白 0 LG〇
【附圖說明】
[0019] 圖1為實(shí)施例1膠體金測試條的測試結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 本發(fā)明提供一種快速檢測牛奶過敏原的免疫膠體金法，為使本發(fā)明的目的、技術(shù) 方案及效果更加清楚、明確，以下對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體 實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0021] 本發(fā)明提供一種快速檢測牛奶過敏原的免疫膠體金法，其包括步驟： A、 以牛乳0 LG作為抗原，免疫動(dòng)物，獲得雜交瘤細(xì)胞； B、 通過雜交瘤細(xì)胞，制備單克隆抗體； C、 對單克隆抗體進(jìn)行鑒定，并得到單克隆抗體的表位信息； D、 選取兩株不同表位的單克隆抗體分別作為包被單抗和檢測單抗制備膠體金測試紙 條，所述膠體金測試紙條包括吸水纖維、硝酸纖維素膜和吸水濾紙三部分，其中，吸水纖維 部分噴抗牛乳0LG的包被單克隆抗體-膠體金結(jié)合物，硝酸纖維素膜上噴涂抗牛乳0LG 的檢測單抗；放于室溫下進(jìn)行反應(yīng)，得到檢測結(jié)果。
[0022] 本發(fā)明利用制備的已知表位的高效價(jià)的抗牛乳0 LG的單克隆抗體，然后通過制 備的雙抗體夾心的膠體金測試紙條，即可快速簡便的檢測出牛乳主要過敏原蛋白0LG。本 發(fā)明的免疫膠體金檢測牛乳主要過敏原0LG的方法，檢測靈敏度約為0.2ng*mL'相比 于其他方法，本發(fā)明的免疫膠體金檢測最大的優(yōu)勢在于用時(shí)少（l~5min左右)，可快速檢測。 同時(shí)操作簡單，對操作人員無專業(yè)方面的要求，可廣泛應(yīng)用與牛乳過敏原的檢測。