檢測(cè)細(xì)胞外生化參數(shù)的光電集成電位傳感器及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分析細(xì)胞生理代謝的傳感器技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測(cè)細(xì)胞外生化參數(shù)的光電集成電位傳感器及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]活體細(xì)胞對(duì)外界刺激如藥物、環(huán)境因素變化和受體作用等產(chǎn)生響應(yīng)，會(huì)引起細(xì)胞代謝等功能性變化，外在表現(xiàn)為生化參數(shù)的改變。在分解代謝過(guò)程中，活體細(xì)胞將吸收代謝物質(zhì)(糖、氨基酸、脂肪酸等碳源)，產(chǎn)生能量(ATP)并且釋放出酸性產(chǎn)物。已有研宄證實(shí)酸化率(即H+濃度變化率)與細(xì)胞的生理狀態(tài)密切相關(guān)。細(xì)胞胞外氧化還原電位(即細(xì)胞外微環(huán)境的氧化還原狀態(tài))，反應(yīng)了自由電子的活性，與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及癌細(xì)胞侵蝕都有著密切的關(guān)系。
[0003]利用微型化電化學(xué)生物傳感器，可以將細(xì)胞培養(yǎng)在傳感器表面，細(xì)胞內(nèi)的生理變化引起胞外環(huán)境的變化，胞外的電解質(zhì)溶液與傳感器之間形成電化學(xué)池，從而將這些參數(shù)的變化通過(guò)二級(jí)換能器轉(zhuǎn)換為電信號(hào)輸出，最終實(shí)現(xiàn)定量化監(jiān)測(cè)和細(xì)胞水平的分析。
[0004]由于各種細(xì)胞生化參數(shù)檢測(cè)的原理和技術(shù)的差異性較大，并且同時(shí)檢測(cè)存在相互干擾的問(wèn)題，目前成熟的技術(shù)仍以單一參數(shù)檢測(cè)為主，例如基于光尋址電位傳感器的胞外酸化率檢測(cè)，具有特異性高靈敏度，已有非常成功的商業(yè)化產(chǎn)品，例如美國(guó)分子器件公司生產(chǎn)的微生理計(jì)。此外，主流的集成傳感器僅對(duì)各個(gè)檢測(cè)單元進(jìn)行物理整合，各個(gè)單元的功能相互獨(dú)立，制備過(guò)程復(fù)雜，通常體積較大，不易實(shí)現(xiàn)細(xì)胞水平的檢測(cè)。再加之一些檢測(cè)技術(shù)在安全性和小型化方面的局限性，限制了其在細(xì)胞檢測(cè)方面的應(yīng)用，例如胞外葡萄糖濃度的檢測(cè)，常用技術(shù)為采用電流型葡萄糖傳感器，需要在工作電極上施加一定的電壓，對(duì)細(xì)胞造成不可避免的損傷，而采用傳統(tǒng)的電位型傳感器雖然可以避免施加電壓，但其靈敏度和分辨率又無(wú)法達(dá)到細(xì)胞水平的測(cè)量要求；氧化還原電位檢測(cè)通常采用傳統(tǒng)大電極，其檢測(cè)靈敏度較低，且體積大難以封裝。
[0005]多參數(shù)聯(lián)合檢測(cè)有利于從多個(gè)角度反映細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝狀況和對(duì)外界刺激的反應(yīng)，目前還沒(méi)有出現(xiàn)在同一個(gè)測(cè)試腔體中對(duì)細(xì)胞的能源消耗、代謝產(chǎn)物以及自由電子活性進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)的技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測(cè)細(xì)胞外生化參數(shù)的光電集成電位傳感器及其制備方法。
[0007]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:一種檢測(cè)細(xì)胞外生化參數(shù)的光電集成電位傳感器，包括:傳感芯片、芯片PCB板、外置導(dǎo)線、外置電極和細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)試腔體。
[0008]所述傳感芯片具有硅基底，硅基底背面具有三個(gè)光源照射窗口，三個(gè)光源照射窗口之間間隔至少1_，在硅基底正面與光源照射窗口相對(duì)應(yīng)的位置分別設(shè)有第一敏感區(qū)域、第二敏感區(qū)域和第三敏感區(qū)域，在除第一敏感區(qū)域、第二敏感區(qū)域和第三敏感區(qū)域外的硅基底上表面通過(guò)離子注入或擴(kuò)散形成重?fù)诫s層，在硅基底正面覆蓋薄氧化層，作為H+離子敏感材料；在薄氧化層表面第二敏感區(qū)域?qū)?yīng)的位置覆蓋第一金屬層，作為氧化還原電位敏感材料；在薄氧化層表面第三敏感區(qū)域?qū)?yīng)的位置覆蓋復(fù)合膜，作為葡萄糖的敏感材料；所述復(fù)合膜由第二金屬層上電鍍聚吡咯和葡萄糖氧化酶的混合物形成；傳感芯片邊緣具有一焊盤(pán)，焊盤(pán)通過(guò)導(dǎo)線與第二金屬層相連；第一金屬層和復(fù)合膜的上表面、薄氧化層上第一敏感區(qū)域?qū)?yīng)的位置以及焊盤(pán)均暴露于傳感芯片表面，其他區(qū)域均覆蓋Si3N4絕緣層；硅基底背面的非窗口區(qū)域覆蓋鋁電極；所述芯片PCB板上具有第一接口焊盤(pán)、第二接口焊盤(pán)、第一引線、第二引線、第一引腳和第二引腳，所述第一接口焊盤(pán)的形狀和尺寸與傳感芯片背面相同，并在光源照射窗口的相對(duì)應(yīng)位置開(kāi)有透光孔；第一接口焊盤(pán)通過(guò)第一引線與第一引腳相連，第二接口焊盤(pán)通過(guò)第二引線與第二引腳相連；第一引腳和第二引腳位于芯片PCB板的邊緣；所述外置導(dǎo)線一端連接在傳感芯片的焊盤(pán)上，另一端連接在第二接口焊盤(pán)上；所述細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)試腔體的內(nèi)側(cè)壁開(kāi)有凹槽，所述外置電極固定在凹槽內(nèi)。
[0009]一種檢測(cè)細(xì)胞外生化參數(shù)的光電集成電位傳感器的制備方法，包括以下步驟:
[0010](I)制備背面光源照射窗口:選擇電阻率為8?10 Ω.Cm的P型硅片作為硅基底，清洗烘干之后，在硅基底背面旋涂光刻膠，經(jīng)紫外曝光顯影，采用濕法腐蝕，蝕刻出光源照射窗口，光源照射窗口頂部的硅基底剩余厚度為100 μ m ;
[0011](2)制備重?fù)诫s層:在1000°C高溫?cái)U(kuò)散爐內(nèi)，通干氧，硅基底正面熱氧化生長(zhǎng)一層厚氧化層，厚度800?lOOOnm，隨后在厚氧化層上旋涂一層光刻膠，經(jīng)紫外曝光顯影，采用濕法腐蝕去除正面暴露的氧化層，然后采用離子注入或擴(kuò)散法形成P+重?fù)诫s層，與此同時(shí)，P+重?fù)诫s層表面也會(huì)有少量氧化層形成；
[0012](3)制備H+離子敏感膜材料:采用濕法腐蝕將硅基底正面的氧化層全部去除，然后在芯片正面熱氧化生長(zhǎng)一層薄氧化層，厚度50nm ;
[0013](4)制備金屬敏感膜材料:在薄氧化層表面旋涂光刻膠，經(jīng)紫外曝光顯影之后，磁控濺射20nm厚的鈦化鎢薄膜作為粘附層，接著磁控濺射沉積一層金屬層，厚度150?200nm，然后采用lift-off工藝將第二敏感區(qū)域、第三敏感區(qū)域、導(dǎo)線和焊盤(pán)以外的金屬層進(jìn)行剝離；
[0014](5)制備片上隔離區(qū)域:采用LPCVD法在硅基底正面沉積一層Si3N4絕緣層，厚度I μm，隨后旋涂光刻膠，經(jīng)紫外曝光顯影，蝕刻第一敏感區(qū)域、第二敏感區(qū)域、第三敏感區(qū)域、焊盤(pán)表面覆蓋的Si3N4絕緣層，而其他區(qū)域表面的Si 3N4絕緣層保留下來(lái)，作為片上隔離區(qū)域；
[0015](6)制備背面鋁電極:硅基底背面熱蒸發(fā)沉積金屬鋁，厚度300nm，并在鋁層表面旋涂光刻膠，經(jīng)曝光顯影，蝕刻掉光源照射窗口表面的鋁層，保留非窗口區(qū)域的鋁電極；
[0016](7)傳感器的封裝:利用劃片工藝將硅基底分割成IcmX Icm的小片，取出一小片，將背面鋁電極涂上導(dǎo)電膠，并粘合在芯片PCB板上的第一接口焊盤(pán)處，放置于100 V的烘箱中固化I小時(shí)；將外置導(dǎo)線的一端焊接在第二接口焊盤(pán)上，將另一端涂上導(dǎo)電膠，粘合在傳感芯片表面的焊盤(pán)上，放置于100°C的烘箱中固化I小時(shí)，使得第二金屬層與第二引腳導(dǎo)通；然后將外置電極卡在凹槽內(nèi)，再用環(huán)氧樹(shù)脂膠水將細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)試腔體封接在芯片PCB板上，并使得傳感芯片暴露在細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)試腔體內(nèi)部；
[0017](8)制備復(fù)合膜:配制單體吡咯和葡萄糖氧化酶的混合溶液，吡咯單體濃度為0.1M，葡萄糖氧化酶濃度在20?300U/mL范圍內(nèi)，將混合溶液滴加到細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)試腔體內(nèi)，將第二金屬層作為工作電極，第二引腳為工作電極的信號(hào)引出腳，Ag/AgCl作為參比電極，外置電極作為對(duì)電極，組成三電極體系，分別與恒電位/電流儀上的工作電極接口、參比電極接口、對(duì)電極接口相連，在工作電極上施加恒電流，電流密度為0.0lmA/cm2?1.0mA/cm2，電荷密度為10?40mC/cm2，單體吡咯發(fā)生聚合，并包埋葡萄糖氧化酶，在第二金屬層表面即可形成復(fù)合膜，厚度小于lOOnm，隨后采用pH7的磷酸鹽緩沖液對(duì)傳感芯片表面進(jìn)行清洗，而后放置在4°C條件下干燥保存待用，得到光電集成電位傳感器。
[0018]本發(fā)明的有益效果是:
[0019](I)本發(fā)明在硅基底的光尋址電位傳感器表面沉積金屬層，可以對(duì)氧化還原電位參數(shù)進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)，體積小，易于封裝，有利于細(xì)胞外自由電子活度的檢測(cè)；
[0020](2)本發(fā)明結(jié)合MEMS工藝和電化學(xué)技術(shù)，在金屬層表面電聚合修飾聚吡咯/葡萄糖氧化酶復(fù)合膜，可以對(duì)葡萄糖濃度進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)，并且測(cè)試無(wú)需施加工作電壓，對(duì)細(xì)胞無(wú)刺激、無(wú)損傷，在不影響細(xì)胞正常生理活性的前提下實(shí)現(xiàn)能量消耗速率的檢測(cè)；
[0021](3)本發(fā)明以光尋址電位傳感器以基礎(chǔ)，在其表面制備多種敏感膜，可實(shí)現(xiàn)胞外酸化率、胞外葡萄糖消耗速率、胞外氧化還原電位三個(gè)生化參數(shù)的同時(shí)檢測(cè)，由于傳感器