082]①A液:向上述制備的3-HS-T-2中加入ImL DMF,震蕩溶解，得到A液；
[0083]B液:25mg OVA和15mg EDC溶于5mL磷酸鹽緩沖液(所述磷酸鹽緩沖液的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下:KH2PO40.27g/L，Na2HPO4.12H20 2.86g/L，KCl 0.2g/L，NaCl 8.8g/L)，得到B液；
[0084]②將A液、B液混勻，室溫(20-25°C )攪拌過夜；
[0085]③將反應(yīng)液裝入半透膜中，在所述磷酸鹽緩沖液中透析3天，每天更換3次透析液，獲得包被原3-HS-T-2-0VA，即為T-2毒素與卵清蛋白的偶聯(lián)物。
[0086]④對部分包被原進(jìn)行MALD1-T0F檢測，經(jīng)過計(jì)算得到其偶聯(lián)結(jié)合比為10.8:1(卵清蛋白:3-HS-T-2的物質(zhì)的量比)。
[0087](2)制備層析膜
[0088]將步驟(I)制備的T-2毒素與卵清蛋白蛋白的偶聯(lián)物(3-HS-T-2-0VA)和羊抗鼠IgG抗體分別用包被溶液稀釋成1:5和1:60，得到T-2毒素與卵清蛋白的偶聯(lián)物溶液(濃度為0.8mg/mL)和羊抗鼠IgG抗體溶液(濃度為1.0mg/mL)。將所述T-2毒素與卵清蛋白的偶聯(lián)物溶液按照0.8 μ L/cm2的用量噴涂在硝酸纖維素膜上，得到檢測線；將所述羊抗鼠IgG抗體溶液按照0.9 μ L/cm2的用量噴涂在所述硝酸纖維素膜上，得到質(zhì)控線；使得檢測線和質(zhì)控線兩者平行且間距4mm ;烘干(37°C，24h)，密封干燥保存。
[0089]所述包被溶液的組成如下:每IL所述包被溶液中含有Na2HPO4.12H20 5.37g，NaH2PO4.2H20 0.78g，NaCl 29.25g，余量為水。
[0090]3、試紙條的制備
[0091]以PVC膠粘板作底板，將步驟I制備的樣品墊、步驟2制備的層析膜(具有質(zhì)控線和檢測線)和所述吸水墊(植物纖維吸濾紙)依次連接并固定于所述底板上，使所述層析膜上的所述檢測線靠近所述樣品墊一端、所述質(zhì)控線靠近所述吸水墊一端，所述樣品墊、所述吸水墊分別與所述層析膜交聯(lián)一段(約1mm)，用切條機(jī)將貼好的PVC板切成等寬的試紙條即可，密封干燥保存。
[0092]圖1為試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0093]二、熒光微球標(biāo)記T-2毒素單克隆抗體的制備
[0094]將6 yg所述T-2毒素單克隆抗體和20 μ L所述熒光微球(直徑為200nm，變異系數(shù)為5% ;固體含量為2%，相當(dāng)于0.4mg熒光微球)加入到所述標(biāo)記緩沖液中，室溫(20-25°C )避光振蕩15min;加入0.4mg偶聯(lián)活化劑1_乙基_(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)，室溫(20-25 °C )避光振蕩反應(yīng)2h;接著加入20yL牛血清白蛋白溶液，室溫(20-25 0C )避光振蕩15min ；1000rpm(12857g)離心1min,以ImL復(fù)溶液；再1000rpm(12857g)離心lOmin，最后以1000 μ L所述復(fù)溶液重懸沉淀，4°C保存。即獲得熒光微球標(biāo)記T-2毒素單克隆抗體懸液。懸液中，熒光微球標(biāo)記的T-2毒素單克隆抗體的濃度為6 μ g/mL(以單克隆抗體的量計(jì))。
[0095]其中，所述標(biāo)記緩沖液的溶質(zhì)為嗎啉乙磺酸，溶劑為水；所述嗎啉乙磺酸在所述標(biāo)記緩沖液中的濃度為0.05M，pH值為6.5。
[0096]所述牛血清白蛋白溶液的溶劑為水，溶質(zhì)為牛血清白蛋白；所述牛血清白蛋白在所述牛血清白蛋白溶液中的濃度為200g/L。
[0097]所述復(fù)溶液的溶劑為0.02M磷酸緩沖液，溶質(zhì)為牛血清白蛋白、葡聚糖和聚乙二醇20000(PEG 20000);所述牛血清白蛋白在所述復(fù)溶液中的濃度為10g/L，所述葡聚糖在所述復(fù)溶液中的濃度為20g/L，所述聚乙二醇20000 (PEG 20000)在所述復(fù)溶液中的濃度為lg/L;所述0.02M磷酸緩沖液的組成如下??每IL所述0.02M磷酸緩沖液中含有Na2HPO4.12H20 5.37g，NaH2PO4.2H20 0.78g，余量為水。
[0098]實(shí)施例2、實(shí)施例1中基于熒光微球免疫層析法檢測T-2毒素的產(chǎn)品的使用方法
[0099]一、定性檢測
[0100]1、將120 μ L待測樣品與2 μ L實(shí)施例1步驟二制備獲得的熒光微球標(biāo)記Τ-2毒素單克隆抗體懸液(懸液中所述經(jīng)熒光微球標(biāo)記的τ-2毒素抗體的濃度為6 μ g/mL)，以單克隆抗體的量計(jì))混合，得到混合液；將所述混合液加入到實(shí)施例1步驟一制備的所述試紙條的所述樣品墊，反應(yīng)10-15min，烘干。
[0101]2、根據(jù)所述試紙條的反應(yīng)結(jié)果，按照如下確定所述待測樣品中是否含有T-2毒素:將反應(yīng)后的試紙條置于紫外燈下照射，若所述檢測線與所述質(zhì)控線均顯示亮紅色熒光(所述檢測線的熒光強(qiáng)度不顯著低于所述質(zhì)控線的熒光強(qiáng)度)，則檢測結(jié)果為陰性，即認(rèn)為所述待測樣品中不含有T-2毒素或候選不含有T-2毒素；若所述檢測線不顯示紅色熒光或顯色微弱(所述檢測線的熒光強(qiáng)度低于所述質(zhì)控線的熒光強(qiáng)度)，且所述質(zhì)控線顯示亮紅色熒光，則檢測結(jié)果為陽性，即認(rèn)為所述待測樣品中含有T-2毒素或候選含有T-2毒素。
[0102]應(yīng)用實(shí)施例1中基于熒光微球免疫層析法檢測T-2毒素的產(chǎn)品檢測待測樣品中是否含有T-2毒素，肉眼判定結(jié)果如圖2所示:當(dāng)待測樣品中T-2毒素不存在時(shí)，C線、T線均顯示亮紅色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性(圖2中a);當(dāng)待測樣品中T-2毒素含量較高時(shí)，因無足夠游離的所述經(jīng)熒光微球標(biāo)記的T-2毒素抗體與層析膜上檢測線處包被的抗原(即T-2毒素與卵清蛋白的偶聯(lián)物3-HS-T-2-0VA)結(jié)合，檢測線顯色微弱或不顯色，質(zhì)控線顯示亮紅色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性(圖2中b)。不論樣品中是否含有T-2毒素，質(zhì)控線上的二抗都與所述經(jīng)熒光微球標(biāo)記的T-2毒素抗體結(jié)合，顯示亮紅色，若質(zhì)控線不顯色，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效(圖2中c 和 d)。
[0103]二、定量檢測
[0104]1、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0105]用磷酸鹽緩沖液(配方如下=KH2PO40.27g，Na2HPO4.12H20 2.86g，KCl 0.2g，NaCl8.8g，純水定容至1L)將濃度為10 μ g/mL的T_2毒素的標(biāo)準(zhǔn)品作系列稀釋:0.3ng/mL、0.625ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL 和 40ng/mL(同時(shí)設(shè)立空白對照組)。針對每個稀釋度的T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，均將120 μ L Τ-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液與2 μ L實(shí)施例1步驟二制備獲得的熒光微球標(biāo)記Τ-2毒素單克隆抗體懸液(懸液中所述經(jīng)熒光微球標(biāo)記的Τ-2毒素抗體的濃度為6 μ g/mL,以單克隆抗體的量計(jì))混合，得到若干份混合液；取同一批次的若干個實(shí)施例1步驟一制備的試紙條用于檢測所述若干份混合液，每一個所述試紙條檢測一份所述混合液，所述檢測為:將所述混合液加入到所述試紙條的所述樣品墊，反應(yīng)10-15min ;烘干后用熒光讀數(shù)儀在激發(fā)和發(fā)射波長分別為580nm和605nm下讀取所述試紙條的所述質(zhì)控線和所述檢測線的熒光強(qiáng)度；以所述T-2毒素的標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)(X)，以所述檢測線的熒光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。質(zhì)控線的熒光強(qiáng)度值用來判定試紙條是否有效。
[0106]所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖如圖3所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:
[0107]Y = 56.02+(434.08-56.02)/[l+(x/l.58) 1.23]，R2= 0.97。
[0108]2、待測樣品檢測
[0109]將120 μ L Τ-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液與2 μ L實(shí)施例1步驟二制備獲得的熒光微球標(biāo)記Τ-2毒素單克隆抗體懸液(懸液中所述經(jīng)熒光微球標(biāo)記的Τ-2毒素抗體的濃度為6 μ g/mL,以單克隆抗體的量計(jì))混合后加入到未使用過的所述試紙條(與步驟I中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖時(shí)采用的所述試紙條同一批次)的所述樣品墊，反應(yīng)10-15min ;烘干后用熒光讀數(shù)儀在激發(fā)和發(fā)射波長分別為580nm和605nm下讀取所述試紙條的所述質(zhì)控線和所述檢測線的熒光強(qiáng)度，將所述檢測線的熒光強(qiáng)度值代入步驟I的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計(jì)算得到所述待測樣品中的T-2毒素的濃度值。
[0110]實(shí)施例3、應(yīng)用實(shí)施例1中基于熒光微球免疫層析法檢測T-2毒素的產(chǎn)品進(jìn)行檢測時(shí)的特異性分析
[0111]一、定性檢測
[0112]對照樣品:濃度為20ng/mL的T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液；供試樣品濃度為20ng/mL的其它毒素(具體是指HT-2毒素、脫氧雪腐鐮刀菌稀醇、伏馬毒素、黃曲霉毒素和赭曲霉毒素)標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
[0113]參照實(shí)施例2步驟一測定各供試樣品中是否含有T-2毒素。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測定三次。
[0114]結(jié)果顯示，只有T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的檢測結(jié)果呈陽性，即“所述檢測線不顯示紅色熒光或顯色微弱(所述檢測線的熒光強(qiáng)度低于所述質(zhì)控線的熒光強(qiáng)度)，且所述質(zhì)控線顯示亮紅色熒光”，而其它毒素標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果均呈陰性，即“所述檢測線與所述質(zhì)控線均顯示亮紅色熒光(所述檢測線的熒光強(qiáng)度不顯著低于所述質(zhì)控線的熒光強(qiáng)度)”。所述基于熒光微球免疫層析法檢測T-2毒素的產(chǎn)品可特異性定性檢測T-2毒素。
[0115]二、定量檢測
[0116]1、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0117]用磷酸鹽緩沖液(配方為KH2PO40.27g，Na2HPO4.12H20 2.86g，KCl 0.2g，NaCl8.8g，純水定容至1L)將濃度為10 μ g/mL的T-2毒素或其它毒素(具體是指HT-2毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、伏馬毒素B1、黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素)的標(biāo)準(zhǔn)品作系列稀釋:0.3ng/mL、0.625ng/mL、l.25ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL 和 40ng/mL(同時(shí)設(shè)立空白對照組)。針對每個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，均將120 μ L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液與2 μ L實(shí)施例I步驟二制備獲得的熒光微球標(biāo)記τ-2毒素單克隆抗體懸液(其中所述經(jīng)熒光微球標(biāo)記的Τ-2毒素抗體的含量為6 μ g/mL,以單克隆抗體的量計(jì))混合，得到若干份混合液；取同一批次的若干個實(shí)施例1步驟一制備的試紙條用于檢測所述若干份混合液，每一個所述試紙條檢測一份所述混合液，所述檢測為:將所述混合液加入到所述試紙條的所述樣品墊，反應(yīng)10-15min ;烘干后用焚光讀數(shù)儀在激發(fā)和發(fā)射波長分別為580nm和6