降低lc-ms測(cè)試物中不揮發(fā)性緩沖鹽含量的方法和裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本申請(qǐng)屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種液相色譜-質(zhì)譜法中的相關(guān)操作以及其使用的一種裝置，特別是涉及一種用于降低液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)法測(cè)試物中緩沖鹽含量的方法以及其使用的一種裝置。本申請(qǐng)方法和裝置可以有效地降低高效液相色譜洗脫液中的緩沖鹽含量，從而使得該洗脫液在用于后續(xù)的質(zhì)譜測(cè)定時(shí)減少對(duì)質(zhì)譜儀的損耗。本發(fā)明采用簡(jiǎn)單的處理方法和簡(jiǎn)單的裝置，可以實(shí)現(xiàn)LC-MS法的LC洗脫餾份中不揮發(fā)性緩沖鹽濃度的大大降低，并且目標(biāo)物質(zhì)不會(huì)損耗。
【背景技術(shù)】
[0002]質(zhì)譜分析是一種測(cè)量離子質(zhì)荷比(質(zhì)量-電荷比)的分析方法，其基本原理是使試樣中各組分在離子源中發(fā)生電離，生成不同荷質(zhì)比的帶電荷的離子，經(jīng)加速電場(chǎng)的作用，形成離子束，進(jìn)入質(zhì)量分析器。在質(zhì)量分析器中，再利用電場(chǎng)和磁場(chǎng)使發(fā)生相反的速度色散，將它們分別聚焦而得到質(zhì)譜圖，從而確定其質(zhì)量。
[0003]質(zhì)譜技術(shù)是一種鑒定技術(shù)，在有機(jī)分子的鑒定方面發(fā)揮非常重要的作用。它能快速而極為準(zhǔn)確地測(cè)定生物大分子的分子量，使蛋白質(zhì)組研究從蛋白質(zhì)鑒定深入到高級(jí)結(jié)構(gòu)研究以及各種蛋白質(zhì)之間的相互作用研究。
[0004]隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域也越來越廣。由于質(zhì)譜分析具有靈敏度高，樣品用量少，分析速度快，分離和鑒定同時(shí)進(jìn)行等優(yōu)點(diǎn)，因此，質(zhì)譜技術(shù)廣泛的應(yīng)用于化學(xué)，化工，環(huán)境，能源，醫(yī)藥，運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)，刑事科學(xué)技術(shù)，生命科學(xué)，材料科學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。
[0005]質(zhì)譜儀種類繁多，不同儀器應(yīng)用特點(diǎn)也不同，一般來說，在300°C左右能汽化的樣品，可以優(yōu)先考慮用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)進(jìn)行分析，因?yàn)镚C-MS使用EI源，得到的質(zhì)譜信息多，可以進(jìn)行庫檢索。毛細(xì)管柱的分離效果也好。如果在300°C左右不能汽化，則需要用LC-MS分析，此時(shí)主要得分子量信息，如果是串聯(lián)質(zhì)譜，還可以得一些結(jié)構(gòu)信息。如果是生物大分子，主要利用LC-MS和MALD1-T0F分析，主要得分子量信息。對(duì)于蛋白質(zhì)樣品，還可以測(cè)定氨基酸序列。質(zhì)譜儀的分辨率是一項(xiàng)重要技術(shù)指標(biāo)，高分辨質(zhì)譜儀可以提供化合物組成式，這對(duì)于結(jié)構(gòu)測(cè)定是非常重要的。雙聚焦質(zhì)譜儀，傅立葉變換質(zhì)譜儀，帶反射器的飛行時(shí)間質(zhì)譜儀等都具有高分辨功能。
[0006]質(zhì)譜分析法對(duì)樣品有一定的要求。進(jìn)行GC-MS分析的樣品應(yīng)是有機(jī)溶液，水溶液中的有機(jī)物一般不能測(cè)定，須進(jìn)行萃取分離變?yōu)橛袡C(jī)溶液，或采用頂空進(jìn)樣技術(shù)。有些化合物極性太強(qiáng)，在加熱過程中易分解，例如有機(jī)酸類化合物，此時(shí)可以進(jìn)行酯化處理，將酸變?yōu)轷ピ龠M(jìn)行GC-MS分析，由分析結(jié)果可以推測(cè)酸的結(jié)構(gòu)。如果樣品不能汽化也不能酯化，那就只能進(jìn)行LC-MS分析了。對(duì)于極性樣品，一般采用ESI源，對(duì)于非極性樣品，采用APCI源。
[0007]液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(liquidChromatograph Mass Spectrometer)，簡(jiǎn)稱LC-MS，是液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的儀器。它結(jié)合了液相色譜儀有效分離熱不穩(wěn)性及高沸點(diǎn)化合物的分離能力與質(zhì)譜儀很強(qiáng)的組分鑒定能力。是一種分離分析復(fù)雜有機(jī)混合物的有效手段。
[0008]色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是當(dāng)代最重要的分離和鑒定的分析方法之一。色譜的優(yōu)勢(shì)在于分離，色譜的分離能力為混合物分離提供了最有效的選擇，但色譜方法難以得到結(jié)構(gòu)信息，其主要靠與標(biāo)樣對(duì)比達(dá)到對(duì)未知物結(jié)構(gòu)的推定；在對(duì)復(fù)雜混合未知物的結(jié)構(gòu)分析方面顯得薄弱；在常規(guī)的紫外檢測(cè)器上對(duì)于無紫外吸收化合物的檢測(cè)和大量未知化合物的定性分析還需依賴于其他手段。質(zhì)譜法能提供豐富的結(jié)構(gòu)信息，用樣量又是幾種譜學(xué)方法中用量最少的，但其樣品需經(jīng)預(yù)處理(純化、分離)，程序復(fù)雜、耗時(shí)長。長期以來，人們?yōu)榻鉀Q這兩種技術(shù)的弱點(diǎn)發(fā)展了許多技術(shù)，其中色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是最具發(fā)展和應(yīng)用前景的技術(shù)之一。目前應(yīng)用較多的是氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用。但是GC要求樣品具有一定的蒸氣壓，只有20%的藥品可不經(jīng)過預(yù)先的化學(xué)處理而能滿意地用氣相色譜分離，多種情況下所研究的藥物需要經(jīng)過適當(dāng)?shù)念A(yù)處理和衍生化，以使之成為易汽化的樣品才能進(jìn)行GC-MS分析。而HPLC可分離極性的、離子化的、不易揮發(fā)的高分子質(zhì)量和熱不穩(wěn)定的化合物，同時(shí)LC-MS聯(lián)機(jī)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)LC檢測(cè)器的不足，具有高分離能力，高靈敏度，應(yīng)用范圍更廣和具有極強(qiáng)的專屬性等特點(diǎn)，越來越受到人們的重視。據(jù)估計(jì)已知化合物中約80%的化合物均為親水性強(qiáng)、揮發(fā)性低的有機(jī)物，熱不穩(wěn)定化合物及生物大分子，這些化合物廣泛存在于當(dāng)前應(yīng)用和發(fā)展最廣泛、最有潛力的領(lǐng)域，包括生物、醫(yī)藥、化工和環(huán)境等方面，它們需要用LC分離。因此，LC與MS的聯(lián)用可以解決GC-MS無法解決的問題。
[0009]液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀是液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的儀器。它結(jié)合了液相色譜儀有效分離熱不穩(wěn)性及高沸點(diǎn)化合物的分離能力與質(zhì)譜儀很強(qiáng)的組分鑒定能力。是一種分離分析復(fù)雜有機(jī)混合物的有效手段。聯(lián)機(jī)的關(guān)鍵是適用接口的開發(fā)，必須在試樣組分進(jìn)入離子源前去除溶劑，目前，多采用履帶式加熱傳送帶。
[0010]液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(liquidChromatograph Mass Spectrometer)，簡(jiǎn)稱LC-MS，是有機(jī)物分析市場(chǎng)中的高端儀器。液相色譜(LC)能夠有效的將有機(jī)物待測(cè)樣品中的有機(jī)物成分分離開，而質(zhì)譜(MS)能夠?qū)Ψ珠_的有機(jī)物逐個(gè)的分析，得到有機(jī)物分子量，結(jié)構(gòu)(在某些情況下)和濃度(定量分析)的信息。強(qiáng)大的電噴霧電離技術(shù)造就了 LC-MS質(zhì)譜圖十分簡(jiǎn)潔，后期數(shù)據(jù)處理簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。LC-MS是有機(jī)物分析實(shí)驗(yàn)室，藥物、食品檢驗(yàn)室，生產(chǎn)過程控制、質(zhì)檢等部門必不可少的分析工具。
[0011]液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀特點(diǎn):液相色譜和質(zhì)譜連接，可以增加額外的分析能力，能夠準(zhǔn)確鑒定和定量像細(xì)胞和組織裂解液，血液，血漿，尿液和口腔液等復(fù)雜樣品基質(zhì)中的微量化合物。高效液相色譜質(zhì)譜系統(tǒng)(ABSciex Eksigent LC/MS和LC/MS/MS)提供了一些獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，包括:(I)快速分析和流轉(zhuǎn)所需的最少樣品準(zhǔn)備；(2)高靈敏度并結(jié)合可分析多個(gè)化合物能力，甚至可以跨越化合物的種類；(3)高精確度，高分辨率鑒定和量化目標(biāo)分析物。
[0012]盡管人們通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用解決了諸多分析化學(xué)領(lǐng)域的難題，然而，進(jìn)行LC-MS分析時(shí)，其樣品通常要求是水溶液或甲醇溶液，并且特別地要求液相色譜的流動(dòng)相中不應(yīng)含有或者盡可能少地含有不揮發(fā)的鹽。
[0013]但是，令人遺憾的是，作為液相色譜例如高效液相色譜的流動(dòng)相，通常需要向其中添加一些不具揮發(fā)的緩沖鹽以獲得優(yōu)異的色譜分離效果，但是這些包含不具揮發(fā)的緩沖鹽的色譜洗脫餾份在用于接下來的質(zhì)譜測(cè)定時(shí)，這些不揮發(fā)性緩沖鹽是難以除去或者難以與色譜洗脫餾份中的目標(biāo)物分離開的。例如，中國藥典2010年版二部第6頁收載的乙酰谷酰胺在測(cè)定其中的雜質(zhì)即有關(guān)物質(zhì)時(shí)，通過液相色譜法進(jìn)行分離分析，該液相色譜使用的流動(dòng)相中包含磷酸二氫鉀，在此情況下如果要確定其中雜質(zhì)峰的歸屬或者化學(xué)結(jié)構(gòu)的情況下，使雜質(zhì)峰色譜餾份導(dǎo)入質(zhì)譜儀來檢測(cè)是有益的，但是雜質(zhì)峰色譜餾份中所包含的磷酸二氫鉀不具揮發(fā)性，不利于質(zhì)譜測(cè)定。如果采用當(dāng)前常的方法對(duì)該雜質(zhì)峰色譜餾份進(jìn)行濃縮論(通常采用氮?dú)獯蹈傻姆椒?，盡管目標(biāo)物即雜質(zhì)濃縮了，但是其中的磷酸鹽也同樣地會(huì)成比例地濃縮，并且可能會(huì)引起PH的改變，影響待測(cè)成分的穩(wěn)定性，因此這種濃縮方法不是降低MS待測(cè)物中不揮發(fā)性緩沖鹽濃度的適宜方法。因此這種濃縮方法無法實(shí)現(xiàn)降低MS待測(cè)物中不揮發(fā)性緩沖鹽濃度的目的。
[0014]因此，化學(xué)分析領(lǐng)域技術(shù)人員迫切期待有一種能夠有效地降低液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)試物中不揮發(fā)性緩沖鹽含量甚至除去的方法，以及適用于該方法的裝置。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]本申請(qǐng)的目的在于提供一種能夠有效地降低液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)試物中不揮發(fā)性緩沖鹽含量甚至除去的方法。已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)，使液相色譜洗脫餾份照本申請(qǐng)方法進(jìn)行處理后，可以顯著地降低該液相色譜洗脫餾份中不揮發(fā)性緩沖鹽的含量。本申請(qǐng)基于該發(fā)現(xiàn)而得以完成。
[0016]為此，本發(fā)明第一方法提供了一種用于液相色譜-質(zhì)譜分析測(cè)試中降低液相色譜洗脫餾份中不揮發(fā)性緩沖鹽含量的方法，該方法包括如下步驟:
[0017](I)使檢測(cè)物配制成溶液，將該溶液注入液相色譜儀以進(jìn)行洗脫，從液相色譜洗脫液收集待用于質(zhì)譜檢測(cè)的目標(biāo)物洗脫餾份，使該洗脫餾份導(dǎo)入預(yù)先填充有助劑的注射器中；
[0018](2)在注射器中，使所述洗脫餾份與助劑充分混合(任選的在步驟(I)中可隨洗脫餾份一起額外地向注射器中加入有機(jī)溶劑(例如甲醇和/或乙腈)混合)；
[0019](3)使所得混合液通過過濾的方式使懸浮物和清液分離，分取清液；和，任選的
[0020](4)將所得清液進(jìn)行濃縮，即得。
[0021]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案的方法，其中所述液相色譜是反相高效液相色
L曰O
[0022]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案的方法，其中所述液相色譜洗脫所用的流動(dòng)相是水相和有機(jī)相的混合液。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述有機(jī)相例如但不限于:甲醇、乙腈、乙醇、四氫呋喃、異丙醇及其組合；特別是甲醇和乙腈。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述水相中包含不揮發(fā)性緩沖鹽。
[0023]根據(jù)本發(fā)明根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案的方法，其中所述水相和有機(jī)相的體積比可以是5:95?95:5的范圍。
[0024]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案的方法，其中所述不揮發(fā)性緩沖鹽例如但不限于磷酸鹽、枸櫞酸鹽、醋酸鹽、高氯酸鹽中的一種或多種。
[0025]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案的方法，其中所述不揮發(fā)性緩沖鹽的堿根是選自堿金屬或堿土金屬離子的堿根或者是銨根。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述堿根選自:鈉離子、鉀離子、鎂離子、鈣離子，優(yōu)選的堿根是鈉離子、鉀離子、或銨根離子。
[0026]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案的方法，其中所述不揮發(fā)性緩沖鹽包括但不限于:磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫銨、磷酸氫二銨、枸櫞酸鈉、枸櫞酸鉀、枸櫞酸二鈉、枸櫞酸二鉀、枸櫞酸三鈉、枸櫞酸三鉀、醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨、高氯酸鈉、高氯酸鉀及其組合。
[0027]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案的方法，其中所述目標(biāo)物是所述檢測(cè)物中的主要成分或者非主要成分(例如雜質(zhì))。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述主要成分或非主要成分是已知物質(zhì)或者是未知物質(zhì)。在化學(xué)分析領(lǐng)域，已知物質(zhì)或未知物質(zhì)在液相色譜中分離得到目標(biāo)物色譜峰或者洗脫餾份后，該目標(biāo)物接著進(jìn)入質(zhì)譜儀檢測(cè)，可以根據(jù)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果確定該目標(biāo)物化學(xué)結(jié)構(gòu)，從而可以對(duì)已知物質(zhì)作準(zhǔn)確確認(rèn)，或者對(duì)未知物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)/組成進(jìn)行分析。
[0028]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案的方法，其中將所述檢測(cè)物配制成溶液所用的溶劑是流動(dòng)相或者是選自下列的溶劑:水、甲醇、乙腈、乙醇及其組合。
[0029]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案的方法，其中所述助劑是無機(jī)硫酸鹽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述無機(jī)硫酸鹽選自硫酸鎂、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鈣、其無水物、其水合物、及其組合。
[0030]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案的方法，其中所述洗脫餾份與所述助劑在混合時(shí)以重量比1:0.01?100的比例混合，例如以重量比1:0.05?10的比例混合，例如以重量比1:0.1?5的比例混合，例如以重量比1:0.5?2的比例混合。二者重量比的調(diào)節(jié)是容易實(shí)現(xiàn)的，例如根據(jù)不揮發(fā)性緩沖鹽的降低程度適當(dāng)調(diào)整洗脫餾份與助劑的混合比例。
[0031]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案的方法，其中所述水相和有機(jī)相的體