用于指導血壓下降療法的腎上腺髓質(zhì)素的制作方法
【專利說明】用于指導血壓下降療法的腎上腺髓質(zhì)素
[0001] 本發(fā)明的主題為鑒定需要給予流體復蘇或血管加壓劑的對象的體外方法，包括以 下步驟：
[0002] ?確定所述對象的體液中proADM和/或其具有至少6個氨基酸的片段的水平
[0003] ?將所述水平與所述患者對流體復蘇或血管加壓劑給藥的需要相關(guān)聯(lián)，其中如果 所述對象的體液中proADM和/或其具有至少6個氨基酸的片段的水平大于閾值，則所述患 者被鑒定為具有這樣的需要。
[0004] Kitamura等（參見1 ;數(shù)值數(shù)據(jù)是基于參考文獻附錄）首次將腎上腺髓質(zhì)素（ADM) 肽描述為新的包含52個氨基酸的低壓肽，其從人嗜鉻細胞瘤分離而來。同年，編碼包含185 個氨基酸的前體肽的cDNA及該前體肽的完整氨基酸序列也被公開。該前體肽尤其在N端 包含21個氨基酸的信號序列，被稱為"腎上腺髓質(zhì)素原前體"（pre-proADM)。Pre-proADM 包含185個氨基酸。成熟ADM示出為SEQ ID No. 4,且ADM-Gly示出為SEQ No. 5。
[0005] 成熟腎上腺髓質(zhì)素（ADM)肽為包含52個氨基酸（SEQ ID No:4)的酰胺肽，它包 含pre-proADM的通過蛋白水解切割形成的氨基酸95-146。迄今為止，切割pre-proADM形 成的肽片段中的基本上僅少數(shù)片段得到較為精確的表征，特別是生理活性肽腎上腺髓質(zhì)素 (ADM)和"PAMP"，其為包含在pre-proADM中信號肽的21個氨基酸后的20個氨基酸（22-41) 的肽。對于ADM和PAMP，已發(fā)現(xiàn)了生理活性亞片段并進行了更為詳盡的研究。1993年對ADM 的發(fā)現(xiàn)和表征引發(fā)了廣泛的研究活動和大量的出版物，其結(jié)果最近被總結(jié)于多種綜述文章 中，在本說明書的上下文中，特別引用在致力于ADM的"肽"議題中發(fā)現(xiàn)的文章 （Peptides 22(2001))，尤其是（2)和（3)。另外的綜述為（4)。在迄今為止的科學研究中，尤其發(fā)現(xiàn) ADM可被認為是多功能調(diào)控肽。它被釋放至通過甘氨酸延伸的失活形式的循環(huán)中（5)。還 有結(jié)合蛋白（6)，其為ADM特異性的并且可能同樣地調(diào)節(jié)ADM的影響。
[0006] 在迄今為止的研究中首要的ADM以及PAMP的那些生理效應(yīng)為影響血壓的效應(yīng)。因 此，ADM是有效的血管擴張劑，可能可以將低壓效應(yīng)特別與是ADM的C端部分中的肽片段相 關(guān)聯(lián)。
[0007] 此外還發(fā)現(xiàn)從pre-proADM形成的上述另外的生理活性肽PAMP同樣顯示低壓效 應(yīng)，即使其看起來具有不同于ADM的作用機制（除了上述綜述文章（3)和（4)外，還參見
[7] 、⑶或（9)和（10))。
[0008] 此外還發(fā)現(xiàn)在循環(huán)和其他生物流體中能夠測量的ADM在許多病理狀態(tài)下的濃度， 顯著高于在健康對照人體中發(fā)現(xiàn)的濃度。因此，患有充血性心力衰竭、心肌梗死、腎病、高壓 病癥、糖尿病、休克急性期及敗血癥和敗血性休克的患者的ADM水平顯著增加，盡管程度不 同。在一些所述病理狀態(tài)下PAMP濃度也增加，但相對于ADM血漿水平降低（(3);第1702 頁）。
[0009] 此外還已知，異乎尋常的高濃度ADM可在敗血癥或敗血性休克中觀察到（參見（3) 和（11)、（12)、（13)、（14)和（15))。該發(fā)現(xiàn)與被認為是患有敗血癥和其他嚴重綜合征如 SIRS的患者的疾病進程的典型現(xiàn)象的典型的血液動力學變化有關(guān)。
[0010] 盡管假定ADM和PAMP由相同的前體肽pre-proADM形成，其中對應(yīng)于這些肽的氨 基酸序列作為等摩爾量的部分肽存在，生物流體中可測量的ADM或PAMP的濃度明顯不同。 這沒有什么異常。
[0011] 因此，完全相同的前體肽的不同降解產(chǎn)物的可測濃度可能不同，例如，因為它們?yōu)?不同競爭性降解途徑的結(jié)果，例如其在不同病理狀態(tài)情況下引起前體肽不同的片段化并因 此產(chǎn)生不同的降解產(chǎn)物。前體肽中包含的某些部分肽可形成為游離肽或者可能不形成，和/ 或不同的肽以不同的方式和不同的量形成。即使僅采用單一降解途徑來處理前體肽，并因 此所有降解產(chǎn)物來源于完全相同的前體肽且必然主要以等摩爾量自身形成，生物流體中可 測量的不同部分肽和片段的穩(wěn)態(tài)濃度可能截然不同，即例如，當其中的個別組分在各自的 生物流體中以不同的速率形成和/或具有不同的個別穩(wěn)定性（使用期）時，或者如果它們 基于不同的清除機制和/或以不同的清除率從循環(huán)中去除時。
[0012] 腎上腺髓質(zhì)素在敗血癥發(fā)展（(16)，（17))以及在眾多急性和慢性疾病 ((18)，（4))中起著關(guān)鍵作用。
[0013] 已描述了數(shù)種測量ADM的循環(huán)水平的方法：直接ADM或間接通過確定其同源前體 肽的更穩(wěn)定的片段。最近，公開了一種方法，其描述了用于測量循環(huán)中成熟ADM的測定法 (Di Somma S, Magrini L, Travaglino F, Lalle I, Fiotti N, Cervellin G, Avanzi GC, Lupia E, Maisel A, Hein F et al:Opinion paper on innovative approach of biomarkers for infectious diseases and sepsis management in the emergency department. Clinical chemistry and laboratory medicine:CCLM/FESCC 2013:1-9)。
[0014] 描述了定量來源于ADM前體的片段的其他方法，例如，測量 MR-proADM (Morgenthaler NG1Struck J1Alonso C1Bergmann A. Clin Chem. 2005 Oct； 51 (10):1823-9. )、PAMP(Washimine H, Kitamura Κ,Ichiki Υ,Yamamoto Υ,Kangawa Κ,Matsuo Η,Eto Τ. Biochem Biophys Res Commun.1994 Jul 29 ;202 (2):1081-7.)、 CT-proADM(EP211552)?？色@取用于測量 MR-proADM 的商業(yè)測定法（BRAHMS MR-proADM KRYPTOR ；BRAHMS GmbH, Hennigsdorf, Germany)(Clin Biochem. 2009 May ；42(7-8):725-8. doi:10.1016/j.clinbiochem. 2009. 01. 002. Epub2009 Jan 23)〇
[0015] 用于在完全自動化的系統(tǒng)B.R.A.H.M.S KRYPTOR上測量血漿中的中間區(qū)域腎上 腺髓質(zhì)素原的同質(zhì)時間分辨的焚光測定法（Caruhel P, Mazier C, Kunde J, Morgenthaler NG，Darbouret B.)。因為這些肽以化學計量比從相同的前體產(chǎn)生，其血漿水平在某一程度 上相互關(guān)聯(lián)。
[0016] 僅在一些研究中，測量了患有全身炎癥、敗血癥、嚴重敗血癥或敗血性休克的患者 的血漿ADM，并將這些水平與血液動力學參數(shù)相關(guān)聯(lián)。
[0017] 在Hirata等的研究中，發(fā)現(xiàn)敗血癥患者的血漿ADM與心率、右動脈壓而非平均 動脈壓（MAP)相關(guān)（Hirata Y，Mitaka C，Sato K，Nagura T，Tsunoda Y，Amaha K, Marumo F: Increased circulating adrenomedullin, a novel vasodilatory peptide, in sepsis. The Journal of clinical endocrinology and metabolism 1996, 81(4):1449-1453)〇
[0018] Nishio等報道ADM增加的血漿濃度與患有敗血癥休克的患者的血管緊張度的松 弛相關(guān)（與心臟指數(shù)、心搏容量指數(shù)、心率、舒張壓降低、全身血管阻力指數(shù)和肺血管阻力 指數(shù)相關(guān)），但與平均血壓無顯著相關(guān)性[19]。
[0019] 在健康的對象中，在運動下，發(fā)現(xiàn)了血漿ADM與MAP的顯著負相關(guān)[20]。
[0020] 關(guān)于在發(fā)生休克的患者中循環(huán)ADM或作為pro-ADM或其片段的相關(guān)肽的水平與對 流體復蘇和血管加壓劑的需要的關(guān)聯(lián)還一無所知。這是未被滿足的醫(yī)療需求，因為血管加 壓劑通常在非常晚，當患者的病況非常嚴重時給予。對在患者的病況非常嚴重之前鑒定需 要流體復蘇和血管加壓劑的那些患者的醫(yī)療需求還未被滿足。對早于通過應(yīng)用65mm Hg的 臨界值的血壓測量（如指導中所建議的[21])，預(yù)測對流體復蘇和血管加壓劑療法的需要 的醫(yī)療需求還未被滿足。如果血壓下降，這將引起氧供應(yīng)減少、器官功能障礙和死亡。因此， 對早期鑒定存在發(fā)生血壓下降風險的患者的需求還未被滿足。如果這樣的患者能夠盡早確 定，可以應(yīng)用平均動脈壓的其他例如較高臨界值來開始流體復蘇和血管加壓劑療法。較高 的閾值-水平為<70mm Hg，優(yōu)選<75mm Hg。這意味著治療在已大于65mmHg開始。
[0021] 本發(fā)明的主題為鑒定需要流體復蘇或給予血管加壓劑的對象的體外方法，包括以 下步驟：
[0022] ?確定所述對象的體液中proADM和/或其具有至少6個氨基酸的片段的水平
[0023] ?將所述水平與所述對象或患者對流體復蘇或給予血管加壓劑的需要相關(guān)聯(lián)，其 中如果所述對象的體液中proADM和/或其具有至少6個氨基酸的片段的水平大于閾值，則 所述對象或患者被鑒定為存在這樣的需要。
[0024] 在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個實施方案中，所述對象具有大于65mm Hg額平均動脈 壓。此外，所述對象可具有小于75mmg Hg的平均動脈壓，在另一實施方案中，平均動脈壓 <70mmg Hg〇
[0025] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述方法為早期鑒定流體復蘇或給予血管加壓劑的 方法，其中較早意味著早于通過應(yīng)用65mmg Hg的臨界值的血壓測量或在血壓降至65mmg Hg 之前。
[0026] -個特定的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的體液為血液樣本。血液樣本可選自全血、血 清和血漿。
[0027] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述proADM和/或其具有至少6個氨基酸的片段選 自：
[0028] SEQ ID No. I (proADM) : 164 個氨基酸（pr印roADM 的 22-185)
[0029]
[0030] SEQ ID No. 2 (腎上腺髓質(zhì)素原N-20末端肽）：肽22-41
[0031] ARLDVASEF RKKffNKffALS R
[0032] SEQ ID No. 3 (中間區(qū)腎上腺髓質(zhì)素原，MR-proADM):肽45-92
[0033] ELRMSS SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSP EDSSPDAARI RV
[0034] SEQ ID No. 4 (成熟腎上腺髓質(zhì)素（成熟ADM);酰胺化的）：肽95-146-C0NH2
[0035] YRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGY-C0NH2
[0036] SEQ ID No. 5(腎上腺髓質(zhì)素 l-52-Gly(ADM 1-52-Gly)):肽 95-147
[0037] YRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGYG
[0038] SEQ ID No. 6 (C 端腎上腺髓質(zhì)素原，CT-proADM):肽 148-185
[0039] RRR RRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL
[0040] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述proADM和/或其具有至少6個氨基酸的片段選 自：成熟 ADM(SEQ ID No. 4)和 / 或成熟 ADM l-52-Gly(SEQ ID No. 5)和 MR-proADM(SEQ ID No.3)和 CT-proADM(SEQ ID No. 6)。
[0041] 在本發(fā)明的具體實施方案中，確定了成熟ADM(SEQ ID No. 4)和/或成熟ADM l-52-Gly(SEQ ID No. 5)-免疫反應(yīng)性水平或者MR-proADM(SEQ ID No. 3)免疫反應(yīng)性水 平或CT-proADM (SEQ ID No. 6)免疫反應(yīng)性水平，并將所述水平與所述患者對流體復蘇或血 管加壓劑給藥的需要相關(guān)聯(lián)，其中如果所述對象的體液中成熟ADM(SEQ ID No. 4)和/或成 熟 ADM l-52-Gly(SEQ ID No. 5)-免疫反應(yīng)性水平或者 MR-proADM(SEQ ID No. 3)免疫反 應(yīng)性水平或CT-proADM (SEQ ID No. 6)免疫反應(yīng)性水平大于閾值，則所述患者被鑒定為具有 這樣的需要。
[0042] 在本發(fā)明的具體實施方案中，通過使用選自以下的至少一種結(jié)合劑來確定 pro-ADM和/或其片段的水平：與包含于以下序列中的區(qū)域結(jié)合的結(jié)合劑：成熟ADM(SEQ ID No. 4)和 / 或成熟 ADM 1-52-Gly (SEQ ID No. 5)，以及與包含于成熟 ADM (SEQ ID NO. 4)和 /或成熟ADM l-52-Gly(SEQ ID No. 5)的序列中的區(qū)域結(jié)合的第二結(jié)合劑。
[0043] 在本發(fā)明的具體實施方案中，通過使用選自以下的至少一種結(jié)合劑來確定 pro-ADM和/或其片段的水平：與包含于MR-proADM(SEQ ID No. 3)的序列中的區(qū)域結(jié)合的 結(jié)合劑，以及與包含于MR-proADM(SEQ ID No. 3)的序列中的區(qū)域結(jié)合的第二結(jié)合劑。
[0044] 在本發(fā)明的具體實施方案中，通過使用選自以下的至少一種結(jié)合劑來確定 pro-ADM和/或其片段的水平：與包含于CT-proADM(SEQ ID No. 6)的序列中的區(qū)域結(jié)合的 結(jié)合劑，以及與包含于CT-pro ADM(SEQ ID No.6)的序列中的區(qū)域結(jié)合的第二結(jié)合劑。
[0045] 在本發(fā)明的具體實施方案中，使用測定法來確定proADM和/或其具有至少6個氨 基酸的片段的水平，其中所述測定法的測定靈敏度能夠定量健康對象的ADM，并且<70pg/ ml，優(yōu)選 <40pg/ml，且更優(yōu)選〈10pg/ml。
[0046] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述結(jié)合劑顯示與proADM和/或其片段的至少 IO7M \優(yōu)選IO8M 1的結(jié)合親和力，優(yōu)選的親和力為大于10 9M \最優(yōu)選大于IOwM ^本領(lǐng)域 技術(shù)人員了解可以考慮通過施用較高劑量的化合物來補償較低的親和力，并且這一措施不 會超出本發(fā)明的范圍。
[0047] 為了確定抗體對腎上腺髓質(zhì)素的親和力，借助無標記的表面等離子體共振，使用 Biacore 2000 系統(tǒng)（GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Germany)來確定腎上腺髓質(zhì) 素與固定的抗體的結(jié)合動力學。使用以高密度與CM5傳感器表面共價結(jié)合的抗小鼠 Fe抗 體，根據(jù)廠商的指導（小鼠抗體捕獲試劑盒；GE Healthcare)，進行抗體的可逆固定（22)。<