專利名稱：腎上腺髓質(zhì)素(27-52)的固相合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于多肽的固相合成方法及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種腎上腺髓質(zhì)素 (27-52)的固相合成方法。
技術(shù)背景腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin ， ADM)是正常人體腎上腺內(nèi)的表達(dá)，其在骨組織 中也有高表達(dá)，并由成骨細(xì)胞分泌。腎上腺髓質(zhì)素經(jīng)過人們(Cornish J, CallonKE, Coy DH, Jiang NY, Xiao L， Cooper GJ, et al. Adrenomedullin is a potent stimulator of osteoblastic activity in vitro and in vivo. Am J Physiol 1997;273:E1113 - 20)研究發(fā)現(xiàn)，它與治療骨質(zhì) 疏松癥的藥物降鈣素基因的相關(guān)肽(calcitonin gene-related p印tide ， CGRP)間的 同源性為24%，應(yīng)屬于CGRP家族的成員；人的ADM是由52個(gè)氨基酸殘基組成，第16 和21位半胱氨酸殘基構(gòu)成了一個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這個(gè)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)對(duì)其生物活性 作用非常重要，但提示該環(huán)狀結(jié)構(gòu)不是促成骨細(xì)胞增殖所必需的，而促成骨細(xì)胞增殖 活性區(qū)最短是保存在如下的腎上腺髓質(zhì)素(27-52)的序列中HO-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro 一Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-H且去除此環(huán)狀結(jié)構(gòu)的肽鏈片段的腎上腺髓質(zhì)素(27-52)因失去了其對(duì)心血管系統(tǒng)、肺、 血小板、胃酸分泌等的影響，還可避免其作為成骨藥物時(shí)對(duì)人體其它系統(tǒng)產(chǎn)生的不良 作用 (Eguchi S， Hirata Y, Iwasaki H, Sato K, Watanabe TX, Inui T, et al. Structure - activity relationship of adrenomedullin, a novel vasodilatory peptide, in cultured rat vascular smooth muscle cells. Endocrinology 1994:135:2454 - 8; Cor"A/ J. Adrenomedullin—a regulator of bone formation. Regulatory P印tides [Regul P印t]， 2003 Apr 15; Vol. 112 (1-3), pp. 79-86)。 Cornish等(Cornish丄 Callon KE, Coy DH, Jiang NY, Xiao Cooper GJ， et al. Adrenomedullin is a potent stimulator of osteoblastic activity in vitro andin vivo. Am J Physiol 1997;273:E1113 - 20)還通過其在體外成骨細(xì)胞培養(yǎng)液的研 究，發(fā)現(xiàn)ADM(27-52)含量為0.1nmo1/ L時(shí)，就能刺激成骨細(xì)胞增殖。而現(xiàn)有的合成腎上腺髓質(zhì)素(27-52)的方法主要為Boc(叔丁氧羰基)多肽固相合成 法(Cornish丄 Callon KE, Coy DH, Jiang NY, Xiao L, Cooper GJ, et al. Adrenomedullin is a potent stimulator of osteoblastic activity in vitro and in vivo. Am J Physiol 1997;273:E1113 - 20)，雖然該方法所用的Boc保護(hù)氨基酸 價(jià)格較低，但是存在著如下不足1、 由于合成過程中需反復(fù)用酸脫除保護(hù)基，然后用氟化氫把肽段從樹脂上裂解下 來，因而反應(yīng)條件劇烈，不可避免地會(huì)引起副反應(yīng)，且使其中某些側(cè)鏈保護(hù)基不穩(wěn)定， 導(dǎo)致已延長(zhǎng)的肽鏈從固相支持物上的逐步損失，產(chǎn)率低，并使Asp(天門冬氨酸)丄ys(賴 氨酸)等氨基酸殘基的側(cè)鏈發(fā)生變化等。2、 由于副反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)生較多，增大了提純難度。3、 由于所使用氟化氫為強(qiáng)酸，腐蝕性強(qiáng)，不僅要縮短設(shè)備使用壽命，而且污染環(huán)境。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服已有技術(shù)存在的不足，提供一種新的腎上腺髓質(zhì)素(27-52)的 固相合成方法。本發(fā)明提供的新的腎上腺髓質(zhì)素(27-52)的固相合成方法，其特征在于首先將保護(hù) 氨基酸Fmoc-Ala-OH按照Fmoc (芴甲氧羰基)多肽固相合成的方法接到樹脂上，然后 繼續(xù)將余下的保護(hù)氨基酸依次逐個(gè)連接，再后用切肽試劑將合成的粗肽切下，最后將 粗肽分離提純即得目標(biāo)肽腎上腺髓質(zhì)素(27-52)。其中將保護(hù)氨基酸Fmoc-Ala-OH按照Fmoc多肽固相合成的方法接到樹脂上是先將 樹脂用溶劑在室溫下溶脹0.5 2h抽濾，然后將保護(hù)氨基酸Fmoc-Ala-0H、碳二亞氨類 縮合劑、縮合劑4-二甲氨基哌啶，按樹脂的摩爾倍數(shù)計(jì)為1.0~4.4: 1.0 4.4: 0. 1 1. 0的配比溶于以樹脂重量計(jì)為5 40mL/g溶劑中，并將其與樹脂一起在室溫下攪拌反 應(yīng)4 72h，用洗滌液洗滌，再后用脫保護(hù)液脫除Fmoc保護(hù)基后再次洗滌，最后抽干到 恒重或直接將購(gòu)得的Fmoc-Ala-樹脂先用溶劑在室溫下溶脹0. 5~2h抽濾，再用脫保護(hù) 液脫除Fraoc保護(hù)基后洗滌，最后抽干到恒重；
繼續(xù)將余下的保護(hù)氨基酸依次逐個(gè)連接是按ADM(27-52)的序列由C端向N端延伸， 且每個(gè)保護(hù)氨基酸的連接步驟是首先將抗消旋縮合劑、脲鎗或磷鎗類縮合劑、縮合劑 二異丙基乙胺和相應(yīng)的保護(hù)氨基酸殘基，按樹脂的摩爾倍數(shù)計(jì)為1.0 4.4:1.0 4. 4:1. 0 4. 4:1. 0 3. 0的配比加入到脫除了 Fmoc保護(hù)基的-Ala-樹脂中，并加入以樹 脂重量計(jì)為5 40mL/g溶劑，在室溫下縮合0.5 6h，然后用洗滌劑洗滌，再后用脫保 護(hù)液脫除Fmoc保護(hù)基并用洗滌劑洗滌，隨后重復(fù)進(jìn)行縮合一洗漆一脫保護(hù)一洗滌過程 直到第26個(gè)氨基酸連接完畢，所不同的是每一步循環(huán)連接的氨基酸所對(duì)應(yīng)的保護(hù)氨基 酸不同，每個(gè)對(duì)應(yīng)的保護(hù)氨基酸均可直接購(gòu)得，其中所用保護(hù)氨基酸的摩爾倍數(shù)優(yōu)選 1.5 2. 5;用切肽試劑將合成的粗肽切下是先將用三氟乙酸-苯甲硫醚-二巰基乙醇-苯甲醇 按體積比為80 97:1 10:1 5:1 5配制的切肽試劑，以樹脂重量計(jì)為8 60ml/g加 入，并在冰水浴下攪拌反應(yīng)l 12h后過濾，然后用三氟乙酸按樹脂重量計(jì)用2 8ml/g 洗樹脂2 5次，洗液并入濾液中進(jìn)行蒸發(fā)濃縮，再加入沉淀劑沉淀，分離，殘留物冷 凍干燥得粗肽。至于將粗肽分離提純即得目標(biāo)肽腎上腺髓質(zhì)素(27-52)是先將粗肽用濃度為1~ 6mmol/L溶劑如重蒸水、50%醋酸或鹽酸溶液溶解，經(jīng)濾膜過濾后，用C-18柱和洗脫劑 0.1%三氟乙酸水溶液和0. 1%三氟乙酸-乙腈溶液梯度洗脫后得到目的肽。上述方法中所用樹脂為對(duì)羥甲基苯氧甲基聚苯乙烯樹脂或?qū)?烷氧基苯甲醇樹脂； 所用溶劑為二氯甲烷或N-甲基吡咯烷酮；所用碳二亞氨類縮合劑為二環(huán)已基碳二亞胺 或二異丙基碳二亞胺；所用洗滌液為N-甲基吡咯垸酮、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、甲 醇中的至少一種；所用脫保護(hù)液為體積比20%或50%的吡啶與二甲基甲酰胺混合液；所用抗消旋縮合劑為1-羥基苯并三氮唑；所用脲鎗或磷総類縮合劑為1-羥基-苯并-三氮唑四甲基六氟磷酸鹽或卜氧-3-雙二甲胺羰基苯駢三氮唑四氟化硼鹽;所用沉淀劑為冰乙醚。本發(fā)明與已有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)1、由于本發(fā)明是采用Fmoc (芴甲氧羰基)多肽固相合成方法來合成腎上腺髓質(zhì)素 (27-52)，其中使用的ci-氨基的保護(hù)基是Fmoc， Fmoc不僅對(duì)酸穩(wěn)定，而且易與堿作用， 本發(fā)明選用了堿性化合物(吡啶與二甲基甲酰胺)作脫保護(hù)劑，因而使其反應(yīng)條件溫和、 副反應(yīng)少、產(chǎn)率髙，同時(shí)，F(xiàn)moc基團(tuán)還有特征性紫外吸收，易于監(jiān)測(cè)控制反應(yīng)的進(jìn)行。2、 由于本發(fā)明在第一肽Fmoc-Ala-0H接樹脂時(shí)采用了碳二亞氨類縮合劑/4-二甲 氨基哌啶為縮合催化劑，因而使其反應(yīng)速率快、產(chǎn)率高、副反應(yīng)少。3、 由于本發(fā)明在接肽過程中采用了抗消旋縮合劑、脲総或磷絲類縮合劑、縮合劑 二異丙基乙胺作為縮合催化劑進(jìn)行接肽反應(yīng)，因而不僅使其結(jié)合率高、反應(yīng)時(shí)間短、 副產(chǎn)物少，而且還可減少消旋。4、 由于本發(fā)明在第一肽Fmoc-Ala-0H接樹脂時(shí)反應(yīng)體系未采用二甲基甲酰胺做溶 劑，因而避免了其對(duì)羥基樹脂與Fraoc氨基酸的成酯反應(yīng)產(chǎn)生的抑制，提高了縮合率。5、 由于本發(fā)明副反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)生較少，因而提純更容易。6、 由于本發(fā)明沒有采用氟化氫作為切肽試劑，因而避免了其對(duì)設(shè)備腐蝕和對(duì)環(huán)境 的污染。
具體實(shí)施方式
下面給出實(shí)施例以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，有必要在此指出的是以下實(shí)施例只用 于對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員根據(jù)上述本發(fā)明內(nèi)容對(duì)本發(fā)明所作出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明 的保護(hù)范圍。 實(shí)施例1本實(shí)施例為第一肽接樹脂。稱取0.25mmo1 (234mg)對(duì)-烷氧基苯甲醇樹脂置于固相反應(yīng)器中，用二氯甲烷浸 泡2h后抽濾，然后將l咖ol Fmoc-Ala-0H， lmmol 二環(huán)已基碳二亞胺，0.1 mmol 4-二 甲氨基哌啶溶于6mL的N-甲基吡咯烷酮中，加入固相反應(yīng)器與對(duì)-垸氧基苯甲醇樹脂一 起在室溫下反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后，用二氯甲烷每次3ml洗滌5次，再后加入4ml 20% 哌啶/二甲基甲酰胺混合溶液，搖動(dòng)反應(yīng)0.5h，抽濾,再用N-甲基吡咯烷酮每次2ml洗 滌5次、二氯甲垸每次2ml洗滌5次以及甲醇每次3ml洗滌5次，并重復(fù)上述洗滌一 脫保護(hù)一洗滌兩次，最后將反應(yīng)物抽干到恒重。實(shí)施例2本實(shí)施例為第二肽的合成。首先向有上步反應(yīng)所獲樹脂的固相反應(yīng)器中加入按樹脂的摩爾倍數(shù)計(jì)為1:1:1配
制的l-羥基苯并三氮唑、l-羥基-苯并-三氮唑四甲基六氟磷酸鹽、二異丙基乙胺的縮合試劑2 mL (濃度0.45 mo1/ L)和0. 5mmolFmoc-His (Trt)-0H，并加入6ml N-甲基 吡咯烷酮，在室溫下縮合2h，然后用用二氯甲院每次3ml洗滌5次，再后加入4ml 20% 哌啶/二甲基甲酰胺混合溶液，搖動(dòng)反應(yīng)0.5h，抽濾，再用N-甲基吡咯烷酮每次2ml 洗滌5次、二氯甲垸每次2ml洗滌5次以及甲醇每次3ml洗滌5次，并重復(fù)上述洗滌 一脫保護(hù)一洗滌兩次，最后將反應(yīng)物抽干到恒重。 實(shí)施例3 26這部分實(shí)施例是在實(shí)施例2的基礎(chǔ)上繼續(xù)合成第三肽 第二十六肽的實(shí)施例。由于這些實(shí)施例除加入的保護(hù)氨基酸不同外，其合成流程和控制條件因與實(shí)施例2 完全相同，故略去不述。值得說明的是其加入的保護(hù)氨基酸均為0.5mmo1，且加入的保 護(hù)氨基酸依次為Fmoc-Gln(Trt)-0H;Fmoc-Ile-0H;Fmoc-Tyr(tBu)-0H;Fmoc-Gln(Trt)-0H;Fmoc-Phe-0H;Fmoc-Thr(tBu)-0H;Fmoc-Asp(0tBu)-0H;Fmoc-Lys-(Boc)-0H;Fraoc-Asp(0tBu)-OH;Fmoc-Lys-(Boc)-OH;Fmoc-Asp(0tBu)-OH;Fraoc-Asn(Trt)-OH;Fmoc-Val-0H;Fmoc-Ala-OH;Fmoc-Pro-OH;Fmoc-Arg(Pbf)-OH;Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Lys-(Boc)-OH; Fmoc-lie-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; 實(shí)施例27本實(shí)施例為從樹脂上切肽，以獲得粗肽。首先取按體積比為90:5:3:2配制的三氟乙酸-苯甲硫醚-二巰基乙醇-苯甲醇切肽 試劑10ml加入到已合成的樹脂肽中，然后放入冰水浴下攪拌反應(yīng)lh后過濾，再將過 濾后的樹脂用1.5ml三氟乙酸洗3次，洗液并入濾液，放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行蒸發(fā)濃 縮，在濃縮液中加入20ral冰乙醚，析出白色粉末狀物體，分離沉淀物，再用冰乙醚如 此操作3次,將沉淀物冷凍干燥得粗肽60mg。實(shí)施例28本實(shí)施例為粗肽提純，以獲得目的肽。首先將所獲粗肽溶于40ml重蒸水，然后用0.5um膜過濾，將濾液放入Waters髙 效液相色譜儀中，通過C18柱(6mmX150mm,粒徑5ym，孔徑30nm)用洗脫液A: 0.1% 三氟乙酸水溶液，洗脫液B: 0. 1%三氟乙酸/乙腈溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度30XB 50%B，洗脫時(shí)間15min，流速為lmL/min。純化后獲多肽凍干粉42mg。
權(quán)利要求
1、腎上腺髓質(zhì)素(27-52)的固相合成方法，其特征在于首先將保護(hù)氨基酸Fmoc-Ala-OH按照Fmoc多肽固相合成的方法接到樹脂上，然后繼續(xù)將余下的保護(hù)氨基酸依次逐個(gè)連接，再后用切肽試劑將合成的粗肽切下，最后將粗肽分離提純即得目標(biāo)肽腎上腺髓質(zhì)素(27-52)。
2、 按照權(quán)利要求1所述的腎上腺髓質(zhì)素(27-52)的周相合成方法，其特征在于 將保護(hù)氨基酸Fmoc-Ala-OH按照Fmoc多肽固相合成的方法接到樹脂上是先將樹脂用溶劑在室溫下溶脹O. 5 2h抽濾，然后將保護(hù)氨基酸Fmoc-Ala-0H、碳二亞氨類縮合 劑、縮合劑4-二甲氨基哌啶，按樹脂的摩爾倍數(shù)計(jì)為1.0 4.4: 1.0 4.4: 0. 1~1.0 的配比溶于以樹脂重量計(jì)為5 40mL/g溶劑中，并將其與樹脂一起在室溫下攪拌反應(yīng) 0.5 12h，用洗滌液洗滌，再后用脫保護(hù)液脫除Fmoc保護(hù)基后再次洗滌，最后抽干到 恒重或直接將購(gòu)得的Fmoc-Ala-樹脂先用溶劑在室溫下溶脹0. 5 2h抽濾，再用脫保護(hù) 液脫除Fmoc保護(hù)基后洗滌，最后抽干到恒重；繼續(xù)將余下的保護(hù)氨基酸依次逐個(gè)連接是按ADM(27-52)的序列由C端向N端延伸， 且每個(gè)保護(hù)氨基酸的連接步驟是首先將抗消旋縮合劑、脲鎗或磷鎗類縮合劑、縮合劑 二異丙基乙胺和相應(yīng)的保護(hù)氨基酸殘基，按樹脂的摩爾倍數(shù)計(jì)為1.0 4.4:1.0 4. 4:1. 0 4. 4:1. 0 3. 0的配比加入到脫除了 Fmoc保護(hù)基的-Ala-樹脂中，并加入以樹 脂重量計(jì)為5 40mL/g溶劑，在室溫下縮合0.5 6h，然后用洗滌劑洗滌，再后用脫保 護(hù)液脫除Fmoc保護(hù)基并用洗滌劑洗滌，隨后重復(fù)進(jìn)行縮合一洗滌一脫保護(hù)一洗滌過程 直到第26個(gè)氨基酸連接完畢；用切肽試劑將合成的粗肽切下是先將用三氟乙酸-苯甲硫醚-二巰基乙醇-苯甲醇 按體積比為80 97:1 10:1 5:1 5配制的切肽試劑，以樹脂重量計(jì)為8 60ml/g加 入，并在冰水浴下攪拌反應(yīng)l 12h后過濾，然后用三氟乙酸按樹脂重量計(jì)用2~8ml/g 洗樹脂2 5次，洗液并入濾液中進(jìn)行蒸發(fā)濃縮，再加入沉淀劑沉淀，分離，殘留物冷 凍干燥得粗肽。
3、 按照權(quán)利要求2所述的腎上腺髓質(zhì)素(27-52)的固相合成方法，其特征在于所 用保護(hù)氨基酸的摩爾倍數(shù)為1. 5 2. 5。
4、 按照權(quán)利要求2或3所述的腎上腺髓質(zhì)素(27-52)的固相合成方法，其特征在于所用樹脂為對(duì)羥甲基苯氧甲基聚苯乙烯樹脂或?qū)?烷氧基苯甲醇樹脂；所用溶劑為二 氯甲烷或N-甲基吡咯烷酮；所用碳二亞氨類縮合劑為二環(huán)已基碳二亞胺或二異丙基碳 二亞胺；所用洗漆液為N-甲基吡咯垸酮、二氯甲垸、二甲基甲酰胺、甲醇中的至少一 種；所用脫保護(hù)液為體積比20%或50%的吡啶與二甲基甲酰胺混合液。
5、 按照權(quán)利要求2或3所述的腎上腺髓質(zhì)素(27-52)的固相合成方法，其特征在 于所用抗消旋縮合劑為1-羥基苯并三氮唑；所用脲総或磷鎗類縮合劑為1-羥基-苯并-三氮唑四甲基六氟磷酸鹽或1-氧-3-雙二甲胺羰基苯駢三氮唑四氟化硼鹽。
6、 按照權(quán)利要求4所述的腎上腺髓質(zhì)素(27-52)的固相合成方法，其特征在于所 用抗消旋縮合劑為1-羥基苯并三氮唑；所用脲鎗或磷鎗類縮合劑為1-羥基-苯并-三氮 唑四甲基六氟磷酸鹽或1-氧-3-雙二甲胺羰基苯駢三氮唑四氟化硼鹽。
7、 按照權(quán)利要求2或3所述的腎上腺髓質(zhì)素(27-52)的固相合成方法，其特征在 于所用沉淀劑為冰乙醚。
8、 按照權(quán)利要求6所述的腎上腺髓質(zhì)素(27-52)的固相合成方法，其特征在于所 用沉淀劑為冰乙醚。
全文摘要
本發(fā)明公開的腎上腺髓質(zhì)素(27-52)的固相合成方法，其特征在于首先將保護(hù)氨基酸Fmoc-Ala-OH按照Fmoc多肽固相合成的方法接到樹脂上，然后繼續(xù)將余下的保護(hù)氨基酸依次逐個(gè)連接，再后用切肽試劑將合成的粗肽切下，最后將粗肽分離提純即得目標(biāo)肽腎上腺髓質(zhì)素(27-52)。本發(fā)明反應(yīng)條件溫和、速率快、副反應(yīng)少、提純更容易，產(chǎn)率高，且由于沒有采用氟化氫作為切肽試劑，還避免了對(duì)設(shè)備的腐蝕和對(duì)環(huán)境的污染。
文檔編號(hào)C07K14/575GK101165067SQ20061002206
公開日2008年4月23日 申請(qǐng)日期2006年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月19日
發(fā)明者暉 張, 王怡鑫, 裴福興, 陳治宇 申請(qǐng)人:四川大學(xué)華西醫(yī)院