在37°C下融合30s。洗滌后，將細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中。通過在HAT培養(yǎng)基[RPMI 1640培養(yǎng)基，補充有20%胎牛血清和HAT-補充物]中生長來選擇雜交克隆。2周后，將HAT 培養(yǎng)基用HT培養(yǎng)基替換3代，然后回復至正常細胞培養(yǎng)基。
[0149] 融合后3周初步篩選細胞培養(yǎng)上清液的抗原特異性IgG抗體。將測試陽性的微量 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至24孔板用于繁殖。在重新測試后，將選擇的培養(yǎng)物克隆，并使用有限稀釋技 術(shù)再克隆，以及確定同種型。
[0150] (Lane, R. D. "A short-duration polyethylene glycol fusiontechnique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas'，，J. Immunol. Meth.81:223-228 ; (1985) ,Ziegler, B.et al. "Glutamate decarboxylase(GAD) is not detectable on the surface of rat islet cells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediated cytotoxicity of monoclonal GAD antibodies"，Horm. Metab. Res. 28:11-15，（1996)) 〇
[0151] 表1 :
[01521
[0153] 單克隆抗體制備
[0154] 通過標準抗體制備方法（Marx et al.，Monoclonal antibody Production, ATLA 25, 121，1997)制備抗體，并通過蛋白A純化?；赟DS凝膠電泳分析的抗體純度為>95%。
[0155] 親和常數(shù)
[0156] 為了確定抗體對腎上腺髓質(zhì)素的親和力，通過無標記的表面等離子體共振的方 式，使用 Biacore 2000 系統(tǒng)（GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Germany)確定腎 上腺髓質(zhì)素與固定的抗體結(jié)合的動力學。根據(jù)廠商的指導（小鼠抗體捕獲試劑盒；GE Healthcare)，使用以高密度與CM5傳感器表面共價結(jié)合的抗小鼠 Fc抗體，進行抗體的可逆 固定。
[0157] 標記程序（示蹤物）：將100 μ g (100 μ 1)的抗體（lmg/ml于PBS中，pH 7. 4)與 10 μ 1卩丫啶NHS-酯（lmg/ml于乙腈中，InVent GmbH, Germany)混合（57)，并在室溫下孵育 20min。通過在Bio-Sil? SEC 400-5(Bi〇-Rad Laboratories, Inc. ,USA)上進行凝膠過濾 HPLC來純化標記的CT-Η。將純化的經(jīng)標記的抗體稀釋于（300mmol/L磷酸鉀，100mmol/L NaCl, lOmmol/L Na-EDTA, 5g/L 牛血清白蛋白，pH 7. 0)中。終濃度為每 200 μ L 約 800. 000 相對光單位（RLU)的經(jīng)標記的化合物（約20ng經(jīng)標記的抗體）。通過使用AutoLumat LB 953 (Berthold Technologies GmbH&Co. KG)來測量卩丫啶酯化學發(fā)光。
[0158] 固相：用抗體（（1. 5 μ g 抗體 /0· 3mL 100mmol/L NaCl, 50mmol/L TRIS/ HCl，pH7. 8)包被聚苯乙稀管（Greiner Bio-One International AG, Austria) (18h，室溫 下）。在用5%牛血清白蛋白封閉后，用PBS，pH 7.4洗滌管子并真空干燥。
[0159] 校準物：使用 pH為7.8 的 50mM Tris/HCl，250mM NaCl，0.2%Triton Χ-100,0·5% BSA, 20tab/L蛋白酶complete蛋白酶抑制劑混合物片（Roche AG)線性稀釋合成的人 ADM(Bachem, Switzerland)。使用前將校準物儲存于_20°C。
[0160] 實施例2
[0161] 確定產(chǎn)生高信噪比的抗體組合
[0162] ADM免疫測定：
[0163] 將50 μ 1樣本（或校準物）吸取至包被的管中，在添加標記的二抗（200 μ 1)后， 將管在室溫下孵育2h。通過用洗滌溶液（20mM PBS，pH 7.4,0. l%Triton Χ-100)洗滌5 次（每次lml)去除未結(jié)合的示蹤物。
[0164] 通過使用LB 953測量與管結(jié)合的化學發(fā)光
[0165] 將所有抗體在夾心式免疫測定中用作包被管和標記的抗體，并在以下變型中組合 (表 2):
[0166] 按在hADM-免疫測定下描述的進行孵育。結(jié)果以特異性信號（以lOng/ml ADM)/ 背景（無 ADM的樣本）信號的比給出。
[0167] 表 2 :
[0168]
[0169] 令人吃驚地，我們發(fā)現(xiàn)MR-ADM與CT-ADM的組合為最高信噪比組合。
[0170] 隨后，我們將該抗體組合用于進一步研究。我們使用MR-ADM作為固相抗體并使用 CT-ADM作為標記的抗體。典型的劑量/信號曲線示出于圖1中。測定的分析靈敏度（10次 運行，無 ADM的樣本的平均值+2SD)為2pg ADM/ml。
[0171] 實施例3
[0172] 人腎上腺髓質(zhì)素的穩(wěn)定性：
[0173] 將人ADM溶于人檸檬酸鹽血漿（η = 5,終濃度IOng ADM/ml)中，并在24°C下孵 育。在選定的時間點，將等分試樣冷凍于_20°C。在解凍樣本后，立即通過使用上述的hADM 免疫測定法定量hADM。
[0174] 表3顯示了人血漿中的hADM在24°C下的穩(wěn)定性。
[0175]
[0176] 令人吃驚地，在夾心式免疫測定法中使用抗體組合MR-ADM和CT-ADM，分析物的分 析前穩(wěn)定性較高（僅〇. 9%/h的平均免疫反應(yīng)性丟失）。相比之下，使用其他測定方法，報 道了僅22min的血漿半衰期（Hinson 2000)。因為醫(yī)院日常工作中從取樣至分析的時間小 于2h，使用的ADM檢測方法適合常規(guī)診斷。值得注意的是，不需要向樣本添加任何非常規(guī)添 加物（如抑肽酶，（20))來實現(xiàn)可接受的ADM-免疫反應(yīng)穩(wěn)定性。
[0177] 實施例4
[0178] 校準物制備物的重復性。
[0179] 我們發(fā)現(xiàn)制備用于ADM測定的校準物的結(jié)果的高變異性（平均CV 8. 5%，參見表 4)。這可能是由于hADM對塑料和玻璃表面的高吸附導致的（還參見（58)。通過添加洗滌 劑（高達1 % Triton X 100或1 % Tween 20)、蛋白（高達5% BSA)和高離子強度（高達 IM NaCl)或以上物質(zhì)的組合，僅輕微降低這一效應(yīng)。令人吃驚地，如果將剩余的抗ADM抗體 (10 μ g/ml)添加至校準物稀釋緩沖液，ADM測定校準物-制備物的回收和重復性大幅提高 至〈1 %的制備物間CV(表4)。
[0180] 幸運地，N端抗體的存在不影響通過MR和C端抗體（圖1)組合產(chǎn)生的ADM-信號。
[0181] 表4:
[0182]
[0183] 校準物的制備物間變異。
[0184] 按上文所述制備有或無10 μ g/ml的NT-ADM-抗體的ADM測定校準物。從5次獨 立的制備過程給出變異系數(shù)。使用上述ADM測定法來測量校準物。s/n-r=信噪比。
[0185] 對于所有下述研究，我們基于在示蹤物緩沖液中補充的10 μ g/ml的NT-ADM抗體 和10 μ g/ml的NT-ADM抗體存在下制備的校準物使用了 ADM測定法。
[0186] 實施例5
[0187] 靈敏度
[0188] 測定靈敏度的目標是完全覆蓋健康對象的ADM濃度。
[0189] 健康對象中的ADM濃度：
[0190] 使用ADM測定法測量健康對象（η = 100,平均年齡56歲）。中位數(shù)為24. 7pg/ ml，最低值為llpg/ml，且第99百分位數(shù)為43pg/ml。因為測定靈敏度為2pg/ml，使用描述 的ADM測定法，100%的所有健康對象都是可檢測的。
[0191] 使用商業(yè)測定法測量 MR-proADM (BRAHMS MR-proADM KRYPTOR) (BRAHMS GmbH, Hennigsdorf, Germany) (ClinBiochem. 2009May ；42 (7-8):725-8.doi:10. 1016/ j.clinbiochem. 2009. 01. 002. Epub 2009Jan 23〇
[0192] 在完全自動化的系統(tǒng) B. R. A. H. M. S KRYPTOR. Caruhel P, Mazier C, Kunde J, Morgenthaler NG, Darbouret B)上的均質(zhì)時間分辨焚光免疫測定用于測量血衆(zhòng)中的中 間區(qū)腎上腺髓質(zhì)素原。
[0193] 實施例6
[0194] 臨床研究
[0195] 滿足敗血癥定義（Dellinger RP, Levy MM, Carlet JM, Bion J, Parker MM, Jaeschke R, Reinhart K, Angus DC, Brun-Buisson C,Beale R et al:Surviving Sepsis Campaign:international guidelines for management of severe sepsis and septic shock: 2008. Critical care medicine 2008, 36 (I) :296-327)的 101 名 ED 患者隨后入院治 療（平均住院5天），并接受標準的護理治療。從第1天（ED就診）起生成EDTA-血漿，且 在住院期間每天一份樣本。用于隨后的ADM-測量的樣本冷凍時間為少于4h。
[0196] 患者特征概述于表5中
[0197] 表 5:
[0198]

[0200] 全部患者的26. 7%在住院期間死亡并計算為治療非響應(yīng)者，全部患者的73. 3% 從敗血癥中存活并計算為治療響應(yīng)者。
[0201] 66%的出現(xiàn)敗血癥的所有患者具有非正常ADM值>43pg/ml (第99百分位數(shù)），指 示ADM并非感染的標志物。
[0202] 臨床研究結(jié)果
[0203] 初始ADM具有高預后價值。
[0204] 我們將初始ADM值與院內(nèi)死亡率相關(guān)聯(lián)，并將ADM與APACHE 2評分比較。ADM對 敗血癥結(jié)果具有高預后價值（參見圖2)，且與APACHE 2評分相當。如果組合ADM和APACHE 2產(chǎn)生明顯增加的信息（圖3)。
[0205] 治療監(jiān)測中的ADM。
[0206] 基于標準護理療法治療患者（表5)。平均住院時間為5天。院內(nèi)每天測量ADM(第 1天=入院），并將其與院內(nèi)死亡率相關(guān)聯(lián)（表6)。住院期間ADM發(fā)生變化，并且在第5天 期間的變化將預后值提高了 52%，從初始的Chi2的19. 2增加至29. 2。
[0207] 對于以ADM濃度>70pg/ml開始的患者，使用70pg/ml的ADM的簡單臨界值模型顯 示68 %的死亡風險，并且整個住院期間保持>70pg/ml (治療非響應(yīng)者）。在所有時間具有 ADM值<70pg/ml或從>70pg/ml進展為<70pg/ml的患者具有僅11 %的死亡率（良好治療的 /治療響應(yīng)者），以及出現(xiàn)ADM值>70pg/ml且在住院治療期間其ADM濃度降至值<70pg/ml 的患者具有〇%的死亡率。在院內(nèi)治療期間沒有患者從<70pg/ml發(fā)展至>70pg/ml。產(chǎn)生 所有患者的響應(yīng)者/非響應(yīng)者信息所需的平均時間為約1天。住院期間響應(yīng)治療的>70pg/ ml-患者需要約2天來指示通過ADM的治療成功。
[0208] 表 6
[0209]
[0210] 血漿ADM與平均動脈壓（MAP)的關(guān)系及對血管加壓劑療法的需要
[0211] 我們發(fā)現(xiàn)了 ADM濃度與平均動脈壓（圖4)及對用于治療/預防休克的血管加壓 劑療法的需要的顯著相關(guān)性（圖5)。
[0212] 我們還研究了 ADM濃度及對血管加壓劑療法的需要的時態(tài)關(guān)系（圖6):在研究的 101名患者中，已有18名在入院時需要血管加壓劑療法；這些患者入院時的中值A(chǔ)DM濃度 為129pg/mL。在其入院后前4天的住院期間從不需要血管加壓劑療法的患者（η = 79)，具 有48. 5pg/mL的中值A(chǔ)DM濃度。重要的是，在其入院后的住院期間需要血管加壓劑療法的 患者入院時已具有升高的ADM水平（中值87. 2pg/mL)，例如：血漿ADM濃度的升高早于血 管加壓劑治療。
[0213] 在血漿樣本中，還測量了 MR-proADM-ADM前體分子的穩(wěn)定片段。MR-proADM已 被提議為成熟ADM釋放的替代標志物（Struck J, Tao C, Morgenthaler NG, Bergmann A: Identification of an Adrenomedullin precursor fragment in plasma of sepsis patients. Peptides 2004,25 (8):1369-1372, Morgenthaler NG1Struck J1Alonso C, Bergmann A!Measurement of midregional proadrenomedulI in in plasma with an immunoluminometric assay. Clinical chemistry 2005,51 (10):1823-1829)〇 根據(jù)廠 商（BRAHMS GmbH,Hennigsdorf, Germany)的說明書使用商業(yè)MR-proADM測定（BRAHMS MR-proADM KRYPT0R)。不需要血管加壓劑療法的患者入院當天的中值水平為0. 63nmol/L， 需要血管加壓劑療法的患者為I. 57nmol/L。MR-proADM的濃度與ADM濃度顯著相關(guān)（r = 0. 79)〇
[0214] 實施例7
[0215] 診斷和預測對血管加壓劑需要的臨界值分析。
[0216] 患者數(shù)據(jù)參見實施例6?；跀⊙Y患者急診單元就診期間采集的抽取首份血液 抽取進行分析。
[0217] 選擇70pg/ml的臨界值，<70pg/ml指示低風險的血管加壓劑需要，且>70pg/ml指 示高風險的血管加壓劑需要。第1組為不需要血管加壓劑（MAP〈 = 66mmHg)或者在就診 時或在4天隨后期間未接受血管加壓劑的患者。第2組為具有血管加壓劑需要（MAP〈= 66mmHg)或在就診時接受了血管加壓劑的患者。第3組為無血管加壓劑需要或者在就診時 未接受血管加壓劑但在4天隨后期間發(fā)展出血管加壓劑需要的患者。排除丟失了關(guān)于血管 加壓劑治療的信息的患者（η = 2)。