一種缺血修飾白蛋白比色法檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及臨床體外檢測試劑技術領域，特別涉及一種缺血修飾白蛋白比色法檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]近年來研究發(fā)現(xiàn)，缺血修飾白蛋白(IMA)是美國食品藥品管理局Food and DrugAdministrat1n, FDA)批準的，具備理想心肌標志物特征的早期心肌缺血生化檢測標志物。傳統(tǒng)的心肌損傷標志物均是在心肌壞死4-6 h血中濃度才升高，而IMA在心肌缺血發(fā)作后5-10min血中濃度就開始升高，缺血停止后能持續(xù)2_4h，12h后可恢復正常，具有敏感、特異、早期、穩(wěn)定、快速、經濟、容易分析等特點，可以在急性冠狀動脈綜合征(AcuteCoronarysyndromes, ACS)早期可逆階段時檢出，是更為理想的早期心肌缺血生化檢測標志物，為臨床早期診斷心肌損傷和排除診斷ACS及其危險程度的分級提供科學的依據(jù)。
[0003]血清中正常人的血清白蛋白(Human Serum Alubumin, HSA)是以活性形式存在的，當加入氯化鈷后，Co2+與具有正常結合能力的HSA的N-末端結合，致使溶液中游離的Co2+濃度降低，而心肌缺血患者的HSA轉化成了缺血修飾白蛋白(Ischemia ModifiedAlbumin, IMA)。此時，IMA與外源性Co2+結合能力就會大大地下降，當向血清中加入同樣濃度的氯化鈷后，Co2+與正常的HSA充分結合以后，溶液中仍會有大量的游離Co'沒有結合的Co2+就會與接下來加入的二巰蘇糖醇(1，4-dith1threitol, DTT)發(fā)生反應顯色，顯色愈強，表明沒結合的Co2+就越多，IMA濃度也就越高，即IMA水平與反應顯色的強度是呈正相關的，用分光光度法檢測它的吸光度，就可以推算出血清中IMA的濃度。該試劑盒，就是利用剩余的Co2+與DTT反應生成紅褐色的產物，在波長500nm下比色，其吸光度與Co2+濃度成正比，通過對比標準品，即可計算出樣本中IMA的含量。

【發(fā)明內容】

[0004]針對于現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明提供了一種缺血修飾白蛋白比色法檢測試劑盒，該試劑盒與常規(guī)的試劑盒相比，穩(wěn)定性和線性范圍比常規(guī)的檢測試劑盒要好，分析靈敏度高，有利于試劑在臨床上的推廣應用。
[0005]本發(fā)明是通過以下措施實現(xiàn)的:
一種缺血修飾白蛋白比色法檢測試劑盒，其特征在于，它包含試劑R1、試劑R2和校準品，其中試劑Rl組成為:18.16mmol/LpH7.6Tris緩沖液、15mmol/L氯化鈷、30ml/LTritonX 100、7.7mmol/L 疊氮鈉；試劑 R2 組成為:18.16mmol/LpH7.6Tris 緩沖液、10mmol/LDTT、26mmol/L 硫脈、7.7mmol/L 疊氣納。
[0006]所述試劑Rl和試劑R2在使用時的比例為Rl:R2=200:100。
[0007]本發(fā)明所使用的校準品為北京九強生物技術有限公司生產的IMA校準品。
[0008]本發(fā)明的試劑盒在具有雙試劑功能的自動生化分析儀上進行，其具體使用方法如圖7所示，加入生理鹽水、樣本或校準品30 μ I,之后再加入Rl試劑200 μ I預孵育5min后讀取吸光度Al，之后再加入100 μ I的試劑R2反應5min后，讀取吸光度A2，并計算ΔΑ。
[0009]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明提供的缺血修飾白蛋白比色法檢測試劑盒，通過在試劑Rl中加入了 30ml/LTritonX 100，降低了血清中的蛋白對實驗準確度的影響。在試劑R2中加入Cu2+掩蔽劑硫脲，大大降低了 Cu2+對Co2+的干擾，從而提高了試劑的分析靈敏度。
【附圖說明】
[0010]圖1實施例2準確度驗證實驗檢測結果與對照組檢測結果相關性；
圖2實施例3準確度驗證實驗檢測結果與對照組檢測結果相關性；
圖3實施例4準確度驗證實驗檢測結果與對照組檢測結果相關性；
圖4實施例1-4線性相關驗證實驗檢測結果圖5穩(wěn)定性驗證實驗檢測結果；
圖6分析靈敏度實驗結果；
圖7本發(fā)明的試劑盒在具有雙試劑功能的自動生化分析儀上的使用方法。
【具體實施方式】
[0011]為了更好的理解本發(fā)明，下面結合具體實施例來進一步詳細說明。
[0012]實施例1
一種缺血修飾白蛋白比色法檢測試劑盒，它包括試劑R1、試劑R2、校準品。
[0013]其中試劑Rl組成為:
pH 7.6 Tris 緩沖液18.16 mmol/L
氯化鈷15mmol/L
疊氮鈉7.7 mmol/L
試劑R2組成為:
Tris 緩沖液 pH 7.618.16 mmol/L
DTT10 mmol/L
疊氮鈉7.7 mmol/L
本實施例描述的試劑盒，在使用時，其測定方法是采用具有雙試劑功能的日立7180自動分析儀，操作如下:
加入生理鹽水、樣本或校準品30 μ I,之后再加入Rl試劑200 μ I預孵育5min后讀取吸光度Al，之后再加入100 μ I的試劑R2反應5min后，讀取吸光度A2，并計算Δ A0
[0014]本實施例所使用的校準品為北京九強生物技術有限公司生產的IMA校準品。
[0015]實施例2
一種缺血修飾白蛋白比色法檢測試劑盒，它包括試劑R1、試劑R2、校準品。
[0016]其中試劑Rl組成為:
pH 7.6 Tris 緩沖液18.16 mmol/L
氯化鈷15mmol/L
TritonXlOO20ml/L
疊氮鈉7.7 mmol/L 試劑R2組成為:
Tris 緩沖液 ρΗ7.618.16 mmol/L
DTT10 mmol/L
硫脲15mmol/L
疊氮鈉7.7 mmol/L 具體測定方法同實施例1。
[0017]實施例3
一種缺血修飾白蛋白比色法檢測試劑盒，它包括試劑R1、試劑R2、校準品。
[0018]其中試劑Rl組成為:
pH 7.6 Tris 緩沖液18.16 mmol/L
氯化鈷15mmol/L
TritonXlOO25ml/L
疊氮鈉7.7 mmol/L 試劑R2組成為:
Tris 緩沖液 pH 7.618.16 mmol/L
DTT10 mmol/L
硫脲20mmol/L
疊氮鈉7.7 mmol/L 具體測定方法同實施例1。
[0019]實施例4
一種缺血修飾白蛋白比色法檢測試劑盒，它包括試劑R1、試劑R2、校準品。
[0020]其中試劑Rl組成為:
pH 7.6 Tris 緩沖液18.16 mmol/L
氯化鈷15mmol/L
TritonXlOO30ml/L
疊氮鈉7.7 mmol/L 試劑R2組成為:
Tris 緩沖液 pH 7.618.16 mmol/L
DTT10 mmol/L
硫脲26mmol/L
疊氮鈉7.7 mmol/L 具體測定方法同實施例1。
[0021]對上述實施例1-4中制得的試劑盒分析性能進行實驗驗證。
[0022]準確度驗證實驗:
將實施例2、3、4的試劑盒作為實驗組，市場上獲得認可的一種準確度優(yōu)異的缺血修飾白蛋白比色法檢測試劑盒(深圳某公司生產)作為對照組進行對比實驗，對40個樣本進行檢測，檢測的結果如圖1-圖3。
[0023]通過圖1-圖3的檢測數(shù)據(jù)可知，實施例2、3、4檢測試劑盒與對照檢測試劑盒的檢測結果相關性分別為0.9950,0.9977,0.9991，相關性比較好，表明本發(fā)明的試劑盒與市場上獲得認可的具有優(yōu)異準確度的缺血修飾白蛋白比色法檢測試劑盒有高度一致性，證明本發(fā)明試劑盒添加的其他各種成分對其準確性不會造成影響，試劑盒依然保持較好的準確度。
[0024]線性相關性驗證實驗:
找到缺血修飾白蛋白高值樣本為180U/mL，用生理鹽水進行系列稀釋，配制6個不同濃度的樣本，依次為180U/mL、144U/mL、108U/mL、72U/mL、36U/mL、0U/mL濃度的樣本，每個濃度水平各樣本分別測定三次，分別取其平均值。分別利用實施例1、2、3、4的試劑進行檢測。檢測結果如圖4所示。
[0025]圖4檢測結果顯示，實施例1-4檢測結果相關性均大于0.990,但實施例2、3、4的檢測結果大于0.998，與實施例1相比具有更好的線性相關性，這說明本發(fā)明試劑具有更好的線性相關性。
[0026]穩(wěn)定性驗證實驗:
在2°C _8°C、無腐蝕性氣體的避光環(huán)境中貯存試劑，檢測四種實施例試劑的穩(wěn)定性。四種試劑每月選取同一樣本測定其吸光度三次，取平均值，與新鮮的實施例1試劑檢測結果進行對比，從而確定試劑的穩(wěn)定時間。檢測數(shù)據(jù)如圖5。
[0027]實驗結果顯示，實施例1試劑在2°C _8°C、無腐蝕性氣體的避光環(huán)境中貯存15個月穩(wěn)定，而實施例2、3、4試劑在2°C _8°C、無腐蝕性氣體的避光環(huán)境中貯存24個月穩(wěn)定，說明在試劑中加入TritonX 100和硫脲二者共同作用有效的提高了缺血修飾白蛋白比色法檢測試劑盒的穩(wěn)定性。
[0028]分析靈敏度驗證實驗:
用本發(fā)明缺血修飾白蛋白比色法檢測試劑盒測試已知濃度在50.3U/mL的樣本，記錄吸光度差值。分別利用實施例1、2、3、4的試劑進行檢測。檢測結果如圖6所示。
[0029]通過檢測數(shù)據(jù)可知，實施例2、3、4檢測試劑盒的吸光度差值均比實施例1的高，說明在試劑中加入TritonX 100和硫脲能增強試劑的分析靈敏度
綜合以上分析，本發(fā)明提供的缺血修飾白蛋白比色法檢測試劑盒，在試劑Rl中通過加入一定量的TritonX 100和在試劑R2中加入一定量的硫脲能夠有效的提高試劑盒的穩(wěn)定性和分析靈敏度，線性范圍較好，試劑的準確度也較好。因此，本發(fā)明提供的缺血修飾白蛋白比色法檢測試劑盒有利于在市場中進一步的推廣使用。
【主權項】
1.一種缺血修飾白蛋白比色法檢測試劑盒，其特征在于，它包含試劑R1、試劑R2和校準品，其中試劑Rl組成為:18.16mmol/LpH7.6Tris緩沖液、15mmol/L氯化鈷、30ml/LTritonX 100、7.7mmol/L 疊氮鈉；試劑 R2 組成為:18.16mmol/LpH7.6Tris 緩沖液、10mmol/LDTT、26mmol/L 硫脈、7.7mmol/L 疊氣納。2.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑Rl和試劑R2在使用時的比例為 Rl:R2=200:100o
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種缺血修飾白蛋白比色法檢測試劑盒,屬于臨床體外檢測試劑技術領域。本發(fā)明試劑盒包括試劑R1、試劑R2、校準品。通過在試劑R1中加入一定量的Triton×100和在試劑R2中加入一定量的硫脲,有效的提高了試劑盒的穩(wěn)定性和分析靈敏度,其線性范圍也較好,試劑的準確度高,有利于在市場中進一步的推廣使用。
【IPC分類】G01N21/78
【公開號】CN105181692
【申請?zhí)枴緾N201510640339
【發(fā)明人】謝清華, 李艷梅, 甘宜梧, 譚柏清, 李靜, 包興艷
【申請人】山東博科生物產業(yè)有限公司
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年9月30日