基于金屬離子特異響應(yīng)的熒光檢測法在免疫檢測中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，設(shè)及基于金屬離子特異性響應(yīng)的 巧光檢測方法在免疫檢測中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 本發(fā)明是利用各種金屬離子巧光分子對金屬離子的特異性響應(yīng)W及巧光分子與 金屬離子容易發(fā)生特異性反應(yīng)從而引起自身巧光強度發(fā)生變化，并將運種變化應(yīng)用于免疫 檢測的技術(shù)。由于不同濃度的金屬離子引起巧光強度的變化是不同的，因此，用巧光光譜儀 對相關(guān)巧光強度進行測量可實現(xiàn)免疫檢測中的定量檢測。
[0003] 巧光分子，因其具有最高可達單分子檢測的高靈敏度，對亞微粒也具有可視的亞 納米空間分辨能力和亞毫秒時間分辨能力，所W在原位檢測（巧光成像技術(shù)）W及利用光纖 進行遠距離檢測等方面具有眾多優(yōu)勢，已經(jīng)發(fā)展成為一項重要的檢測技術(shù)。在免疫檢測方 面，人們將免疫反應(yīng)的特異性與巧光物質(zhì)的敏感性、直觀性相結(jié)合開發(fā)出了一種新的免疫 檢測技術(shù)一-免疫巧光技術(shù)（IFA)。目前，在免疫巧光技術(shù)中常用的巧光標記物有：有機染 料、半導(dǎo)體量子點陣及稀±離子配合物。相比較半導(dǎo)體量子點陣及稀±離子配合物，有機染 料具有制作簡單、原料來源豐富、價格低的優(yōu)點。但是，傳統(tǒng)有機染料的分子由于具有對光 不穩(wěn)定、背景巧光干擾強W及與生物分子的連接缺少共性等不足使其在應(yīng)用上受到很大限 制。
[0004] 金屬納米粒子因為能夠共價結(jié)合抗原和抗體，已被應(yīng)用于抗原抗體的特異性檢 測，運方面最典型的就是膠體金免疫檢測技術(shù)。運一檢測技術(shù)主要是利用納米金的紅色，通 過抗體與納米金結(jié)合(金標抗體)，當抗原濃度較高時，金標抗體濃度也比較高，聚集產(chǎn)生紅 色：表示是陽性反應(yīng)。由于運一檢測技術(shù)本身顯色機理的原因，其靈敏度較低，不適合用于 檢測低濃度的待測物，因此在應(yīng)用上受到較大限制。而其他金屬納米粒子，如銀納米粒子、 氧化銅納米粒子等在免疫檢測中也一直沒有得到應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于彌補傳統(tǒng)免疫檢測技術(shù)中的不足，將金屬離子巧光檢測方法與 金屬納米標記免疫技術(shù)相結(jié)合，采用金屬納米作為信號放大系統(tǒng)，利用磁珠作為抗原和抗 體的載體，提供一種基于金屬離子特異響應(yīng)的巧光檢測法在免疫檢測中應(yīng)用的技術(shù)，它能 實現(xiàn)對測樣品的快速分離，具有操作簡便、檢測快速、準確性好、檢測成本低、靈敏度高的優(yōu) 點，可在免疫分析檢測及臨床研究中發(fā)揮重要作用。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了W下技術(shù)方案。
[0007] -種基于金屬離子特異響應(yīng)的巧光檢測法在免疫檢測中的應(yīng)用。
[0008] 進一步，所述巧光檢測法為利用金屬離子促使巧光分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使所述巧 光分子產(chǎn)生一個從無到有的巧光變化，所述巧光變化的強度能通過巧光光譜儀直接判斷和 測量。
[0009] 進一步，所述巧光分子含有金屬納米顆粒，所述金屬納米顆粒能通過化學(xué)反應(yīng)產(chǎn) 生金屬離子，所述金屬離子與免疫檢測中的反應(yīng)物結(jié)合在一起能引起金屬離子巧光強度發(fā) 生變化，且不同濃度金屬離子引起的巧光強度的變化程度是不同的，用巧光光譜儀對巧光 強度的變化進行測量便能實現(xiàn)對待測樣品的定量檢測。
[0010] 進一步，在基于金屬離子特異響應(yīng)的巧光檢測中采用磁珠作為抗原、抗體的載體。
[0011] 進一步，所述磁珠采用活化試劑進行活化，經(jīng)活化后的磁珠能與抗原、抗體相結(jié) 合，進而實現(xiàn)對抗原和抗體的負載。
[0012] 進一步，所述活化試劑為采用戊二醒或者水溶性的碳二亞胺縮合劑。
[0013] 本發(fā)明的積極效果是： (1)將傳統(tǒng)的金屬離子巧光檢測方法與金屬納米標記免疫技術(shù)相結(jié)合并應(yīng)用于免疫檢 測中，不僅解決了傳統(tǒng)巧光分子與生物蛋白分子連接困難的問題，實現(xiàn)了對檢測信號的有 效放大，而且避免了傳統(tǒng)免疫試驗中酶的使用，解決了酶催化反應(yīng)對實驗條件要求苛刻而 產(chǎn)生的問題。
[0014] (2)采用磁珠作為抗原、抗體的載體，實現(xiàn)了對待測樣品的快速分離，使檢測過程 更簡便快速，使檢測的準確性、靈敏度都有很大的提高。
[0015] (3)利用化學(xué)反應(yīng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的酶催化過程并將所述巧光檢測方法引入生物免疫檢 巧。，縮短了反應(yīng)時間，提高了體系的穩(wěn)定性，降低了檢測成本，可在免疫分析檢測及臨床研 究中發(fā)揮重要作用。
【附圖說明】
[0016] 附圖1為采用酶標板作為抗原、抗體的載體，基于銀離子特異響應(yīng)的巧光檢測法 在免疫檢測中的應(yīng)用的流程圖。
[0017] 附圖2為采用磁珠作為抗原、抗體的載體，基于銀離子特異響應(yīng)的巧光檢測法在 免疫檢測中的應(yīng)用的流程圖。
[0018] 圖中的標號分別為： 101、酶標板； 102、磁珠； 2、包被抗體； 3、抗原； 4、標記抗體； 5、銀納米顆粒； 6、銀離子巧光分子。
【具體實施方式】
[0019] W下結(jié)合附圖繼續(xù)介紹本發(fā)明基于金屬離子特異響應(yīng)的巧光檢測法在免疫檢測 中的應(yīng)用的【具體實施方式】。提供4個實施例。應(yīng)當指出，本發(fā)明的實施不限于W下所述的 實施方式。
[0020] 實施例1 采用酶標板作為抗原、抗體的載體，基于銀離子特異響應(yīng)的巧光檢測法在甲胎蛋白 (AFP)檢測中的應(yīng)用（參見圖1 )，應(yīng)用中，酶標板101可采用96孔酶標板、48孔酶標板或384 孔酶標板等不同孔數(shù)的酶標板，所述酶標板均包含可拆與不可拆兩種型號，酶標板的顏色 包含黑色、白色W及無色透明色。所用包被抗體2為單克隆AFP抗體；所用抗原3采用AFP 抗原；所用銀標抗體為用銀納米顆粒5標記的多克隆AFP標記抗體4 ;所用金屬離子巧光分 子檢測液為含有銀離子巧光分子6的巧光檢測液。
[0021] 首先，將包被抗體2吸附在酶標板101上。
[0022] 然后，將包被抗體2修飾的酶標板101與抗原3結(jié)合，并進一步與由標記抗體4與 銀納米顆粒5相連接而得到的銀標抗體相連接。
[0023] 第三通過銀納米顆粒5與抗原3的對應(yīng)關(guān)系，越多的抗原3能結(jié)合更多的銀納米 顆粒5,可通過銀納米顆粒5實現(xiàn)對抗原3的標記及信號的放大。
[0024] 最后，向標記好銀納米顆粒5的酶標板101中加入銀離子巧光檢測液(銀離子巧光 分子6)，通過測試銀離子巧光檢測液的巧光強度能定量出體系中銀納米顆粒5的多少，實 現(xiàn)對抗原3的檢測。
[0025] 其具體操作步驟如下(結(jié)合圖1進行說明）： (1)采用酶標板101作為抗原、抗體的載體（內(nèi)容同上)。
[0026] (2)制備銀離子巧光檢測液 ①采用化合物A作為銀離子巧光分子；所述化合物A的結(jié)構(gòu)式為：
式中Et=乙基。
[0027] 所述化合物A自身處于一種巧光關(guān)閉的狀態(tài)，沒有巧光；但是，當有銀離子存在 時，銀離子會與化合物A發(fā)生反應(yīng)，致使化合物A的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而轉(zhuǎn)換成化合物B;化合 物B自身卻有著很強的巧光，從而能實現(xiàn)一個巧光從無到有的變化：
式中Et=乙基。
[002引②銀離子巧光檢測液的配置 將銀離子巧光分子6溶于乙醇與水的混合溶劑中（含20%乙醇)，構(gòu)成混合溶劑并使銀 離子巧光分子6的最終濃度保持在1~20iiM;向混合溶劑中分別加入雙氧水與憐酸的水 溶液，保持溶液中雙氧水和憐酸的最終濃度分別為10~lOOmM和1~20iiM;超聲，使各成 分混合均勻；然后置于4°C條件下保存?zhèn)溆谩?br>[0029] ③對制得的銀離子巧光檢測液的測試 取100yL銀離子巧光分子溶液注入10yL的20~50yM硝酸銀溶液，反應(yīng)lOmin后， 用530~560nm可見光激發(fā)，可觀察到明顯的巧光產(chǎn)生，采用巧光分光光度儀測試，在585nm 處有強的巧光，即認為該銀離子巧光檢測液對銀粒子有靈敏的響應(yīng)，可應(yīng)用于免疫檢測。
[0030] (3 )制備銀標抗體 ①將銀納米顆粒5與抗體結(jié)合，選擇直徑為5nm~200nm的銀納米顆粒5 :取lOmL的 1~20nM銀納米顆粒5溶液加入1~5yL5mg?血1的AFP多克隆抗體，將混合好的溶液 置于搖床上混合12~2地。（注：當銀納米顆粒5直徑大于200皿時，加入雙氧水，銀離子 的溶出速度會比較緩慢，需要超過化，而且銀離子很難完全溶出；當銀納米顆粒5直徑小于 5nm時，銀納米顆粒5完全溶出所產(chǎn)生的銀離子數(shù)小于1〇3,不足W達到所需的放大效果)。
[0031] ②向得到的銀標抗體溶液中加入200yL1~5%牛血清白蛋白（BSA)對銀納米顆 粒5表面沒有結(jié)合甲胎蛋白多克隆抗體的部分進行封閉，25°C搖床上混合12h，后置于4°C 條件下保存?zhèn)溆谩?br>[0032] ③對制得的銀標抗體的測試 I、經(jīng)紫外可見吸收光譜表征，證明獲得的是銀標抗體。
[0033]II、經(jīng)抗體活性測試，證明銀標抗體保持了原有的抗體活性。
[0034] III、結(jié)論：制備的銀標抗體可用于免疫檢測。
[0035] 注：W上各步驟可一并做，也可W分開做，是為進行巧光檢測的前序部分或者準備 部分。
[0036] (4)W甲胎蛋白（AFP)為例進行免疫檢測 ①將AFP的單克隆包被抗體2溶于抑=9. 6的碳酸鹽緩沖液中（4yg?mL1)，在酶標板 101的每個孔中加入100yL的上述溶液，4°C條件下過夜。
[0037] ②用憐酸鹽吐溫緩沖液（PBST)清洗步驟①的酶標板101S至五次，加入100~ 400yL1%的牛血清白蛋白（BSA)封閉。
[0038] ③用憐酸鹽吐溫緩沖液（PBST)清洗步驟②的酶標板101S至五次，加入不同濃度 的甲胎蛋白（AFP)，在37°C條件下解育1~化。
[0039] ④用憐酸鹽吐溫緩沖液（PBST)清洗步驟③的酶標板101S至五次，加入100~ 200yL步驟（3)制備的銀標抗體，在37°C條件下解育1~化。
[0040] ⑥用憐酸鹽吐溫緩沖液（PBST)清洗步驟④的酶標板101S至五次，加入100yL步 驟（2)制備的銀離子分子溶液，反應(yīng)30min后，通過巧光光譜進行定量檢測。
[0041] 檢測實施例1中巧光強度的表征意義(檢測原理） (1)當甲胎蛋白濃度較高時，結(jié)合相應(yīng)量的銀標抗體，加入雙氧水腐蝕后產(chǎn)生較高濃度 的銀離子，從而會促使較多的銀離子巧光分子發(fā)生反應(yīng)，檢測液會產(chǎn)生較強的巧光。
[0042] (2)當甲胎蛋白濃度較低或者濃度為0時，產(chǎn)生的銀離子濃度響應(yīng)較低或者不產(chǎn) 生銀離子，從而只有較少量的銀離子分子發(fā)生反應(yīng)或者沒有銀離子分子發(fā)生反應(yīng)，銀離子 巧光檢測液的巧光強度也相對較弱或者是沒有巧光。
[0043] (3)本發(fā)明能利用銀標抗體在對甲胎蛋白（AFP)的檢測中實現(xiàn)用巧光法檢測甲胎 蛋白。但是，采用實施例1的方法容易產(chǎn)生較強的背景巧光干擾，從而影響檢測的靈敏性