專利名稱：一種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鋅離子的分子熒光開關(guān)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及高選擇性檢測(cè)鋅離子，尤其涉及一 種可用于活細(xì)胞中鋅離子測(cè)定的分子熒光開關(guān)。
背景技術(shù)：
分子熒光開關(guān)檢測(cè)金屬離子相對(duì)于其他檢測(cè)手段優(yōu)點(diǎn)有可以實(shí)現(xiàn)對(duì)于單個(gè)離 子的高檢測(cè)靈敏性；鋅離子最外層3(^48°電子構(gòu)型，通常使用許多常規(guī)的分析手段如紫 外-可見光譜、Mtossbauer譜、核磁共振譜(NMR)、順磁共振譜(EPR)等都得不到合適的光譜 信號(hào)或者磁信號(hào)。但使用熒光分子探針檢測(cè)鋅離子和銅離子具有快速響應(yīng)、高靈敏度、低檢 測(cè)閾值和易于操作等特點(diǎn)，是非常行之有效的方法。鋅是人體必需的重要微量元素，鋅能提高人體免疫功能，并能達(dá)到抗衰老的作用； 鋅可加速創(chuàng)傷愈合，刺激性機(jī)能；微量鋅可強(qiáng)化記憶力，延緩腦的衰老；鋅能保護(hù)心肌免遭 異丙腎素導(dǎo)致的心肌損害；鋅與利尿劑合用能加強(qiáng)降壓作用，有利于控制高血壓、冠心病的 發(fā)生。對(duì)生長發(fā)育中的嬰兒、兒童和青少年具有更重要的營養(yǎng)價(jià)值。鋅是人體內(nèi)200多種 酶和蛋白質(zhì)的重要組成成分，也是許多酶的催化劑，廣泛參與了生命活動(dòng)的各個(gè)方面。其中 最重要的含鋅的酶和蛋白質(zhì)有DNA聚合酶、RNA聚合酶、蛋白轉(zhuǎn)錄因子、堿性磷酸酶、味覺蛋 白、消化酶等。鋅是這些重要生命大分子的活性結(jié)構(gòu)成分。DNA聚合酶是DNA復(fù)制的關(guān)鍵 物質(zhì)之一，缺乏鋅元素時(shí)DNA聚合酶數(shù)量減少，活性降低，導(dǎo)致DNA復(fù)制速率減慢，結(jié)果使細(xì) 胞的分裂速度降低甚至停滯。鋅缺乏還使RNA聚合酶的數(shù)量與質(zhì)量降低，直接影響基因的 表達(dá)，從而使上述含鋅蛋白質(zhì)和酶的合成受到阻礙。所以說鋅直接參與核酸蛋白質(zhì)的合成、 細(xì)胞的分化和增殖以及許多代謝，人體內(nèi)還有一些酶需要鋅的激活，而發(fā)揮其活性作用。因 此，采用熒光分子探針的方法檢測(cè)鋅離子，尤其是跟蹤其化學(xué)反應(yīng)及其在生命中的作用過 程就變成一件非常有意義的事情。中國專利01805747. 0 “鋅熒光探針”及中國專利200410019339. 2 “稀土 -過渡混
和金屬配合物型鋅離子熒光探針”報(bào)道的鋅離子熒光探針制備相對(duì)復(fù)雜。而且相應(yīng)的熒光 探針分子在生物檢測(cè)方面的應(yīng)用未見報(bào)道。為此，在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)性能更優(yōu)、合成更 易和生產(chǎn)成本更低的新型熒光分子探針則具有非常重要的使用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一提供一種具有良好的選擇性、能檢測(cè)鋅離子的熒光探針；目的之 二是提供該熒光探針在生物檢測(cè)鋅離子中的應(yīng)用。本發(fā)明熒光探針分子具有以下結(jié)構(gòu)通式 通式中R1代表烷基，R2代表烷基、羥基。在上述通式的熒光分子探針中，烷基是具有1-20個(gè)碳原子的直鏈或異構(gòu)烷基，如 甲基、乙基、正丙基、異丙基等短鏈烷基。在上述通式中酰胺保護(hù)的萘啶希夫堿芳基衍生物 具有多個(gè)配位原子，可以識(shí)別特定半徑及電子結(jié)構(gòu)的金屬離子。熒光基團(tuán)的光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn) 移受控于識(shí)別基團(tuán)。烷基和羥基的引入有助于改善探針分子在不同極性的溶劑中的溶解 性，芳基的引入有助于調(diào)節(jié)熒光探針分子的共軛長度從而通過改變激發(fā)態(tài)電子云分布調(diào)節(jié) 探針發(fā)光在可見光區(qū)和發(fā)光顏色。本發(fā)明熒光探針通過如下路徑合成 從


中可以看出，在多種的金屬離子中，該類熒光探針只對(duì)鋅離子表現(xiàn)出 良好的選擇性，對(duì)其他金屬具有抗干擾性。因此，該類熒光探針可以應(yīng)用于金屬離子檢測(cè)， 特別是在生物組織中鋅離子的檢測(cè)。本發(fā)明設(shè)計(jì)、合成的生物熒光分子探針具有結(jié)構(gòu)相對(duì)簡單、易于合成等特點(diǎn)。并且 在細(xì)胞中的識(shí)別效果良好，可實(shí)現(xiàn)生物細(xì)胞或組織的實(shí)時(shí)熒光成像、在有干擾離子存在的 情況下實(shí)現(xiàn)痕量鋅離子熒光檢測(cè)。在鋅離子的濃度最小為0. 68% g · L—1時(shí)，1分鐘以內(nèi)熒 光強(qiáng)度可以增強(qiáng)到探針分子起始強(qiáng)度的九倍以上。

圖1為本發(fā)明熒光探針分子(濃度為5. OX 10_5M)乙醇溶液對(duì)于Zn2+的熒光光譜 響應(yīng)圖。在圖1中，橫坐標(biāo)為熒光發(fā)射波長(nm)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度；圖中箭頭表示鋅離子 濃度增加，直至探針分子濃度的12倍為止。圖2為本發(fā)明熒光探針分子(濃度為5. OX I(T5M)乙醇溶液對(duì)Zn2+紫外-可見吸 收光譜圖。在圖2中，橫坐標(biāo)為吸收波長(nm)，縱坐標(biāo)為吸收強(qiáng)度；圖中箭頭表示鋅離子濃 度增加，直至探針分子濃度的12倍為止。圖3為本發(fā)明熒光探針分子(濃度為5. OX I(T5M)乙醇溶液對(duì)于不同的金屬離子 的熒光響應(yīng)圖。圖中橫坐標(biāo)為熒光發(fā)射波長(nm)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為370nm。
41為Zn2+的熒光光譜響應(yīng)曲線；2為其它金屬離子Cu2+、Ca2+、Co2+、Cr3+、Fe2+、Hg2+、K+、Mg2+、 Mn2+、Na+、Ni2+熒光光譜響應(yīng)曲線。圖4為本發(fā)明熒光探針分子(濃度為5. OX I(T5M)乙醇溶液對(duì)于不同的金屬離子 (數(shù)字 1 到 13 分別對(duì)應(yīng)于無金屬離子、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Co2+、Cr3+、Fe2+、Hg2+、K+、Mg2+、Mn2+、 Na\Ni2+)及熒光探針分子與鋅離子識(shí)別后加入高濃度干擾離子(加入量為鋅離子的10倍， 數(shù)字從 14 到 23 干擾離子分別是 Na+、Mg2+、K+、Ca2+、Cu2+、Fe2+、Mn2+、Co2+、Cr3+ 和 Ni2+)的最大 熒光強(qiáng)度變化?？v坐標(biāo)為1/%。I表示加入金屬離子在505nm處的熒光強(qiáng)度，Itl表示未加 入金屬離子在505nm處的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為370nm。圖5、圖6和圖7為37°C時(shí)使用激光共聚焦顯微鏡拍攝的在人體MCF-7活細(xì)胞內(nèi) 探針分子對(duì)鋅離子識(shí)別的情況。圖5是加入10 μ M探針分子細(xì)胞照片，圖6是加入探針分 子后的細(xì)胞再引入鋅離子后的熒光照片，圖7是拍攝熒光照片時(shí)的明場(chǎng)像。
具體實(shí)施例方式為對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更好的說明，舉實(shí)施例如下實(shí)施例1本發(fā)明熒光探針的制備在配有球形冷凝管的IOOml的單口圓底燒瓶中，加入等當(dāng)量的對(duì)羥基苯胺和4-甲 基-7-乙酰氨基-1，8-萘啶醛，使之充分溶解在甲醇中。密封體系，氬氣做為保護(hù)氣，除氣。 回流5h，反應(yīng)結(jié)束。旋蒸，粗產(chǎn)物用硅膠層析(200 300目)分離純化，二氯甲烷作洗脫 劑，得產(chǎn)物，黃色固體。然后在甲醇中重結(jié)晶。熒光探針的基本數(shù)據(jù)1H-NMR δΗ(400ΜΗζ ；DMSO ；Me4Si) 11. 06 (s, 1H, -0H) ,9. 75 (s, 1H, NH)，8. 64 (m，1H， naph)，8. 52(m,1H, naph)，8. 37 (m,1H, naph)，8. 02(s,1H, CH = N)，7. 36(d,2H, phenyl)， 7. 06(d，2H，phenyl) ,2. 70(s，3H，CH3), 2. 18(s，3H，COCH3). 13C-NMR δ c(100MHz, DMSO) 170. 65，157. 49，154. 95，146. 94，141. 65，136. 52，123. 72，120. 92，117. 90，116. 35，115. 29， 24. 66，18. 36.4-甲基-7-乙酰氨基-1，8-萘啶醛的合成參見文獻(xiàn)Ζ. Χ. Li，W. F. Fu, Μ. Μ. Yu， Χ. J. Zhao, Y.Chen Dyes and Pigments 2007，75，516-520.。實(shí)施例2本發(fā)明熒光探針的應(yīng)用配制5. 0 X ICT5M的熒光探針乙醇溶液，和各種金屬離子1. 0 X ICT2M的乙醇溶液，取 兩毫升上述配制的探針溶液于比色皿中，逐漸往比色皿中加入鋅離子溶液，用熒光光譜儀 檢測(cè)鋅離子的加入對(duì)探針的熒光光譜性質(zhì)的影響。其它金屬離子對(duì)探針的熒光光譜的影響 測(cè)試和鋅離子的類似。其它金屬離子對(duì)鋅離子熒光探針的干擾性研究和鋅離子的類似。結(jié)合附圖，光譜分析表明，本發(fā)明熒光探針分子對(duì)于鋅離子具有很高的選擇性，熒 光探針分子的低濃度溶液加入鋅離子后熒光顯著增強(qiáng)，強(qiáng)度可以達(dá)到原來熒光強(qiáng)度的15 倍，顏色發(fā)生改變，該選擇性不受鉀、鈣、鈉、鎂離子的影響。該熒光探針可以在活細(xì)胞內(nèi)完 成對(duì)鋅離子的熒光檢測(cè)。在鋅離子的濃度最小為0. 68% g · L—1時(shí)，1分鐘以內(nèi)熒光強(qiáng)度可 以增強(qiáng)到探針分子起始強(qiáng)度的九倍以上。該類熒光探針結(jié)構(gòu)簡單，合成方法簡單且效率高，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
權(quán)利要求
一種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鋅離子的分子熒光開關(guān)，其特征在于，熒光探針分子具有以下結(jié)構(gòu)通式通式中R1代表C1 20烷基；R2代表C1 20烷基或羥基。FSA00000134585400011.tif
2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鋅離子的分子熒光開關(guān)，其特征在于，烷基優(yōu)選甲 基、乙基、正丙基或異丙基。
3.如權(quán)利要求1或2所述的分子熒光開關(guān)在檢測(cè)生物細(xì)胞內(nèi)金屬離子中的應(yīng)用，其特 征在于，將其應(yīng)用于鋅離子檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鋅離子的分子熒光開關(guān)及其應(yīng)用，屬于生物分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。該熒光探針分子具有以下結(jié)構(gòu)通式通式中R1代表烷基，R2代表烷基、羥基。該熒光分子探針具有結(jié)構(gòu)相對(duì)簡單、易于合成等特點(diǎn)?？蓱?yīng)用于金屬離子檢測(cè)，特別是在生物組織中鋅離子的檢測(cè)。在細(xì)胞中的識(shí)別效果良好，可實(shí)現(xiàn)生物細(xì)胞或組織的實(shí)時(shí)熒光成像、在有干擾離子存在的情況下實(shí)現(xiàn)痕量鋅離子熒光檢測(cè)，具有較好的應(yīng)用開發(fā)前景。
文檔編號(hào)C07D471/04GK101914375SQ20101018180
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月25日
發(fā)明者于明明, 劉金霞, 張利鋒, 李占先, 虞明, 魏柳荷 申請(qǐng)人:鄭州大學(xué)