一種檢測微生物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及食品安全檢測領(lǐng)域，具體地，涉及一種檢測微生物(特別是有害微生物)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]食品安全是重大民生問題。食源性微生物致病菌有效的監(jiān)測對于首都食品質(zhì)量控制和監(jiān)管尤為重要。針對食品中的病原微生物(如細(xì)菌、真菌和病毒等)以及其他有害生物(如寄生蟲)，傳統(tǒng)的檢測方法為分離培養(yǎng)法。分離培養(yǎng)需要前增菌、增菌、生化鑒定或血清學(xué)鑒定，整個檢測過程需要2-3天甚至5-6天的時間才能完成，而且檢測過程中所需的培養(yǎng)基準(zhǔn)備、平板培養(yǎng)、菌落計數(shù)、生化鑒定等使得檢測任務(wù)勞動強(qiáng)度大，耗時，不能及時、快速評價食品中微生物的安全性，不利于監(jiān)管部門對問題食品的快速反應(yīng)。傳統(tǒng)檢測病原微生物方法步驟多，所需時間長，速度慢，難以適應(yīng)食品快速流通檢測的需要；現(xiàn)代微生物檢測方法雖然檢測速度快，但是在細(xì)菌濃度較低的情況下容易造成漏檢，靈敏度低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種操作簡單、檢測時間短、靈敏度高的檢測微生物的方法。
[0004]本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)配合使用免疫磁分離技術(shù)與核磁共振技術(shù)即可實現(xiàn)微生物的高靈敏度檢測。因此，為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種檢測微生物的方法，該方法包括以下步驟:
[0005](I)將免疫磁球與液體形式的待測樣品進(jìn)行混合，得到混合后的物料；混合的條件使得當(dāng)待測樣品中存在微生物時，免疫磁球能夠特異性地結(jié)合所述微生物，所述能夠特異地與微生物結(jié)合的免疫磁球由抗體與磁球偶聯(lián)得到；
[0006](2)將所述混合后的物料置于分選磁場中進(jìn)行磁分離，除去未結(jié)合在免疫磁球上的物質(zhì)；
[0007](3)重懸磁分離得到的沉淀物，并將得到的重懸液進(jìn)行核磁共振而檢測橫向弛豫時間，根據(jù)橫向弛豫時間判斷待測樣品中的微生物的含量。
[0008]通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明能夠快速有效地檢測樣品中微生物(特別是細(xì)菌、真菌或病毒等)的含量，操作簡單易行且特異性強(qiáng)、靈敏度高，在痕量微生物檢測領(lǐng)域極具應(yīng)用前景。
[0009]本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細(xì)說明。
【附圖說明】
[0010]附圖是用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的【具體實施方式】一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中:
[0011]圖1是按照本發(fā)明的一種實施方式測得的微生物的含量與Λ!^值之間的關(guān)系圖；
[0012]圖2是按照本發(fā)明的另一種實施方式測得的微生物的含量與ΛT2值之間的關(guān)系圖；
[0013]圖3是按照本發(fā)明的另一種實施方式測得的微生物的含量與ΛT2值之間的關(guān)系圖。
【具體實施方式】
[0014]以下對本發(fā)明的【具體實施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0015]在本發(fā)明中，在未作相反說明的情況下，使用的單位“CFU/mL”意指以每毫升待測樣品為基準(zhǔn)的菌株的CFU數(shù)；使用的術(shù)語“免疫磁球”是指通過偶聯(lián)反應(yīng)將抗體結(jié)合到磁性微球(或磁球)的表面上，形成的免疫磁性微球；術(shù)語“橫向弛豫時間”是指兩個處在一定距離內(nèi)，進(jìn)動頻率相同、進(jìn)動取向不同的核互相作用，交換能量，改變進(jìn)動方向所需的時間稱為橫向弛豫時間(或自旋-自旋弛豫時間，T2);本發(fā)明中使用的液體體積均為20°C下的數(shù)值；涉及的術(shù)語“室溫”指室內(nèi)溫度，通常為5-40°C。
[0016]本發(fā)明提供的檢測微生物的方法包括以下步驟:
[0017](I)將免疫磁球與液體形式的待測樣品進(jìn)行混合，得到混合后的物料；混合的條件使得當(dāng)待測樣品中存在微生物時，免疫磁球能夠特異性地結(jié)合所述微生物，能夠特異地與微生物結(jié)合的免疫磁球由抗體與磁球偶聯(lián)得到；
[0018](2)將所述混合后的物料置于分選磁場中進(jìn)行磁分離，除去未結(jié)合在免疫磁球上的物質(zhì)；
[0019](3)重懸磁分離得到的沉淀物，并將得到的重懸液進(jìn)行核磁共振而檢測橫向弛豫時間，根據(jù)橫向弛豫時間判斷待測樣品中的微生物的含量。
[0020]本發(fā)明的檢測方法優(yōu)選為體外檢測方法。
[0021]根據(jù)本發(fā)明，所述微生物可以為各種常見的微生物，特別是有害微生物(或致病菌)，如細(xì)菌、真菌或病毒。所述抗體可以根據(jù)微生物的具體種類進(jìn)行選擇，只要能夠特異性地結(jié)合所述微生物從而實現(xiàn)免疫磁分離即可。優(yōu)選情況下，所述微生物為沙門氏菌(Salmonella)，所述抗體為編號為01-91-99的KPL多克隆抗體。
[0022]根據(jù)本發(fā)明，抗體與磁球偶聯(lián)獲得所述免疫磁球(或免疫磁珠)的方法可以為常規(guī)方法，例如，可以按照文獻(xiàn)(劉輝榮等，簡便高效分離細(xì)胞新型免疫磁珠制備，中國公共衛(wèi)生，2008，11:1349-1351)中的方法進(jìn)行。
[0023]優(yōu)選地，相對于每克的磁球，所述抗體的用量為10-150mg(更優(yōu)選為10mg、30mg、50mg、70mg、80mg、90mg、95mg、lOOmg、105mg、llOmg、120mg、140mg、150mg、或者上述任意兩個數(shù)值之間的范圍)。
[0024]優(yōu)選地，相對于每毫升的液體形式的待測樣品，所述免疫磁球的用量為100-600 μ g(100 μg、200 μ g、300 μg、380 μg、390 μ g、400 μg、410 μg、420 μ g、450 μg、500 μ g、550 μ g、600 μ g或者上述任意兩個數(shù)值之間的范圍)。
[0025]所述磁球可以為各種常規(guī)用于免疫磁分離的磁球，例如，可以為表面修飾羧基的聚乙二醇(PEG)包裹的Fe3O4復(fù)合微球和/或表面修飾有羧基的葡聚糖包裹的Fe 304復(fù)合微球。所述磁球可以通過商購獲得，例如，Micromod有限公司的79-56-201、79-56-102和79-56-501中的至少一種。
[0026]優(yōu)選情況下，所述磁球的粒徑為10-200nm(如 10nm、20nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、90nm、lOOnm、llOnm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm或者上述任意兩個數(shù)值之間的范圍)。
[0027]根據(jù)本發(fā)明，步驟(I)中，對所述混合的條件沒有特別的要求，只要能夠使微生物被所述免疫磁球特異性地結(jié)合即可。所述混合的條件可以包括:溫度為室溫，時間為25-35min?；旌峡梢栽诹姿猁}緩沖液中進(jìn)行，所述磷酸鹽緩沖液含有0.144-0.162mol/L的磷酸氫二鈉和0.038-0.056mol/L的磷酸二氫鈉。
[0028]根據(jù)本發(fā)明，置于分選磁場中進(jìn)行的磁分離可以借助免疫磁分離系統(tǒng)(例如磁力架或Matrix Pathatrix免疫磁分離系統(tǒng))進(jìn)行，對所述磁分離的條件沒有特別的限定，優(yōu)選地，步驟(2)中，所述磁分離的條件包括:溫度為室溫，時間為25-35min。
[0029]根據(jù)本發(fā)明，步驟(3)中，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)χ貞宜萌芤旱挠昧窟M(jìn)行選擇，例如，相對于每毫克的沉淀物，重懸所用溶液的用量為0.5-1.5mL。重懸所用的溶液可以為常規(guī)的用于懸浮免疫磁球的溶液，優(yōu)選為磷酸鹽緩沖液，所述磷酸鹽緩沖液含有0.144-0.162mol/L的磷酸氫二鈉和0.038-0.056mol/L的磷酸二氫鈉。步驟(I)中優(yōu)選使用的磷酸鹽緩沖液與步驟(3)中優(yōu)選使用的磷酸鹽緩沖液可以相同或不同。
[0030]根據(jù)本發(fā)明，所述核磁共振的條件包括:掃描次數(shù)(scans)為4_8次，重復(fù)延遲時間(recycle delay)為1.5_2.5s，接收機(jī)放大倍數(shù)(gain)為50_60dB，重復(fù)測量時間(repetit1n time)為 1s0
[0031]本發(fā)明中，核磁共振檢測的Λ !^值(待測樣品與空白樣品測得的1~2的差值)與結(jié)合有微生物的免疫磁球的含量(St)呈比例關(guān)系(Λ T2= a *lg(St)+b，a和b為常數(shù))，因此，檢測微生物含量已知的標(biāo)準(zhǔn)樣品，獲得Λ 1與含量之間的關(guān)系后，即可根據(jù)待測樣品的Δ !^值判斷待測樣品中的微生物的含量。
[0032]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，所述微生物為沙門氏菌，所述待測樣品為雞蛋，所述磁球的粒徑