用于免疫印跡的微流體裝置的制造方法
【專利說明】用于免疫印跡的微流體裝置
[0001]本申請要求在2013年3月12日提交的美國臨時專利申請61/777，682的優(yōu)先權(quán)，所述申請以整體引用的方式并入本文。
[0002]領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明提供用于在免疫印跡應(yīng)用中使用的微流體裝置、系統(tǒng)和方法。具體而言，本文提供的裝置和方法具有傳統(tǒng)蛋白質(zhì)印跡的優(yōu)點，同時具有增加的生產(chǎn)量和多重能力以及減少的時間、樣品和試劑需求。
[0004]背景
[0005]傳統(tǒng)蛋白質(zhì)印跡分析(或免疫印跡)用于檢測細(xì)胞、組織、器官、體液等中的特定的蛋白質(zhì)。該技術(shù)是生物化學(xué)和分子生物學(xué)的支柱。樣品中的蛋白質(zhì)通過凝膠電泳(例如，SDS-PAGE)分離并且然后從凝膠轉(zhuǎn)移到膜(例如，硝化纖維素或PVDF)。然后將膜用對靶蛋白特異的抗體染色。雖然可靠地產(chǎn)生有用的信息，但所述技術(shù):耗時、需要專門技術(shù)、試劑密集型、有限的生產(chǎn)量并且不太適用于多重性。需要的是提供傳統(tǒng)蛋白質(zhì)印跡的優(yōu)點，同時具有增加的生產(chǎn)量、多重能力和減少的試劑使用的技術(shù)。
[0006]發(fā)明概述
[0007]本發(fā)明提供用于在免疫印跡應(yīng)用中使用的微流體裝置、系統(tǒng)和方法。具體而言，本文提供的裝置和方法具有傳統(tǒng)蛋白質(zhì)印跡的優(yōu)點，同時具有增加的生產(chǎn)量和多重能力以及減少的時間、樣品和試劑需求。
[0008]在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種微流體免疫印跡裝置，其包括平的膜接觸表面和多個非連接的平行微流體通道，其中所述微流體通道的長度對膜接觸表面是開放的。在一些實施方案中，微流體通道在空間上被分成兩個或更多個通道組。在一些實施方案中，兩個或更多個通道組的每個包括2-20微流體通道。在一些實施方案中，分離微流體通道與通道組的距離小于通道組之間的距離。在一些實施方案中，微流體通道(例如，微流體通道的每個)包括在微流體通道的一端的儲蓄池。在一些實施方案中，微流體通道(例如，微流體通道的每個)包括在微流體通道的兩端的儲蓄池。在一些實施方案中，每個微流體通道是50-300 μm寬。在一些實施方案中，每個微流體通道是100-200 μm寬。在一些實施方案中，每個微流體通道是140-160 μ m寬。在一些實施方案中，每個微流體通道是30-200 μ m深。在一些實施方案中，每個微流體通道是50-150 μm深。在一些實施方案中，每個微流體通道是90-110 μπι深。在一些實施方案中，微流體通道的寬度與深度的比小于10:1(例如，〈9:1、〈8:1、〈7:1、〈6:1、〈5:1、〈4:1、〈3:1、〈2:1)。在一些實施方案中，微流體通道的寬度與深度的比在3:1至1:3之間(例如，2:1至1:2)。在一些實施方案中，微流體通道的寬度與深度的比是 9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8或1:9。在一些實施方案中，微流體通道的寬度與深度的比在3:1至1:3之間(例如，2:1至1:2)。在一些實施方案中，所述裝置包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)。在一些實施方案中，所述裝置基本由聚二甲基硅氧烷(PDMS)組成。在一些實施方案中，本發(fā)明提供免疫印跡的方法，所述方法包括使用本發(fā)明的裝置將抗體溶液施用于膜。
[0009]在一些實施方案中，本發(fā)明提供包括本發(fā)明的裝置和膜的系統(tǒng)(例如，分析)。在一些實施方案中，激活溶液被定位或放置在所述的裝置和所述的膜之間。在一些實施方案中，所述激活溶液包含聚山梨醇酯-20 (Tween-20)和BSA。在一些實施方案中，所述激活溶液包含0.01-0.5%的Tween-20和0.01-0.5%的BSA。在一些實施方案中，所述激活溶液包含0.05-0.15%的Tween-20和0.05-0.15%的BSA。在一些實施方案中，所述激活溶液包含0.1 %的Tween-20和0.1 %的BSA。在一些實施方案中，所述膜包含膜硝化纖維素或聚偏二氟乙烯(PVDF)。在一些實施方案中，所述膜包括在膜上或在膜內(nèi)的肽、多肽或蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，系統(tǒng)還包括在微流體通道內(nèi)的一種或多種含抗體溶液。在一些實施方案中，通道組的每個微流體通道包括不同的含抗體溶液。在一些實施方案中，每個通道組包括含抗體溶液的相同的組合。在一些實施方案中，每個微流體通道包括不同的含抗體溶液。在一些實施方案中，本發(fā)明提供免疫印跡的方法，所述方法包括使用本發(fā)明的系統(tǒng)將抗體溶液施用于膜。
[0010]在一些實施方案中，本發(fā)明提供免疫印跡的方法，其包括:(a)將蛋白質(zhì)從樣品轉(zhuǎn)移至膜上；(b)將微流體免疫印跡裝置的膜接觸面放置在膜上；(c)將激活緩沖液引入(例如，注射)所述裝置的微流體通道中；(d)將一抗溶液引入(例如，注射)所述裝置的微流體通道中；并且(e)檢測所述抗體溶液中的抗體與所述蛋白質(zhì)的結(jié)合。
[0011]附圖簡述
[0012]圖1示出微流體免疫印跡裝置和與膜的對接的示意圖。三個微流體通道覆蓋在每個樣品泳道上，可用于探測每個泳道三種不同的蛋白質(zhì)。
[0013]圖2示出在臨床PBMC樣品中的抗體稀釋液。㈧利用針對RelA/p65的一抗的傳統(tǒng)免疫印跡，使用1:500至1:5000的抗體稀釋液。⑶使用相同的條件探測RelA/p65的微流體免疫印跡，如展示了相似的信號強(qiáng)度和對同一樣品制備若干稀釋液的靈活性。
[0014]圖3示出對響應(yīng)于炎性刺激的STAT3磷酸化作用的檢測。(A)RAW264.7細(xì)胞裂解液的傳統(tǒng)免疫印跡，示出響應(yīng)于LPS刺激的STAT3的磷酸化作用。⑶在與(A)相同的RAW264.7細(xì)胞裂解液上的微流體免疫印跡。所述微流體裝置允許在同一樣品中同時監(jiān)測磷酸-STAT3和STAT3而不需要剝離或重新探測PVDF膜。
[0015]圖4示出利用兩種不同的化學(xué)發(fā)光檢測形式的MAPK通路的蛋白質(zhì)免疫印跡。(A)RAW264.7細(xì)胞裂解液的傳統(tǒng)免疫印跡，有或沒有LPS，保持45分鐘。使用總ERK作為上樣對照，探測膜的磷酸-JNK和磷酸-ERK。使用HRP化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測一抗。(B)反映(A)中的條件的微流體免疫印跡。(C)和(D)與(A)和(B)相同，除了它們使用堿性磷酸酶化學(xué)發(fā)光二抗來進(jìn)行以檢測一抗。
[0016]定義
[0017]本文的術(shù)語“抗體”以最廣泛的意義使用并且具體地涵蓋單克隆抗體、多克隆抗體、二聚體、多聚體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物活性(Miller等(2003) Jour, of Immunology 170:4854-4861 ;其以整體引用的方式并入本文)?？贵w可以是鼠的、人的、人源化的、嵌合的或衍生自其他物種?？贵w是由免疫系統(tǒng)生成的能夠識別并結(jié)合特定抗原的蛋白質(zhì)。(Janeway, C、Travers, P, ffalport, M, Shlomchik (2001) Immuno B1logy，第 5 版，Garland Publishing, New York ;以整體引用的方式并入本文)。靶抗原通常具有多個結(jié)合位點，也稱作表位，其由多種抗體上的CDR識別。特異性結(jié)合不同表位的每一抗體具有不同結(jié)構(gòu)。因此，一種抗原可具有不止一種的對應(yīng)抗體。抗體包括全長免疫球蛋白分子或全長免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含免疫特異性地結(jié)合所感興趣的靶標(biāo)抗原或其部分的抗原結(jié)合位點的分子，這些靶標(biāo)包括但不限于癌細(xì)胞或產(chǎn)生與自體免疫疾病相關(guān)的自身免疫抗體的細(xì)胞。免疫球蛋白可以是任何類型(例如，IgG, IgE, IgM, IgD 和 IgA)、類別(例如，IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或免疫球蛋白分子的亞類。免疫球蛋白可以來源于任何物種，包括人、鼠或兔源。
[0018]如本文所用，術(shù)語“抗體片段”指全長抗體的一部分，一般是其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；由Fab表達(dá)文庫產(chǎn)生的片段、抗獨特型(抗-1d)抗體、CDR(互補(bǔ)決定區(qū))以及免疫特異性地結(jié)合抗原的任何上述項的表位結(jié)合片段。
[0019]如本文所用，短語“多重的”或語法等效物指所感興趣的多于一個靶序列的檢測、分析或擴(kuò)增。在一個實施方案中，多重的指>3、>5、>8、>10、>20、>50、>100等?！岸嘀啬芰Α敝敢远嘀胤绞绞褂玫奶囟ㄔO(shè)備、試劑、系統(tǒng)、平臺、試劑盒等的質(zhì)量。
[0020]如本文所用，術(shù)語“樣品”以其最廣泛的意義使用。在某種意義上，其意圖包括細(xì)胞(例如，人、細(xì)菌、酵母和真菌)、有機(jī)體、從任何來源獲得的試樣或培養(yǎng)物，以及生物和環(huán)境樣品。生物樣品可從動物(包括人)獲得并且指在其中發(fā)現(xiàn)的生物材料或組合物，包括但不限于骨髓、血液、血清、血小板、血漿、組織間液、尿液、腦脊液、核酸、DNA、組織以及其純化或過濾形式。環(huán)境樣品包括環(huán)境材料如地表物質(zhì)、土壤、水、晶體和工業(yè)樣品。然而，這些實例不能理解為限制適用于本發(fā)明的樣品類型。
[0021]本發(fā)明實施方案詳述
[0022]本發(fā)明提供用于在免疫印跡應(yīng)用中使用的微流體裝置、系統(tǒng)和方法。具體而言，本文提供的裝置和方法具有傳統(tǒng)蛋白質(zhì)印跡的優(yōu)點，同時具有增加的生產(chǎn)量和多重能力以及減少的時間、樣品和試劑需求。
[0023]自1979年問世以來，蛋白質(zhì)免疫印跡已成為分子生物學(xué)和臨床診斷學(xué)中用于分析蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Towbin等1979;其以整體引用的方式并入本文)。雖然傳統(tǒng)蛋白質(zhì)免疫印跡仍為強(qiáng)大的技術(shù)，但這種技術(shù)具有局限性，包括其緩慢生產(chǎn)量、對于相對大的樣品和抗體量的需求和無法同時探測多種蛋白質(zhì)(Wu等，2007 ;以整體引用的方式并入本文)。
[0024]為克服一些早期局限性，已經(jīng)演化出蛋白質(zhì)免疫印跡的若干變型，包括允許不同蛋白質(zhì)的連續(xù)檢測的膜剝離和重新探測，和熒光二抗的引入，所述熒光二抗可用于增加從樣品檢測到的不同蛋白質(zhì)。盡管取得改進(jìn)，但是這些變型具有其自身的局限性，包括信號缺失和信號可變性。另外，這些變型都沒有解決傳統(tǒng)免疫印跡所需較大樣品和抗體量的問題。
[0025]微流體技術(shù)已應(yīng)用于分子生物學(xué)和臨床診斷學(xué)。通過微流體提供的小體積和精確的空間控制使其成為對現(xiàn)存的分子生物技術(shù)的一個令人興奮的彌補(bǔ)。Herr小組將微流體技術(shù)與傳統(tǒng)蛋白質(zhì)免疫印跡進(jìn)行了結(jié)合(He和Herr 2009，Hughes和Herr 2012，以整體引用的方式并入本文)。雖然取得改進(jìn)，但這種方法僅可檢測單一的蛋白質(zhì)并且不具有對接現(xiàn)存的免疫印跡平臺的靈活性。最近，已開發(fā)出使免疫印跡的分離、轉(zhuǎn)移和檢測部件整合到單個設(shè)備中的微流體裝置(Tia等2011 ;以其整體引用的方式并入本文)。雖然此裝置的速度和多重能力顯著增強(qiáng)，但利用此類整合的微流體裝置探測復(fù)雜生物基質(zhì)中的特定蛋白質(zhì)的能力仍未得到證明。Pan和同事通過引入基于熒光的微流體裝置做了進(jìn)一步改進(jìn)，所述裝置可檢測多種蛋白質(zhì)并且與現(xiàn)存的蛋白質(zhì)免疫印跡方法是兼容的(Pan等2010 ;以整體引用的方式并入本文)。這些微流體裝置都不允許同時探測多種蛋白質(zhì)并且都不能對接現(xiàn)有的免疫印跡設(shè)備和化學(xué)發(fā)光檢測方法。
[0026]雖然傳統(tǒng)蛋白質(zhì)印跡可產(chǎn)生重要的信息(例如，關(guān)于生物系統(tǒng)(例如，人)與外部刺激(例如，抗炎藥)之間的相互作用))