道組可被同等上樣以利用相同抗體組探測(cè)每個(gè)樣品。
[0040]在一些實(shí)施方案中，裝置和/或膜包括疏水表面(例如，PDMS和PVDF)。在本發(fā)明實(shí)施方案的開發(fā)期間進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)揭示在裝置與膜之間達(dá)到合適的密封是有挑戰(zhàn)的。在一些實(shí)施方案中，為克服這個(gè)挑戰(zhàn)，執(zhí)行激活步驟(例如，裝置的和/或膜的)以增強(qiáng)裝置與膜之間的密封。在一些實(shí)施方案中，通過微流體通道激活密封。在一些實(shí)施方案中，將激活溶液施用于裝置的膜接觸表面。在一些實(shí)施方案中，將激活溶液施用于膜。在一些實(shí)施方案中，激活利用PDMS/PVDF表面與所用的水性溶液之間的疏水/親水差異。
[0041]在一些實(shí)施方案中，通過任何合適的結(jié)構(gòu)或方法將溶液加入到微流體通道。在一些實(shí)施方案中，溶液被注入通道。在一些實(shí)施方案中，溶液被注入通道一端的儲(chǔ)蓄池。在一些實(shí)施方案中，溶液添加不需要栗和/或閥。在一些實(shí)施方案中，使用針(例如，10-40量規(guī)
(例如12量規(guī)......16量規(guī)......20量規(guī)......24量規(guī)......27.5量規(guī)......30量規(guī)......36量規(guī)……40量規(guī)))將溶液(例如，抗體溶液)引入通道中。在一些實(shí)施方案中，將溶液從適當(dāng)尺寸的針(例如，27.5量規(guī))引入適當(dāng)尺寸的儲(chǔ)蓄池在針的周圍產(chǎn)生“壓塞”效應(yīng)，這大大增強(qiáng)密封并且有助于微流體通道的填充。
[0042]C.制造
[0043]在一些實(shí)施方案中，使用本領(lǐng)域已知的微流體制造技術(shù)制造本發(fā)明的裝置。各種不例性制造方法在以下文獻(xiàn)中描述:F1rini和Chiu，2005，“Disposable microf luidicdevices:fabricat1n, funct1n, and applicat1n，，B1techniques 38:429-46 ；Beebe等 2000，“Microfluidic tectonics:a comprehensive construct1n platform formicrof luidic systems.^Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 97:13488-13493 ;Rossier 等，2002，“Plasma etched polymer microelectrochemical systems^Lab Chip2:145-150 ;Becker 等，2002，“Polymer microfluidic devices”Talanta56:267-287 ;Becker等，2000，“Polymer microfabricat1n methods for microfluidic analyticalapplicat1ns”Electrophoresis 21:12-26 ;美國(guó)專利號(hào) 6，767, 706B2，例如第 6.8 節(jié)‘‘Microfabricat1n of a Silicon Device，，；Terry 等，1979，A Gas Chromatography AirAnalyzer Fabricated on a Silicon Wafer, IEEE Trans, on Electron Devices, v.ED-26,第 1880-1886 頁(yè)；Berg 等，1994， Micro Total Analysis Systems, New York, Kluwer ；Webster 等，1996， Monolithic Capillary Gel Electrophoresis Stage with On-ChipDetector in Internat1nal Conference On Micro Electromechanical Systems, MEMS96,第 491496 頁(yè)；以及 Mastrangelo 等，1989，Vacuum-Sealed Silicon MicromachinedIncandescent Light Source, Intl.Electron Devices Meeting, IDEM 89,第 503-506 頁(yè)。出于所有目的，這些參考文獻(xiàn)的每項(xiàng)以其整體引用的方式并入本文。在一些實(shí)施方案中，在微流體裝置的制造中使用的方法可依據(jù)所用的材料而變化并且包括軟平版印刷法、微裝配、體微加工法、表面微加工法、標(biāo)準(zhǔn)平版印刷法、濕蝕刻、反應(yīng)離子蝕刻、等離子體蝕刻、立體平版印刷和激光化學(xué)三維書寫法、模塊化裝配法、復(fù)制模塑法、注射成型法、熱成型法、激光燒蝕法、方法的組合以及本領(lǐng)域已知的或在將來(lái)開發(fā)的其他方法。
[0044]裝置制造的示例性方法如下。生成提供裝置的設(shè)計(jì)規(guī)格(例如，裝置尺寸、通道尺寸、通道間距、每組通道數(shù)、通道組數(shù)、通道形狀、儲(chǔ)蓄池的存在、儲(chǔ)蓄池的形狀/大小等)的計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)(CAD)文件。根據(jù)CAD規(guī)格，生產(chǎn)提供裝置的有形設(shè)計(jì)的掩模(例如，玻璃、聚合物等)。根據(jù)掩膜，生產(chǎn)模具(例如，硅晶片模具)，方式是將未固化聚合物(例如，聚二甲基硅氧烷(PDMS))澆注至模具中，隨后加熱掩模和聚合物以固化聚合物(例如，聚合、交聯(lián)等)，產(chǎn)生固體微流體裝置。在一些實(shí)施方案中，可將單個(gè)掩膜重復(fù)利用以產(chǎn)生多個(gè)(例如，10、100、1000、10, 000或更多)模具。在一些實(shí)施方案中，可將單個(gè)模重復(fù)利用以產(chǎn)生多個(gè)(例如，10、100、1000、10, 000或更多)裝置。
[0045]在一些實(shí)施方案中，使用軟平版印刷技術(shù)由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制造微流體裝置；盡管并且合適的聚合物和技術(shù)也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0046]D.抗體/試劑
[0047]在一些實(shí)施方案中，以有效且可再生的方式配制用于本文所描述的裝置的溶液以填充微流體通道。為此，溶液應(yīng)具有適當(dāng)?shù)恼扯?、親水性等。在本發(fā)明實(shí)施方案的開發(fā)期間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以開發(fā)具有適當(dāng)?shù)奶匦缘娜芤河糜诓渴鹪诒疚乃龅难b置的微流體通道中。在一些實(shí)施方案中，溶液包含一種或多種表面活性劑、洗滌劑、乳化劑、增溶劑等，從而以快速且可再生的方式提供可接受的/最佳的微流體通道填充。在一些實(shí)施方案中，溶液包含以下的一種或多種:月桂基硫酸銨、月桂基硫酸鈉(SDS，十二烷基硫酸鈉)、月桂醇聚醚硫酸鈉、肉豆蔻醇聚醚硫酸鈉、二辛基磺基琥珀酸鈉、全氟辛烷磺酸鹽(PFOS)、全氟丁烷磺酸鹽、直鏈烷基苯磺酸鹽(LAB)、硬脂酸鈉、月桂?；“彼徕c、全氟壬酸鹽、全氟辛酸鹽、烷基三甲基銨鹽(例如，十六烷基三甲基溴化銨)、氯化十六烷基吡啶(CPC)、苯扎氯銨(BAC)、芐索氯銨(BZT)、5_溴-5-硝基-1，3- 二噁烷、二甲基雙十八烷基氯化銨、西曲溴銨、二甲基雙十六烷基溴化銨(DODAB)、CHAPS、椰油酰胺丙基羥基磺基甜菜堿、卵磷脂、聚氧乙烯二醇烷基醚、聚氧丙烯二醇烷基醚、葡糖苷烷基醚、聚氧乙烯二醇辛基酚醚(例如，Triton X-100)、聚氧乙烯二醇烷基苯酚醚、甘油烷基酯、聚氧乙烯二醇脫水山梨醇烷基酯(例如，聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80等))、脫水山梨醇烷基酯、椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA、十二烷基二甲胺氧化物、聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物、聚乙氧基牛脂胺(POEA)等。
[0048]在一些實(shí)施方案中，溶液(例如，抗體溶液、激活溶液、封閉溶液、洗滌溶液等)包含指定濃度的Tween(例如，Tween-20)和牛血清白蛋白(BSA)。在一些實(shí)施方案中，利用有用濃度的Tween (例如，Twe en-20)和BSA來(lái)提供針對(duì)微流體通道長(zhǎng)度的有效的溶液流動(dòng)。在一些實(shí)施方案中，利用有用濃度的Tween(例如，Tween-20)和BSA來(lái)提供穿過微流體通道的膜的激活/潤(rùn)濕。在一些實(shí)施方案中，溶液包含0.01 %至5%之間的BSA(例如，0.01%...0.02%...0.05%...0.1%...0.2%...0.5%...1%...2%...5% )。在一些實(shí)施方案中，溶液包含0.01 %至5%之間的Tween (例如，Tween-20)(例如，0.01 %...0.02%...0.05%...0.1%...0.2%...0.5%...1%...2%...5% )。在一些實(shí)施方案中，溶液包含約0.1 %的BSA和約0.1%的Tween20。在一些實(shí)施方案中，溶液包含0.1%的BSA和0.1 % 白勺 Tween20o
[0049]在一些實(shí)施方案中，溶液(例如，封閉、激活、洗滌、抗體溶液等)包含適當(dāng)?shù)柠}、緩沖劑、金屬等，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的。
[0050]在一些實(shí)施方案中，通過使用可檢測(cè)的/可觀察的部分和/或標(biāo)記來(lái)顯現(xiàn)和/或檢測(cè)結(jié)合靶蛋白的抗體。合適的標(biāo)記和/或部分通過光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電學(xué)、光學(xué)或化學(xué)手段進(jìn)行檢測(cè)。在一些實(shí)施方案中，一抗或二抗被連接到檢測(cè)部分。在一些實(shí)施方案中，以酶促方法，例如使用堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶進(jìn)行檢測(cè)。一些實(shí)施方案利用焚光檢測(cè)。預(yù)期可用于本公開的焚光團(tuán)包括Alexa染料(例如，Alexa 350、Alexa430 等)，AMCA、BODIPY 630/650、B0DIPY650/665、BODIPY-FL、B0DIPY-R6G、B0DIPY-TMR、B0DIPY-TRX、瀑布藍(lán)(Cascade Blue)、Cy2、Cy3、Cy5、6_FAM、熒光素、HEX、6-JOE、俄勒岡綠488、俄勒R綠500、俄勒R綠514、太平洋藍(lán)(Pacific Blue)、REG、羅丹明綠、羅丹明紅、R0X、TAMRA、TET、四甲基若丹明、德克薩斯紅(Texas Red)等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到本文未提到的這些和其他的檢測(cè)部分都可成功地用于各種實(shí)施方案中。
[0051]能夠特異性并穩(wěn)定地結(jié)合靶標(biāo)、分析物或抗原的任何抗體、抗體片段或其他分子都可用作如本文所述的一抗和二抗(例如，樹枝狀聚合物、核酸、親和標(biāo)簽等)。盡管本文所述的實(shí)施方案已通常利用抗體(例如，一抗、二抗)來(lái)分析樣品的蛋白質(zhì)含量，但本發(fā)明不限于抗體的使用。應(yīng)將實(shí)施方案廣泛地理解為還包括其他結(jié)合分子。
[0052]E.應(yīng)用
[0053]本發(fā)明的實(shí)施方案可用于其中已使用傳統(tǒng)蛋白質(zhì)印跡的任何應(yīng)用。而且，由于消除了蛋白質(zhì)印跡的成本、時(shí)間、試劑、生產(chǎn)量和多重能力的局限性，本文所述的裝置和方法可用于傳統(tǒng)蛋白質(zhì)印跡不足的另外研究、臨床、診斷和流行病學(xué)應(yīng)用。例如，信號(hào)傳導(dǎo)通路的快速、平行分析已經(jīng)在生物科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)中經(jīng)過了漫長(zhǎng)的探索。為了充分理解這些信號(hào)傳導(dǎo)通路的動(dòng)力學(xué)，必須對(duì)其蛋白組分進(jìn)行分析。這些組分通常用蛋白質(zhì)免疫印跡來(lái)分析。盡管傳統(tǒng)蛋白質(zhì)免疫印跡是強(qiáng)大的技術(shù)，但這種技術(shù)具有若干局限性，包括大的樣品需求、高的抗體量和分析生產(chǎn)量的限制。本發(fā)明的微流體免疫印跡裝置提供信號(hào)傳導(dǎo)通路的蛋白質(zhì)組分的快速、平行的分析。本裝置和方法的效用已通過在細(xì)胞模型和臨床樣品中對(duì)常見炎癥信號(hào)傳導(dǎo)通路(例如，NF K B、JAK-STAT和MAPK)的分析來(lái)證明。在本發(fā)明實(shí)施方案的開發(fā)期間進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)證明微流體免疫印跡裝置可以與傳統(tǒng)蛋白質(zhì)免疫印跡相似的精確度分析內(nèi)源性蛋白質(zhì)，但是有2800倍減少的抗體和多重的能力。此外，本微流體裝置對(duì)接普遍可用的免疫印跡設(shè)備并且與現(xiàn)存的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法是兼容的。
[0054]實(shí)驗(yàn)
[0055]在過去十年中，炎癥已被確認(rèn)為慢性疾病(包括癌癥和心臟疾病)的驅(qū)動(dòng)者(Saleh和Trinchieri 2011 ；Hansson 2005 ;以其整體