一種用于評價三七抗凝活性的生物效價檢定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請涉及一種用于評價Η走抗凝活性的生物效價檢定方法。
【背景技術(shù)】
[000引Η走是一種常用的中藥，其法定來源為五加科植物Η走Panax notoginseng(Burk. )F.Η.化en的干燥根和根莖。又名為田走、山漆、金不換等。支根習(xí)稱 "筋條"，根莖習(xí)稱"剪口"[5]。Η走始載于《本草綱目》，距今已有400多年的用藥史。在國 內(nèi)外久負(fù)盛名，有"止血神藥"的美稱[12-14]。其性甘、微苦、溫；歸肝、胃經(jīng)。具有散癒止 血、消腫定痛的功效。臨床上多用于活血、止血。
[0003]《中國藥典》2010年版，在Η走藥材項下主要收載性狀、顯微和薄層鑒別等，難W全 面評價Η走藥材品質(zhì)，而建立適宜的活血化癒生物活性檢測方法用于Η走質(zhì)量控制和品質(zhì) 評價，可W體現(xiàn)Η走藥材功效特點，補充和完善現(xiàn)有的Η走藥材質(zhì)控模式的不足。
[0004] 將生物活性測定法引入中藥質(zhì)量控制和評價體現(xiàn)，不僅可W鑒定中藥品種和質(zhì) 量，而且可W評價藥效，尤其對于Η走等化學(xué)成分復(fù)雜、理化方法不能表征其含量及理化測 定不能反映生物活性和臨床療效的中藥而言，此方法對于不能反映生物活性和臨床療效的 中藥而言，更能凸顯其優(yōu)越性。
[0005] 生物評價因具有藥效相關(guān)、整體可控等技術(shù)優(yōu)勢，作為符合中醫(yī)藥特點的質(zhì)量標(biāo) 準(zhǔn)控制模式及方法，已成為中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化的重要發(fā)展方向之一。中藥受品種、產(chǎn)地、加工 方法等諸多因素的影響，造成了中藥質(zhì)量的物質(zhì)基礎(chǔ)變化大、質(zhì)量難W控制的現(xiàn)象，并且其 成分復(fù)雜、藥理作用多樣，僅控制少數(shù)成分不足W確保藥材或制劑的質(zhì)量，無法擔(dān)任控制質(zhì) 量或反映療效的重任。因此，本申請試圖通過建立基于生物評價的中藥質(zhì)量研究的方法，完 善現(xiàn)有的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，使臨床用藥更為安全有效。
[000引 參考文獻
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本申請的目的是提供一種用于評價Η走抗凝活性的生物效價檢定方法。
[0015] 中藥質(zhì)量生物評價方法不等同于一般的藥理學(xué)實驗方法，其同時具備定量藥理學(xué) 與藥檢分析的雙重屬性和要求。本申請意在用生物效價檢測方法來評價Η走藥材的品質(zhì)， 從而為其質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。一般來說，藥理學(xué)實驗方法主要是重現(xiàn)其趨勢和規(guī)律，重 在證實試驗結(jié)果與對照組比較是否有統(tǒng)計學(xué)意義；因此，Η走抗凝指標(biāo)檢測結(jié)果主要是重 現(xiàn)其抗凝活性的趨勢和規(guī)律，不一定要重現(xiàn)實驗數(shù)據(jù)的絕對值，重在證實實驗結(jié)果與對照 組比較是否具有顯著性差異及統(tǒng)計學(xué)意義；而藥檢分析則要求重現(xiàn)試驗數(shù)據(jù)的絕對值，但 允許有一定的誤差范圍，因此抗凝活性效價的檢定與化學(xué)成分分析方法相比，可從整體上 對Η走藥材的質(zhì)量進行評價。此外，生物檢定重在評價活性作用大小，而不是要求證某一藥 物是否具有某種藥理作用，更不是要求證其是通過什么藥理機制而發(fā)生作用的。
[0016] 具體地，本申請?zhí)峁┮环N用于評價Η走抗凝活性的生物效價檢定方法，所述生物 效價檢定方法包括W下步驟：
[0017]a.配制供試品溶液和供試品稀釋液
[0018] 制備Η走藥材樣品的干浸膏；
[0019] 在測定前，用生理鹽水將所述干浸膏配置成供試品溶液，過濾除菌，膽存，優(yōu)選地 在4Γ下進行膽存，備用；
[0020] 測定時，估計供試品抗凝效價，用所述生理鹽水稀釋所述供試品溶液，得到不同濃 度的供試品稀釋液；
[0021] b.配制對照品溶液和對照品稀釋液
[0022] 用所述生理鹽水將阿司匹林配制成對照品溶液，過濾除菌，膽存，優(yōu)選地在4°C下 進行膽存，備用；
[0023] 測定時，用所述生理鹽水稀釋所述對照品溶液，得到不同濃度的對照品稀釋液；
[0024] C.測試
[00巧]取凝血儀測試杯，向每個通道加入血漿并加入供試品稀釋液或?qū)φ掌废♂屢?，?分混勻，預(yù)溫后，用全自動凝血儀進行檢測；
[002引 d.生物效價計算
[0027]W所述全自動血凝儀所檢測的凝血酶原時間（PT，單位；S)、活化部分凝血活酶時 間（APTT，單位；S)、凝血酶時間們，單位；S)及纖維蛋白原（FIB，單位；g/L)為評價指標(biāo)且 對給藥濃度取對數(shù)，優(yōu)選地，W活化部分凝血活酶時間為評價指標(biāo)，按照2010年版《中國藥 典》生物檢定統(tǒng)計法項下的量反應(yīng)平行線法（2 · 2)計算Η走樣品的抗凝效價及實驗誤差， 可信限率化％不得超過40 %，優(yōu)選地不超過30 %。
[0028] 在一些實施方式中，所述干浸膏可W通過W下制備：
[0029] 將Η走藥材樣品粉碎成粗粉，置于圓底燒瓶中，加提取溶劑浸泡，回流提取，抽濾， 減壓回收溶劑，真空干燥，得干浸膏并計算收率；
[0030] 在一些實施方式，所加入的提取溶劑的W毫升計的體積可W為Η走樣品粗粉的W 克計的重量的5-15倍。
[0031] 在一些實施方式中，浸泡時間可W為30分鐘，且可W回流提取兩次，每次1. 5小 時。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的是，浸泡的時間或每次回流的時間可W適當(dāng)延長或縮短，且回 流的次數(shù)可W適當(dāng)?shù)卦黾踊驕p少，送樣的調(diào)整不會不利地影響方法的準(zhǔn)確性。
[0032] 在一些實施方式中，所述提取溶劑可W是體積百分?jǐn)?shù)為75%的己醇、體積百分?jǐn)?shù) 為75%的甲醇或水。
[0033] 在一些實施方式中，所述提取溶劑可W為水，優(yōu)選地，所述提取溶劑可W為去離子 水。當(dāng)然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解的是，在本申請中用作提取溶劑的水還可W為去離子 水、蒸傭水等。
[0034] 在一些實施方式中，在步驟a和步驟b中，可W用0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌。
[0035] 在一些實施方式中，所述供試品溶液的濃度可W為lOmg·ml1，所述對照品溶液的 濃度可W為5mg·mL1。當(dāng)然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解的是，所述供試品溶液和對照品溶 液也可W采用其它的濃度，比如20mg·ml1等。
[0036] 在一些實施方式中，用于測試的血漿可W為大鼠血漿、家兔新鮮血漿、兔血凍干血 漿或健康人凍干血漿。
[0037] 在另外的實施方式中，所述血漿還可W為家兔新鮮血漿。
[0038] 在一些實施方式中，所述家兔新鮮血漿可W通過W下制備：
[0039] 取家兔4只，禁食12小時，用一次性采血針自家兔耳緣靜脈取血，迅速注入一次性 構(gòu)稼酸鋼抗凝管中，充分混勻，30(K)r/min離必15min，分離血漿并置于冰浴中備用。
[0040] 在一些實施方式中，在步驟C中，加入到通道的血漿的體積可W為200μ L ;加入到 通道的供試品稀釋液或?qū)φ掌废♂屢旱捏w積可W為200μ L ;預(yù)溫時間可W為100-200S。當(dāng) 然，本申請的技術(shù)人員將理解的是加入的血漿和供試品稀釋液或?qū)φ掌废♂屢阂部蒞采用 其它的體積。
[0041] 在一些實施方式中，所述供試品稀釋液的濃度可W為0. 89~5.Omg·血1。
[0042] 在另外的實施方式中，所述供試品稀釋液的濃度可W為1.33mg-mLi和 1. 77mg·mL1。
[004引在一些實施方式中，所述對照品稀釋液的濃度可W為0. 48~2mg·血1。
[0044]在另外的實施方式中，所述對照品稀釋液的濃度可W為0. 75mg·mL1和 1.OOmg·mL1。
[004引其中，本文所給出的供試品溶液或供試品稀釋液的濃度W mg·mL1為單位，其相 當(dāng)于每毫升溶液中含有的生藥量，比如2. 50mg/ml表示相當(dāng)于每毫升2. 50毫克生藥量的 溶液。且供試品溶液或供試品稀釋液的濃度是依據(jù)W下公式換算的；（稱取的Η走藥材樣 品X收率）^溶液的體積。
[0046] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本申請的生物效價檢定方法操作簡單，方便，且能夠從整體上對