人a群鏈球菌量子點免疫層析檢測卡及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種人A群鏈球菌（M1，3, 5,6, 24血清型） 量子點免疫層析檢測卡及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 鏈球菌廣泛分布于自然界和動物體內(nèi)，可長期寄居于人體鼻咽部和腸道中。為革 蘭氏陽性菌，呈球狀或卵圓形，為需氧或兼性厭氧菌，對營養(yǎng)要求較高。鏈球菌種類繁多，根 據(jù)溶血能力分為α、目、Y溶血性鏈球菌，又稱之甲型、己型、丙型溶血性鏈球菌。根據(jù)鏈球 菌胞壁所含多糖（C抗原）的不同分為A~V等20族（其中缺I和J)，化ancefield分型）。 對人類有致病性的鏈球菌90%屬于A群。鏈球菌C抗原的外層還具有M、T、R、S4種型特 異性抗原。Μ抗原主要見于A群，根據(jù)Μ抗原的不同又可分為90多個血清型，其中在我國能 引起風(fēng)濕熱的臨床上最常見的血清型為Ml，M3，M5，M6，M18，M24等。A群鏈球菌（groupA streptococci,GA巧又稱化賊性鏈球菌（streptococ州Spyogenes),為目溶血性鏈球菌。 A群鏈球菌感染和后遺癥一直是困擾公共健康和國民經(jīng)濟的嚴重問題，尤對兒童和青年影 響最大。A群鏈球菌感染最常發(fā)生于冬春季和雨季，在兒童發(fā)病年齡多見于5~15歲，臨床 可把A群鏈球菌感染分為四類；①淺表部位感染；咽炎、皮膚和軟組織感染、賊瘡瘡、丹毒、 陰道炎、產(chǎn)后感染；②深部感染：菌血癥、壞死性筋膜炎、深部組織感染、蜂窩織炎、肌炎、賊 毒敗血癥、必包炎、腦膜炎、肺炎、化賊性關(guān)節(jié)炎；⑨毒素介導(dǎo)；猩紅熱、鏈球菌中毒性休克 綜合征；④免疫介導(dǎo)：風(fēng)濕熱、鏈球菌感染后腎小球腎炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎。
[0003] 臨床病人由于不同的呼吸道病原體（如副流感病毒、流感嗜血桿菌、流感病毒、呼 吸道合胞病毒、腺病毒等）感染引起疾病癥狀可W十分相似，送導(dǎo)致了流行診斷比較困難， 確診往往依賴于實驗室診斷?？焖儆行У脑\斷方法應(yīng)該是在疾病的發(fā)病初期就可W得到明 確的診斷，便于實施針對性的治療，阻止病情的發(fā)展遷延。
[0004] 盡管A群鏈球菌在全球范圍內(nèi)傳播，但可用于實驗室診斷的標準化商品試劑的種 類極少。目前，A群鏈球菌的檢測主要有W下幾種方法：
[0005] -、常規(guī)實驗室檢測
[0006] 1、細菌分離
[0007] 細菌培養(yǎng)是診斷A群鏈球菌感染的"金標準"。樣本采集后最好立即接種到血瓊脂 培養(yǎng)基上。若無條件及時接種，應(yīng)使用轉(zhuǎn)運培養(yǎng)基。將標本接種在血瓊脂平皿，35~37t：， 含有5 %~10 %C〇2或厭氧條件下賠育，可增加A群鏈球菌的分離率。血瓊脂平皿賠育24~ 4她。A群鏈球菌菌落常不能與其他目一溶血性鏈球菌區(qū)別，特別是C群和G群，需采用血 清學(xué)方法進行最后鑒定。該法培養(yǎng)所需時間長，操作步驟繁多，且若采樣前患者使用過抗菌 藥物，會造成培養(yǎng)結(jié)果的假陽性。送樣在臨床方面對病人的治療就有一定的局限性。
[000引 2、血清學(xué)檢測
[0009]即采用酶聯(lián)免疫法、放免法、微量免疫英光法等，檢測被檢者血清中A群鏈球菌抗 體水平，可間接提示A群鏈球菌感染的存在。然而，血清學(xué)試驗只能提供一種回顧性的診 斷，它需要同時檢測患者急性期和恢復(fù)期的雙份血清，如果恢復(fù)期中抗人A群鏈球菌抗體 效價比急性期高4倍或4倍W上才有診斷意義。另外，臨床上主要檢測的抗體為抗鏈球菌 素0,而統(tǒng)計學(xué)研究表明大約20%的病人并不出現(xiàn)出現(xiàn)抗鏈球菌素0水平的升高，故現(xiàn)有血 清學(xué)方法的檢測質(zhì)量受到一定限制。
[0010] 二、快速診斷
[0011] 直接檢查人A群鏈球菌蛋白抗原和菌體核酸可達到快速診斷的目的，目前主要有 免疫英光法、免疫酶法和PCR法等。免疫英光法和免疫酶法均不能進行一步檢測，均存在操 作步驟復(fù)雜，需要專業(yè)人員操作，檢測時間長（2hW上），成本較高等缺點。PCR法主要是檢 測鏈球菌特異性rRNA序列，其檢測快速、靈敏、特異，是目前研究A群鏈球菌感染的重要手 段，但由于PCR對實驗設(shè)備W及操作要求較高，且易出現(xiàn)假陽性，在我國還不能作為常用的 臨床診斷方法。目前，檢測人A群鏈球菌抗原的方法主要為膠體金法檢測其C多糖抗原，但 是膠體金法敏感度較低，對樣品材料質(zhì)量要求較高，同時在檢測前還必須對樣品進行細胞 裂解W釋放C多糖，而添加細胞裂解液的量又對檢測靈敏度有較大的影響。因此，建立具備 快速、高靈敏度的A群鏈球菌特異性抗原快速診斷法十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明針對【背景技術(shù)】中現(xiàn)存的幾種人A群鏈球菌在檢測方式中遇到的技術(shù)瓶頸， 提出了一種具有操作簡便、檢測快速、可定量及高靈敏度等優(yōu)點的人A群鏈球菌（M1，3, 5， 6, 24血清型）量子點免疫層析檢測卡及其制備方法和應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明的目的是通過W下技術(shù)手段來實現(xiàn)的：
[0014] 一種人A群鏈球菌量子點免疫層析檢測卡，其特征在于；所述人A群鏈球菌量子點 免疫層析檢測卡包括底板、樣品墊、結(jié)合墊、檢測層W及吸水墊；所述結(jié)合墊包被有量子點 標記的抗人A群鏈球菌納米探針；所述檢測層是由帶有一條檢測線及一條質(zhì)控線的固相硝 酸纖維素膜構(gòu)成；所述檢測線包被有鼠抗人A群鏈球菌Μ蛋白多克隆抗體；所述質(zhì)控線包 被有抗兔IgG ;所述檢測層粘貼在底板上；所述結(jié)合墊W及吸水墊分別設(shè)置在檢測層兩端 部的上方且與檢測層部分重疊后分別與檢測層W及底板粘貼在一起；所述樣品墊設(shè)置在結(jié) 合墊上方且與結(jié)合墊部分重合后分別與結(jié)合墊及底板粘貼在一起；所述人A群鏈球菌是人 A群鏈球菌Ml，3, 5,6, 24血清型。
[0015] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所采用的量子點是駿基化兩親聚合物修飾的水溶性CdSe/ZnS 量子點。
[0016] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所采用的抗兔IgG包括但不限于羊抗兔IgG。
[0017] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所采用的檢測層長2cm，所述檢測層粘貼在長度是6. 6-7. 7cm的 底板表面中間段；所述檢測層與粘貼在檢測層W及底板上的且長度是2. 5-3cm的吸水墊重 疊0. 2-0. 4cm;所述檢測層與粘貼在檢測層W及底板上的且長度是0. 5-0. 8cm的結(jié)合墊重 疊0. 2-0. 4cm;所述結(jié)合墊與粘貼在結(jié)合墊W及底板上的長度是2. 5cm的樣品墊重疊0. 2- 0. 4cm;所述檢測線與質(zhì)控線的間距是0. 5-0. 8cm;所述底板的寬度是0. 3-0. 5畑1。
[001引作為優(yōu)選，本發(fā)明所采用的吸水墊是吸水濾紙；所述底板是PVC板。
[0019] 一種基于上述的人A群鏈球菌量子點免疫層析檢測卡的制備方法，其特征在于： 所述制備方法包括W下步驟：
[0020] 1)結(jié)合墊的制備：
[002。 1. 1)重組M-His融合蛋白的制備、純化：
[0022] 1. 1. 1)對人A群鏈球菌1，3,5,6,24型M蛋白進行生物信息學(xué)分析，分別獲取其N 端型特異性序列（高變區(qū)）中含胞外抗原表位且不與其他抗原抗體起交叉反應(yīng)的的膚段， 分別標記為M1，M3,M5,M6及M24 ;
[0023] 1.1.2)找到步驟1.1. 1)中所得到五個膚段一一對應(yīng)的基因編碼序列，按 M1-M3-M5-M6-M24的順序進行序列拼接并根據(jù)大腸桿菌中密碼子的偏好性對該序列進行密 碼子優(yōu)化，在上述經(jīng)密碼子優(yōu)化后的重組基因的序列的5'端及3'端引入酶切位點并化學(xué) 合成全基因序列，同時標記記為m;其基因序列如序列表所示；
[0024] 1. 1.3)將步驟1. 1.2)中所得到的m按分子生物學(xué)方法克隆入表達載體 祀T-28a(+)后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達重組M-His融合蛋白；所述重組M-His融合蛋白W可溶 性表達方式存在于菌體中；
[00巧]1. 1. 4)用媒柱純化步驟1. 1. 3)所得到的重組蛋白，SDS-PAGE檢測其純度后，W化a壯ord法測定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整蛋白濃度為0.2mg/mL后備用；
[0026] 1. 2)兔及鼠抗人A群鏈球菌Μ蛋白多克隆抗體IgG的制備：
[0027] 1. 2. 1)W步驟1. 1. 4)中所得到的重組M-His融合蛋白為完全抗原，分別免疫新西 蘭大白兔及豚鼠；分別制備兔抗人A群鏈球菌Μ蛋白抗血清及鼠抗人A群鏈球菌Μ蛋白抗 血清；所述兔抗人A群鏈球菌Μ蛋白抗血清及鼠抗人A群鏈球菌Μ蛋白抗血清的間接化ISA 效價均大于1Χ1〇5;
[0028] 1. 2. 2)采用Protein G親和層析柱分別純化兔抗人A群鏈球菌Μ蛋白抗血清及鼠 抗人A群鏈球菌Μ蛋白抗血清中的多克隆抗體IgG;
[0029] 1. 2. 3)用凱基化aford蛋白含量檢測試劑盒測定步驟1. 2. 2)所得到的二種多克 隆抗體IgG的濃度，將其蛋白濃度均調(diào)整為3mg/mL后備用；
[0030] 1. 3)量子點標記的抗人A群鏈球菌納米探針的制備與純化：
[003。1. 3. 1)向微量離必管中依次加入2nmol量子點、300nmolN-居基玻巧醜亞胺和 SOOnmol碳二亞胺，W磯酸鹽緩沖液定容為2ml，于旋轉(zhuǎn)混合儀中，W15巧m/min，37°C反應(yīng) 30min后，透析去除過量的N-居基玻巧醜亞胺W及碳二亞胺；所述磯酸鹽緩沖液中各組分 含量分別為；2. 9g/L磯酸氨二鋼、0. 295g/L磯酸二氨鋼W及2g/L氯化鋼，所述磯酸鹽緩沖 液的抑=7. 3 ;
[003引1.3.2)在活化的量子點中，加入4-12nmol的步驟1. 2)所制備的兔抗人A群鏈球 菌Μ蛋白多克隆抗體IgG,避光反應(yīng)化，加入端氨基化聚己二醇至終濃度為1. 5%，封閉未 反應(yīng)的活化駿基位點，繼續(xù)避光反應(yīng)比；用0. 2um PES濾器過濾除去抗體聚集物，然后將 濾液轉(zhuǎn)移到50000MW超濾離必管中，W8000g離必力在4°C下離必15min，除去未發(fā)生偶聯(lián) 反應(yīng)的抗體和反應(yīng)中的副產(chǎn)物；收集超濾管濾膜上層量子點-抗體偶聯(lián)物溶液，溶于2ml 磯酸鹽洗涂液中，再將此溶液轉(zhuǎn)移到50000MW超濾離必管中，W8000g離必力在4°C下離必 15min，收集超濾管濾膜上層量子點-抗體偶聯(lián)物溶液，溶于1ml磯酸鹽保存液中，至此制得 量子點標記的抗人A群鏈球菌納米探針；
[0033] 所述磯酸鹽洗涂液中各組分含量分別為；2. 9g/L磯酸氨二鋼、0. 295g/L磯酸二氨 鋼、2g/L氯化鋼、5ml/L吐溫-20W及Ig/L疊氮鋼；所述磯酸鹽洗涂液的抑=7. 3 ;所述磯 酸鹽保存液中各組分含量分別為；2. 9g/L磯酸氨二鋼、0. 295g/L磯酸二氨鋼、2g/L氯化鋼、lOg/LBSAW及Ig/L疊氮鋼；所述磯酸鹽保存液的抑=7. 3 ;
[0034] 1. 4)量子點標記抗體的負載：
[0035] 將聚醋纖維膜浸入步驟1. 3. 2)所得到的量子點標記的抗人A群鏈球菌納米探針 溶液中比，取出，25°C干燥后4°C密封保存?zhèn)溆?，至此制得結(jié)合墊；
[0036]。樣品墊的制備：
[0037] 取玻璃纖維素膜一張，將玻璃纖維素膜在樣品墊處理液中浸泡至少化W上，再置 于生物安全柜內(nèi)37Γ通風(fēng)干燥后，25Γ密封干燥保存；至此制得樣品墊；
[0038] 所述樣品墊處理液中各組分含量分別為；2. 9g/L磯酸氨二鋼、0. 295g/L磯酸二氨 鋼、2g/L氯化鋼、20g/L牛血清白蛋白度SA)、lOml/L吐溫-20、20g/L藏糖W及5g/L聚己帰 化咯焼麗，所述樣品墊處理液的抑=7. 3 ;
[00測如檢測層的制備：
[0040] 3. 1)將步驟1. 2)制備的鼠抗人A群鏈球菌Μ蛋白多克隆抗體與抗兔IgG用磯酸 鹽緩沖液均調(diào)整至終濃度為0. 5-2. 5mg/mL后備用；所述磯酸鹽緩沖液中各組分含量分別 為；2. 9g/L磯酸氨二鋼、0. 295g/L磯酸二氨鋼W及2g/L氯化鋼，所述磯酸鹽緩沖液的抑= 7. 3 ;
[0041] 3. 2)將稀釋好的鼠抗人A群鏈球菌Μ蛋白多克隆抗體裝入BI0D0T劃膜儀噴頭 中，設(shè)置0. 8-2. 5μ1/cm的量噴于硝酸纖維素膜上，形成檢測線；將稀釋好的抗