，掙開柱的塞子，用提供的接頭將柱和注射器連接上， W1血/min流速洗柱。
[0131] 2)用10血上樣緩沖液平衡，1血/min流速。
[013引3)將融合蛋白上樣，1血/min流速。
[0133] 4)用10血上樣緩沖液，W1血/min流速洗柱。
[0134] W用 10血洗脫緩沖液（20mM胞3口〇4,0. 5MNaCl，300mM咪哇，抑7.4)，WImL/min 流速洗脫，分管收集，每管SDS-PAGE檢測(cè)，合并洗脫組分中含有目的蛋白的樣品。 經(jīng)bra壯ord試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定后，調(diào)整濃度為0. 2mg/mL。
[013引（二）兔及鼠抗人A群鏈球菌（Ml，3, 5,6, 24血清型）Μ蛋白多克隆抗體IgG的制 備
[0136] 1.兔抗人A群鏈球菌曲1，3,5,6,24血清型）1蛋白多克隆抗體1邑6的制備
[0137] 用步驟（一）純化的重組M-His融合蛋白按照200μg(l血）與1血弗氏完全 佐劑混勻乳化后免疫雄性新西蘭大白兔（由湖北省疾病預(yù)防控制中必提供），于背部皮 下多點(diǎn)注射，間隔7d后再免疫一次，再過14d后用上述純化的重組M-His融合蛋白按照 200ug(lmL)與ImL弗氏不完全佐劑混勻乳化后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫7d后再按上述同 樣方法再加強(qiáng)免疫一次。7d后取血分析抗體滴度。若不滿意，可重復(fù)進(jìn)行一到兩次加強(qiáng)免 疫，至抗體滴度滿意（用ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)大于1X105)。若滿意則必臟采血，分離血 清，WProteinG親和層析柱（GEhealthcare公司產(chǎn)品），嚴(yán)格按照操作說明書純化多克 隆抗體IgG,用凱基化aford蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定抗體濃度并用磯酸鹽緩沖液（8g/L 化CL，0. 2g/LKC1，0. 24g/LKH2PO4,1. 44g/LNa2HP〇4pH7. 4)調(diào)整為lmg/mL，-2(TC保藏備用， 至此制得兔抗人A群鏈球菌（Ml，3,5,6,24血清型）M蛋白多克隆抗體IgG。Westenblot 試驗(yàn)表明，此多克隆抗體IgG能特異性識(shí)別人A群鏈球菌（Ml, 3, 5,6, 24血清型）全長Μ蛋 白。
[0138] 2.鼠抗人A群鏈球菌曲1，3,5,6,24血清型）1蛋白多克隆抗體1邑6的制備
[0139] 用步驟（一）純化的重組M-His融合蛋白作為完全抗原免疫豚鼠（由湖北省疾病 預(yù)防控制中必提供），肩腫下注射抗原200μg/只?；A(chǔ)免疫為等體積的抗原與弗氏完全佐 劑進(jìn)行乳化，每隔2周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫用等體積抗原與等體積弗氏不完全佐 劑進(jìn)行乳化，總共免疫4次。末次免疫lOd后取血分析抗體滴度。若不滿意，可重復(fù)進(jìn)行一 到兩次加強(qiáng)免疫，至抗體滴度滿意（用化ISA法測(cè)定抗體效價(jià)大于IX1〇5)。若滿意則處死 豚鼠取血清，WProteinG親和層析柱（GEhealthcare公司產(chǎn)品），嚴(yán)格按照操作說明書純 化多克隆抗體IgG,用凱基化aford蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定抗體濃度并用磯酸鹽緩沖液 (8g/LNa化，0. 2g/LKC1，0. 24g/LKH2PO4,1. 44g/LNa2HP〇4pH= 7. 4)調(diào)整為Img/mL，備用， 至此制得鼠抗人A群鏈球菌（Ml，3,5,6,24血清型）M蛋白多克隆抗體IgG。Westenblot 試驗(yàn)表明，此多克隆抗體IgG能特異性識(shí)別人A群鏈球菌（Ml, 3, 5,6, 24血清型）全長M蛋 白。
[0140] (H)量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人A群鏈球菌（M1，3, 5,6, 24血清型）納米探針的制備
[0141] 1.納米駿基量子點(diǎn)標(biāo)記兔抗人A群鏈球菌曲1，3,5,6,24血清型）1蛋白多克隆抗 體IgG反應(yīng)條件的優(yōu)化：
[0142] 1. 1、駿基量子點(diǎn)標(biāo)記抗體探針最佳標(biāo)記抑的確定
[0143] 將標(biāo)記反應(yīng)中磯酸鹽緩沖液pH分別設(shè)為5,6, 7,8,9,對(duì)標(biāo)記產(chǎn)物利用全光譜儀進(jìn) 行英光強(qiáng)度測(cè)定，觀察不同抑值對(duì)偶聯(lián)反應(yīng)的影響，確定了量子點(diǎn)標(biāo)記多抗反應(yīng)的最佳抑 為7.0-8. 0。本實(shí)驗(yàn)選擇抑7. 4。
[0144] 1. 2、駿基量子點(diǎn)標(biāo)記抗體探針最佳標(biāo)記量的確定
[0145] 將量子點(diǎn)摩爾濃度與多抗?jié)舛戎确謩e設(shè)置為1: 1，1:2,1:3及1:4,進(jìn)行標(biāo)記反 應(yīng)后，對(duì)標(biāo)記產(chǎn)物利用全光譜儀進(jìn)行英光強(qiáng)度測(cè)定，觀察二者不同濃度比對(duì)偶聯(lián)反應(yīng)的影 響，確定量子點(diǎn)標(biāo)記兔抗人A群鏈球菌（M1，3, 5,6, 24血清型）M蛋白多克隆抗體IgG反應(yīng) 的最佳摩爾濃度比為量子點(diǎn)與抗體摩爾比為1: 3。本實(shí)驗(yàn)選擇該最優(yōu)濃度比來確定標(biāo)記量。
[0146] 1. 3、駿基量子點(diǎn)標(biāo)記抗體探針最佳封閉劑種類的確定
[0147]W己醇胺、Tris、PEG2000-NH2或者BSA作為封閉劑，按步驟1. 1及1. 2確定的條 件進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)后，對(duì)標(biāo)記產(chǎn)物利用全光譜儀進(jìn)行英光強(qiáng)度測(cè)定，觀察不同的封閉劑對(duì)于 標(biāo)記反應(yīng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PEG2000-NH2為最佳封閉劑，其可顯著提高標(biāo)記復(fù)合物的膠體 穩(wěn)定性及免疫活性。
[014引 2.標(biāo)記過程：
[0149] 向微量離必管中依次加入2nmol駿基水溶性量子點(diǎn)、300nmolN-居基玻巧醜亞胺 (sul化-N服）和300nmol碳二亞胺巧DC)，W磯酸鹽緩沖液化9g/L磯酸氨二鋼，0. 295g/L 磯酸二氨鋼，4g/L氯化鋼，pH7. 4)定容為2ml，不停地混合溶液，37 °C反應(yīng)30min后，透析 去除過量的作為活化劑的sulfo-NHS與邸C。在活化的量子點(diǎn)中，加入6nmol的步驟（二） 制備的的兔抗人A群鏈球菌（Ml，3，5，6，24血清型）Μ蛋白多克隆抗體IgG,避光反應(yīng)化，加 入單端氨基化聚己二醇（PEG2000-NH2)至終濃度為1%，封閉未反應(yīng)的活化駿基位點(diǎn)，繼續(xù) 避光反應(yīng)比。用0. 2μmPES濾器過濾除去抗體聚集物，然后將濾液轉(zhuǎn)移到50000MW超濾離 必管中，W8000g離必力在4°C下離必15min，除去未發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)的抗體和反應(yīng)中的副產(chǎn) 物。收集超濾管濾膜上層量子點(diǎn)-抗體偶聯(lián)物溶液，溶于2ml磯酸鹽洗涂液化9g/L磯酸 氨二鋼，0. 295g/L磯酸二氨鋼，4g/L氯化鋼，5ml/L吐溫-20，0. 3g/L疊氮鋼，pH7. 4)中，再 將此溶液轉(zhuǎn)移到50000MW超濾離必管中，W8000g離必力在4°C下離必15min，收集超濾管 濾膜上層量子點(diǎn)-抗體偶聯(lián)物溶液，溶于1ml磯酸鹽保存液化9g/L磯酸氨二鋼，0. 295g/ L磯酸二氨鋼，2g/L氯化鋼，lOg/LBSA，0. 3g/L疊氮鋼，pH7. 4)中，至此制得量子點(diǎn)標(biāo)記的 抗人A群鏈球菌（Ml，3,5,6,24血清型）納米探針，置于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0150](四）量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人A群鏈球菌曲1，3,5,6,24血清型）納米探針的負(fù)載
[0151] 將聚醋纖維膜浸入步驟（H)所得到的量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人A群鏈球菌（Ml，3,5,6， 24血清型）納米探針溶液中比，取出，25°C干燥后裁成后規(guī)格為4cm*0. 6cm/條后，4°C密封 保存?zhèn)溆?，至此制得結(jié)合墊。
[0152] 實(shí)施例2 (制備實(shí)施例）
[0153] 樣品墊的制備
[0154]配制不同配方的樣品墊處理液，觀察量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的釋放效果，通過多次正 交試驗(yàn)優(yōu)化，得到最優(yōu)的樣品墊處理液配方（即本發(fā)明所述）。取玻璃纖維素膜一張，將 其在樣品墊處理液中浸泡至少化，再置于生物安全柜內(nèi)37°C通風(fēng)干燥后，剪裁成規(guī)格為 4cm*2. 5cm/條后，即制得樣品墊，25°C密封干燥保存。經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)該樣品墊的使用，大大提 高了結(jié)合墊上量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的釋放率，達(dá)到了較好的應(yīng)用效果。
[01巧]實(shí)施例3 (制備實(shí)施例）
[0156] 檢測(cè)層的制備
[0157] 將硝酸纖維素膜剪成4cm*4cm大小。將實(shí)施例1中所制備的鼠抗人A群鏈球菌 (M1，3, 5,6, 24血清型）M蛋白多克隆抗體IgG和抗兔IgG用磯酸鹽緩沖液調(diào)整至終濃度分 別為2.0mg/mL及l(fā).Omg/mL。將稀釋好的鼠抗人A群鏈球菌（Ml，3,5,6,24血清型）M蛋白 多克隆抗體IgG裝入BIODOT劃膜儀噴頭中，設(shè)置1. 0μ1/cm的量噴于硝酸纖維素膜上，形 成檢測(cè)線；將稀釋好的抗兔IgG裝入BIODOT劃膜儀噴頭中，設(shè)置1. 0μ1/cm的量噴于硝酸 纖維素膜上作為質(zhì)控線，其與檢測(cè)線間距為0. 7cm。將噴好的硝酸纖維素膜37°C干燥化，剪 裁成4cm*4cm的規(guī)格，4°C密封干燥保存。至此制得檢測(cè)層。
[0158] 實(shí)施例4 (制備實(shí)施例）
[0159] 檢測(cè)卡的組裝
[0160] 下面結(jié)合附圖1及附圖2對(duì)檢測(cè)卡的組裝作進(jìn)一步說明。
[0161] 將底板裁剪成4cm*7. 3cm大小，備用。
[0162] 將吸水濾紙裁剪成4cm*3cm大小，作為吸水墊，備用。
[0163] 組裝工作于生物安全柜內(nèi)操作，首先將底板7上的粘性保護(hù)膜掲掉，將實(shí)施例3所 述的檢測(cè)層3即帶有質(zhì)控線5和檢測(cè)線4的硝酸纖維素膜粘貼到底板7上附圖1所指的具 體區(qū)域，并小必抹平膜面。其次，將事先裁好的吸水墊6組裝到底板7上，使其左邊與檢測(cè) 層右末端有0. 2cm的重疊，其右邊緣則與底板7的右邊緣對(duì)齊粘好并小必抹平。再將實(shí)施 例1所描述的結(jié)合墊2按0. 3cm重疊于檢測(cè)層3的左邊緣處，0. 3cm粘于底板7上。最后將 實(shí)施例2所描述的的樣品墊1則按一邊0. 3cm重疊于結(jié)合墊2的左邊緣處，另一邊與底板7 的左邊緣對(duì)齊，粘于底板7上并小必抹平。將組裝好的檢測(cè)板于切條機(jī)下裁成4. 0mm寬的 檢測(cè)卡，4 °C密封干燥避光保存。
[0164] 實(shí)施例5 (應(yīng)用實(shí)施例）
[0165] 檢測(cè)卡的使用方法
[0166] 按常規(guī)方法獲得待檢者的咽拭子，將其插入裝有500μ1的添加了 1%Triton x-100(體積百分比）的磯酸鹽緩沖液（PBST)的軟質(zhì)塑料管中，擠壓塑料管壁，使拭子上的 樣品充分溶解后，取出120μL滴于檢測(cè)卡的樣品墊上，15分鐘后于紫外分析儀下（型號(hào)為 WD-9403A，北京六一儀器廠生產(chǎn)，紫外激發(fā)波長365nm)觀察檢測(cè)結(jié)果。若咽拭子中含有人A 群鏈球菌（Ml, 3,5,6,24血清型）抗原，則與結(jié)合墊中的量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人A群鏈球菌（Ml, 3, 5,6, 24血清型）納米探針結(jié)合，通過層析作用先與硝酸纖維素膜上的鼠抗人A群鏈球菌 (Ml，3,5,6,24血清型）M蛋白多克隆抗體結(jié)合后在紫外線激發(fā)下在檢測(cè)線處會(huì)形成肉眼可 見的一條英光檢測(cè)線，未結(jié)合完的量子點(diǎn)標(biāo)記抗體繼續(xù)層析與抗兔IgG結(jié)合后在紫外線激 發(fā)下形成肉眼可見的第二條英光質(zhì)控線；若待檢咽拭子中無相關(guān)抗原，則僅出現(xiàn)一條英光 質(zhì)控線。如果英光質(zhì)控線未出現(xiàn)，則該檢測(cè)卡失效。
[0167] 實(shí)施例6(應(yīng)用實(shí)施例）
[016引本發(fā)明的應(yīng)用效果舉例
[0169] 本實(shí)施例中所指的人A群鏈球菌（Ml，3,5,6,24血清型）量子點(diǎn)免疫層析檢測(cè)卡 的使用方法參照實(shí)施例5所述的操作步驟。
[0170] 1)特異性試驗(yàn)
[017。 用呼吸道常見病原體如人呼吸道合胞病毒化ong株，ATCC編號(hào)VR26)、人肺炎支原 體（ATCC編號(hào)15531)、人肺炎衣原體（AR-39株，ATCC編號(hào)53592)、人腺病毒3型（GB株，ATCC編號(hào)VR-3)、人腺病毒7型（Gomen株，ATCC編號(hào)VR-7)、人甲型流感病毒0ΠΝ1，ATCC 編號(hào)VR-1743)、人己型流感病毒（ATCC編號(hào)VR-790)、流感嗜血桿菌（ATCC編號(hào)53781)、肺 炎鏈球菌（ATCC編號(hào)700670)等代替人A群鏈球菌進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)卡檢測(cè)含送些微生物的 PBST稀釋液都為陰性。
[0172] 2)敏感性試驗(yàn)
[0173] 將人Ml血清型A群鏈球菌（ATCC編號(hào)700294)樣品用PBST緩沖液進(jìn)行系列稀釋 后，用實(shí)施例4所述檢測(cè)卡進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明其檢測(cè)底限為2X104CRJ/ml。而用來自生產(chǎn) 商Binax的名為BinaxNOWStr巧Atest(膠體金法）的試劑盒