一種用于檢測鹽酸賽庚啶的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于檢測技術領域，具體地涉及一種用于定量檢測豬尿樣本中的鹽酸賽庚啶殘留量的酶聯(lián)免疫試劑盒及檢測方法。
【背景技術】
[0002]鹽酸賽庚啶是H1受體拮抗劑，屬于抗組胺藥，但同時也是5—羥色胺受體拮抗劑，是合法的人用藥品，對抗體內組胺對血管、支氣管平滑肌的作用，從而消除過敏癥狀，也可用于改善患者的食欲。鹽酸鹽酸賽庚啶用于養(yǎng)殖業(yè)可以促進動物生長，其具有抗5-羥色胺的作用，可抑制下丘腦的飽覺中樞而刺激食欲增加體重，因此一些畜牧養(yǎng)殖企業(yè)將其作為非法飼料添加劑用于促進畜禽生長。鹽酸賽庚啶在動物體內的殘留可對人體健康產生危害。2010年12月農業(yè)部1519號公告《禁止在飼料和動物飲水中使用的物質》中明確規(guī)定，禁止使用該類藥物作為生產促進劑用于畜禽養(yǎng)殖，同年，農業(yè)部公布了“飼料中可樂定和鹽酸賽庚啶的測定液相色譜一串聯(lián)質譜法”。目前國外已有對人的血液和尿液中鹽酸鹽酸賽庚啶進行檢測的方法報道，主要為高效液相色譜法和液相色譜一串聯(lián)質譜法，本實驗室也曾建立液相色譜一串聯(lián)質譜法檢測飼料中違法添加的鹽酸鹽酸賽庚啶含量的分析方法，但目前國內外尚無動物可食用組織及豬尿中鹽酸鹽酸賽庚啶的檢測標準。
[0003]目前，檢測鹽酸賽庚啶的方法主要有高效液相色譜法HPLC、氣相色譜法GC等。其中，高效液相色譜法HPLC、氣相色譜法GC是定量的檢測方法，結果準確可靠，缺點是檢出限較高、儀器設備較為昂貴，以及復雜的樣本前處理方法，限制了該方法的廣泛應用。酶聯(lián)免疫吸附ELISA法是一種準確、可靠、快速、特異的檢測方法，適合于大批樣品的快速篩選，近年來已廣泛應用。本發(fā)明旨在建立一種檢測豬尿中鹽酸鹽酸賽庚啶的ELISA試劑盒的制備及檢測方法。

【發(fā)明內容】

[0004]針對現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明提供了檢測鹽酸賽庚啶的ELISA試劑盒，其檢測靈敏、準確、快速，操作簡便、特異性強，適用于大批樣品的檢測。本發(fā)明提供了一種用于檢測鹽酸賽庚啶的ELISA試劑盒的制備。
[0005]檢測鹽酸賽庚啶的ELISA試劑盒的制備，包括酶標板、鹽酸賽庚啶標準品、鹽酸賽庚啶酶標抗體工作液、底物液A、底物液B、終止液和濃縮洗滌液。
[0006]檢測鹽酸賽庚啶的ELISA試劑盒的制備，包括以下步驟:酶標板的制備、鹽酸賽庚啶標準品的制作、鹽酸賽庚啶酶標抗體工作液的制備、洗滌液的制備、底物液A的制備、底物液B的制備、終止液的制備。
[0007]其進一步特征在于:所述的鹽酸賽庚啶包被抗原是將鹽酸賽庚啶半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到的，該載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA);用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將鹽酸賽庚啶抗原稀釋成1:40000比例，100 μ?/孔，37°C放置2 h，取出酶標板甩掉板內液體，用稀釋后的濃縮洗滌液300 μ?7孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，150 μ?7孔，37°C放置1.5 h，棄去封閉液，拍干后的酶標板放置恒溫間(25°C )晾干；抽檢合格后將酶標板真空密封后置4°C下保存。
[0008]所述的鹽酸賽庚唆標準品濃度分別為0 ppb、0.1 ppb、0.3 ppb、0.9 ppb、2.7 ppb、
8.1 ppbo
[0009]鹽酸賽庚啶酶標抗體工作液的制備:采用辣根過氧化酶偶聯(lián)鹽酸賽庚啶單克克隆抗體所得到，該酶標抗體工作液用抗體稀釋液稀釋成1:20000。
[0010]所述底物液A為含有0.5 mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液；所述底物液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液；所述終止液為2 mol/L的硫酸；所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，其包含0.5%吐溫-20，0.01mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間。
[0011]鹽酸賽庚啶的ELISA試劑盒的檢測方法，基于抗原抗體進行直接競爭酶聯(lián)免疫反應，該方法包括以下步驟:
(1)預處理待測樣品，即將待測試的樣品處理為液體樣品，或者用有機溶劑提取待測樣品，并將其復溶于樣品稀釋液工作液中；
(2)將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20?25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻；
(3)取包被有鹽酸賽庚啶抗原的酶標板，加標準品/樣本50μ?7孔到對應的微孔中；
(4)加入酶標抗體工作液，50μ?7孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25°C避光環(huán)境中反應30 min ；
(5)小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液300μ?7孔，充分洗滌4次，浸泡15-30 s,用吸水紙拍干；
(6)加入底物液A50 μ?ν孔，底物液B 50 μ?ν孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應15 min ；
(7)加入終止液50μ?/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450 nm處或雙波長450/630nm檢測，測定每孔吸光度值(請在5 min內讀完數(shù)據(jù))；
(8)以標準品測試的吸光度值與標準品的濃度對數(shù)值繪制標準曲線，對照標準曲線計算樣品中鹽酸賽庚啶的含量。
[0012]其中，所述處理后的樣品是經過以下處理的樣品:
取5 mL樣品于干凈的玻璃試管中，加入2mL色譜純的正己烷，蓋上蓋后振蕩3 min，然后靜置，待分層后取上層清液1 mL，于干凈的玻璃器皿室溫氮氣吹干，吹干后用lmL 35%的甲醇復溶后待測。
[0013]本發(fā)明采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法來檢測。用于檢測鹽酸賽庚啶的ELISA試劑盒的測定原理:樣品中的鹽酸賽庚啶與酶標板上固定的抗原特異性競爭酶標抗體，通過酶催化顯色劑顯色，根據(jù)顯色的深淺來判斷樣品中鹽酸賽庚啶的含量。如果樣品中的鹽酸賽庚啶含量少，顯色深；反之，則顯色淺。本發(fā)明的試劑盒檢測方法操作簡便，檢測靈敏、準確、快速，適用于大批量樣品的檢測。
【附圖說明】
[0014]圖1為鹽酸賽庚啶標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0015]檢測鹽酸賽庚啶的ELISA試劑盒，其包括酶標板、鹽酸賽庚啶標準品、鹽酸賽庚啶酶標抗體工作液、底物液A、底物液B、終止液和濃縮洗滌液。
[0016]下面具體描述本發(fā)明中檢測鹽酸賽庚啶的ELISA試劑盒的制備，
鹽酸賽庚啶蛋白質偶聯(lián)物的制備:
將鹽酸賽庚啶半抗原與載體蛋白BSA按12:1的結合比混合在0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液(CBS)中，然后加入入碳二亞胺，攪拌1?2h，置室溫反應24 h，最后用0.2mol/L pH 7.6的PBS透析兩天，除去未反應的半抗原，即可得到鹽酸賽庚啶蛋白質偶聯(lián)物。
[0017]鹽酸賽庚啶抗體的制備:
選用3月齡健康大白兔，通過三次免疫，每次鹽酸賽庚啶蛋白質偶聯(lián)物免疫原用量為50 μδ/0.05 mL，每次免疫間隔時間為2周。初次免疫分別將免疫抗原與費氏佐劑及不安全佐劑等量混合，勁部皮下多點注射，二次、三次免疫直接注入腹腔。融合前3天每只腹腔注入25 Pg鹽酸賽庚啶蛋白質偶聯(lián)物進行加強免疫，免疫后第6 d耳靜脈取血，采用直接競爭ELISA法測定效價。取得較高效價后用半抗原直接在大腿肌肉注射，8 d后頸動脈采全血，分離抗血清，采用辛酸-硫酸銨法純化抗體，制成凍干粉后于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0018]制備辣根過氧化物酶標記鹽酸賽庚啶單克隆抗體:采用過碘酸鹽氧化法。
[0019]制備包被有鹽酸賽庚啶包被抗原的酶標板:
酶標板包被鹽酸賽庚啶抗原，包被抗原是將鹽酸賽庚啶半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到的，該載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA);用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將鹽酸賽庚啶抗原稀釋成1:40000比例，100 μ?/孔，37°C放置2 h，取出酶標板甩掉板內液體，用稀釋后的濃縮洗滌液300 μ?/孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，150 μ?7孔，37°C放置1.5 h，棄去封閉液，拍干后的酶標板放置恒溫間(25°C )晾干；抽檢合格后將酶標板真空密封后置4°C下保存。
[0020]所述的鹽酸賽庚唆標準品配制濃度分別為0 ppb、0.1 ppb、0.3 ppb、0.9 ppb、2.7
ppb、8.1 ppbo
[0021]所述的鹽酸賽庚啶酶標抗體工作液的制備:采用辣根過氧化酶偶聯(lián)鹽酸賽庚啶單克克隆抗體所得到，該酶標抗體工作液用抗體稀釋液稀釋成1:20000。
[0022]所述底物液A為含有0.5 mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液；所述底物液B為四甲基