一種檢測苯二氮卓類藥物殘留試劑盒的制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是檢測苯二氮卓類的酶聯(lián)免疫試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]BZD是一類作用突出的化合物，具有抗驚厥、抗焦慮、松弛肌肉和安眠的臨床作用，且毒性較小。國外在70年代對BZD食欲促進(jìn)劑做了大量深入的研究，試驗(yàn)了 1500中化合物對動(dòng)物攝食的影響，發(fā)現(xiàn)多種BZD化合物可促進(jìn)動(dòng)物攝食，其中乙磺氟安定的效果最為顯著。肌注、灌服及日糧添加均可有效增加健康動(dòng)物特別是反芻動(dòng)物的攝食量及攝食頻率，提高日攝食量。近幾年來有些飼料企業(yè)為了追求飼料的轉(zhuǎn)化率和高額利潤，在飼料中隨意添加鎮(zhèn)靜、催眠類違禁藥物。醫(yī)學(xué)界已經(jīng)證實(shí)畜禽產(chǎn)品中的激素及其它合成藥物的連用與殘留往往與人類常見的疾病問題及某些食品中毒有關(guān)。
[0003]目前，BZD的測定方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層層析法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等，其檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但儀器設(shè)備比較昂貴，且樣本前處理過程相對復(fù)雜。酶聯(lián)免疫吸附法是一種準(zhǔn)確、可靠、快速、特異的檢測方法，適合于大批樣品的快速篩選，近年來已廣泛應(yīng)用于食品安全檢測行業(yè)。本發(fā)明旨在建立一種檢測BZD的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服色譜法的不足，本發(fā)明提供一種檢測BZD的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法。該方法靈敏、準(zhǔn)確、快速，操作簡便、特異性強(qiáng)，適用于大批樣品的快速檢測。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明檢測玉BZD的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括酶標(biāo)板、BZD標(biāo)準(zhǔn)品、BZD抗體工作液、BZD酶標(biāo)二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液、濃縮稀釋液和濃縮洗滌液。
[0007]本發(fā)明檢測苯二氮卓類的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備，包括以下步驟:酶標(biāo)板的制備、BZD標(biāo)準(zhǔn)品的制備、玉BZD抗體工作液的制備、BZD酶標(biāo)二抗工作液的制備、底物液A的制備、底物液B的制備、終止液的制備、濃縮稀釋液的制備和濃縮洗滌液的制備。
[0008]其進(jìn)一步特征在于:所述的酶標(biāo)板經(jīng)由BZD抗原包被制備，具體步驟是將BZD半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到包被抗原，用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將BZD包被抗原稀釋成1:3200比例，100 μ L/孔，37°C避光孵育2 h，取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，加入經(jīng)稀釋的濃縮洗滌液300 μ L/孔，洗板2次，30 s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液，150 yL/孔，37°C放置1.5 h，甩掉封閉液直接拍干，拍干后的酶標(biāo)板放置恒溫間(25°C)晾干，抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封于4°C條件下保存。
[0009]BZD標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0 ng/mL、5 ng/mL、10ng/mL、20 ng/mL、50ng/mL、100ng/mL。
[0010]所述BZD抗體工作液是采用BZD人工抗原免疫小鼠得到單克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋成1:12000比例制備。
[0011]所述BZD酶標(biāo)二抗工作液由酶標(biāo)二抗加稀釋液稀釋成1:3000比例，所述底物液A為含有0.5 mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，所述底物液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液，所述終止液為2 mol/L的硫酸，所述濃縮稀釋液是10倍濃縮稀釋液，為0.1 mol/L的PBS，pH值范圍7.0-7.5之間，所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，為含 0.5% 吐溫-20，0.1 mol/L 的 PBST, pH 值范圍 7.0-7.5 之間。
[0012]檢測BZD的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法，基于抗原抗體的間接競爭酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理，該方法包括以下步驟:
(1)預(yù)處理待測樣品，即將待測試的樣品處理為液體樣品，或者用有機(jī)溶劑提取待測樣品，并將其復(fù)溶于樣品稀釋液中；
(2)將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20?25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻；
(3)取包被有BZD抗原的酶標(biāo)板，加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本60μ L/孔到對應(yīng)的微孔中，加入BZD抗體工作液,40 μ L/孔,輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25°C避光環(huán)境中反應(yīng)30 min ;用洗滌工作液250 μ L/孔，充分洗滌4~5次，每次間隔10 s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)；
(4)再加入BZD酶標(biāo)二抗工作液，100μ L/孔，然后小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250 μ L/孔，充分洗滌4~5次，每次間隔10 s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)；
(5)加入底物液A50 μ L/孔，底物液B 50 μ L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)30 min ；
(6)加入終止液50μ L/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處或雙波長450/630nm檢測，測定每孔吸光度值(請?jiān)? min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))；
(7)以的標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ppb)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中BZD的含量。
[0013]其中，所述待測樣品用以下方法進(jìn)行預(yù)處理:
配制樣品復(fù)溶液(甲醇:1M HCL=9:1)稱量3g樣品，研磨成粉。加入樣品復(fù)溶液6ml混合，以4000r/min,離心lOmin.取上層液進(jìn)行氮吹。加入1ml正己燒及1ml樣復(fù)進(jìn)行復(fù)溶。以4000r/min離心5min,去除上層，取下層進(jìn)行分析。
[0014]本發(fā)明檢測BZD的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法的測定原理:樣品中的BZD與酶標(biāo)板上固定的抗原特異性競爭抗體，加入酶標(biāo)二抗，與抗體反應(yīng)，通過酶催化顯色劑顯色，根據(jù)顯色的深淺來判斷樣品中BZD的含量。如果樣品中的BZD含量少，顯色深；反之，則顯色淺。本發(fā)明的試劑盒檢測方法操作簡便，檢測靈敏、準(zhǔn)確、快速，適用于大批量樣品的快速檢測。
【附圖說明】
[0015]圖1為苯二氮卓類的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0016]BZD蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的制備:
采用琥珀酸酐法得到帶羧基的BZD半抗原衍生物，之后取0.05 mmol與載體蛋白BSA按10:1的結(jié)合比混合在0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液(CBS)中，然后加入0.15 mmol碳二亞胺，攪拌置室溫反應(yīng)24 h，最后于0.2 mol/L pH 7.6的PBS緩沖液中透析兩天，除去未反應(yīng)的半抗原，將得到的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液于_20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0017]BZD抗體的制備:
選用健康成年純種BALA/C小鼠，取與蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備的免疫抗原50μ g與等量完全弗氏佐劑混合采用腹腔注射進(jìn)行初次免疫，之后每隔3周用相同劑量免疫抗原加等量不完全弗氏佐劑采用腹腔注射進(jìn)行二次、三次免疫，每次免疫6天后尾靜脈采血測定抗血清效價(jià)至一定滴度后，用相同劑量不加佐劑進(jìn)行末次免疫，3天后取脾制備脾細(xì)胞懸浮液與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系進(jìn)行克隆化，選擇處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行凍存，用于腹水制備，先腹腔注射0.5 ml液體石蠟于BALB/C鼠致敏，2周后腹腔注射1X106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7-10天后可產(chǎn)生腹水，待腹水盡可能多時(shí)用注射器抽取腹水，反復(fù)收集數(shù)次，4000 rpm離心15 min,收集上清，采用辛酸-硫酸銨法純化腹水對單克隆抗體進(jìn)行純化，冷凍干燥得凍干粉后于-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0018]制備包被有BZD包被抗原的酶標(biāo)板:
包被抗原是將BZD半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到的，用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將BZD抗原稀釋成1:3200比例，100 μι/孔，37 °C放置2 h，取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，用稀釋后的濃縮洗滌液250 μ?/孔，洗板2次，30s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，150 μ?7孔，37°C放置1.5 h，棄去封閉液，拍干后的酶標(biāo)板放置恒溫間(25°C)晾干，抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封后置4°C下保存。
[0019]BZD 標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度分別為 0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20ng/mL、50 ng/mL、100ng/mLo
[0020]BZD抗體工作液的制備:采用BZD人工抗原免疫小鼠得到單克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋成1:12000比例制備。
[0021]BZD酶標(biāo)二抗工