基于磁珠包被抗體的微流控芯片及捕獲心肌標(biāo)志物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及免疫磁珠包被結(jié)合抗體領(lǐng)域，尤其涉及一種基于磁珠包被抗體的微流 控芯片及捕獲心肌標(biāo)志物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，微流控技術(shù)在生化分析、免疫診斷、環(huán)境檢測等領(lǐng)域具有重要進(jìn)展，如在精 細(xì)控制流速的前提下，控制抗原抗體反應(yīng)，從而達(dá)到對(duì)免疫反應(yīng)的高靈敏度控制。通過范德 華力、靜電吸附、高分子包埋等手段心肌抗體被包被于反應(yīng)微室中，進(jìn)行抗原捕獲。為達(dá)到 即時(shí)檢測的目的，微通道中通過高傳質(zhì)達(dá)到免疫底物充分的混合，進(jìn)而存在包被抗體復(fù)溶 于流體系統(tǒng)及被流體中抗原捕獲脫離包被基材等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本專利目的是提供一種基于磁珠包被抗體的微流控芯片及捕獲心肌標(biāo)志物的方 法，高靈敏度地捕獲樣本中心肌標(biāo)志物（抗原）的存在。通過對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理和平衡，如 紅細(xì)胞的去除、pH平衡、本底背景消除，最后獲得體系相似的反應(yīng)體系進(jìn)入檢測室進(jìn)行目標(biāo) 捕獲，防止包被抗體復(fù)溶于流體系統(tǒng)及被流體中抗原捕獲脫離包被基材。
[0004] 為達(dá)到以上目的，本申請采用免疫磁珠捕獲法，實(shí)現(xiàn)微流控芯片和基于該芯片的 捕獲心肌標(biāo)志物的方法。免疫磁珠捕獲法是一種將磁珠磁場響應(yīng)能力與免疫特異性相結(jié)合 的新型免疫學(xué)技術(shù)。免疫磁珠具有固相化試劑特質(zhì)及免疫學(xué)反應(yīng)高靈敏度、高專一性等優(yōu) 點(diǎn)，在免疫學(xué)檢測、微生物檢測、細(xì)胞分離等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。利用合成結(jié)構(gòu)含鐵，免疫磁珠可 被磁場牽引，其表層具有特異性功能團(tuán)，可與具有生物活性蛋白進(jìn)行化學(xué)基團(tuán)的共價(jià)結(jié)合， 作為抗體承載體。免疫反應(yīng)中磁珠包被抗體與具有契合決定簇的抗原結(jié)合，從血漿等復(fù)雜 體系中高效地分離，并且被標(biāo)記有標(biāo)識(shí)物的抗體所識(shí)別定量檢測。
[0005] 本發(fā)明第一方面提供一種微流控芯片，包括：
[0006] 加樣室、Y型結(jié)構(gòu)通道和回收室；
[0007] Y型結(jié)構(gòu)通道分為上部的漏斗狀通道和下部的柱形通道；所述漏斗狀通道的底部 為免疫標(biāo)記模塊；免疫標(biāo)記模塊上部為濾血模塊；
[0008] 下部的柱形通道底端分岔為一對(duì)并行的免疫通道；每個(gè)免疫通道末端連接一個(gè)回 收室；
[0009] 柱形通道設(shè)置上下兩個(gè)腔室，上部腔室為強(qiáng)磁室，下部腔室為質(zhì)控室。
[0010] 優(yōu)選的，所述濾血模塊為玻纖或無紡布材料。
[0011] 優(yōu)選的，所述濾血模塊以兔抗人紅細(xì)胞蛋白與凝集素按質(zhì)量比2:1處理，凍干制 得。
[0012] 優(yōu)選的，所述濾血模塊中間部位還包括結(jié)合抗體的免疫磁珠，所述免疫磁珠經(jīng)過 活化劑活化。
[0013] 優(yōu)選的，所述微流控芯片強(qiáng)磁室處的底部嵌有強(qiáng)磁片。
[0014] 本發(fā)明第二方面提供一種捕獲心肌標(biāo)志物的方法，所述方法應(yīng)用于上述任一實(shí)施 例所述的微流控芯片，所述方法包括：
[0015] 制作包被有能與血液中心肌標(biāo)志物特異性結(jié)合的抗體的免疫磁珠；
[0016] 對(duì)所述心肌標(biāo)志物的對(duì)位抗體標(biāo)記免疫標(biāo)識(shí)物；
[0017] 將包被抗體的免疫磁珠輸入所述芯片的濾血模塊，將標(biāo)記對(duì)位抗體的免疫標(biāo)識(shí)物 輸入免疫標(biāo)記模塊；
[0018] 將一定量心肌標(biāo)記物樣本與平衡液的混合液加至加樣室；
[0019] 啟動(dòng)檢測設(shè)備，反應(yīng)預(yù)設(shè)時(shí)間，對(duì)預(yù)定檢測項(xiàng)目結(jié)果進(jìn)行檢測。
[0020] 優(yōu)選的，不同的心肌標(biāo)志物具有不同的磁珠包被體系。
[0021] 優(yōu)選的，不同的心肌標(biāo)志物具有不同的標(biāo)識(shí)物；
[0022] 所述標(biāo)識(shí)物包括：量子點(diǎn)、焚光微球和膠體金。
[0023] 優(yōu)選的，所述心肌標(biāo)志物包括：心肌肌鈣蛋白cTnl、肌紅蛋白MY0、C反應(yīng)蛋白CRP、 心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白FABP、N端腦鈉肽前體NT-proBNP、髓過氧化物酶ΜΡ0。
[0024] 優(yōu)選的，所述心肌標(biāo)志物為心肌肌鈣蛋白cTnl時(shí)，包被抗體的免疫磁珠的制備包 括：
[0025] 免疫磁珠平衡MES緩沖液至所述MES緩沖液的pH為4~5,離子強(qiáng)度為0. 1M;
[0026] 在平衡PH后的溶液中，分別加入EDC和NHS，至EDC與NHS在溶液中的濃度均為 lmg/mL，反應(yīng)20分鐘后離心棄上清；
[0027] 以所述平衡前的MES緩沖液復(fù)溶棄上清后的沉淀物；
[0028] 復(fù)溶得到的溶液中加入抗體8E10至所述抗體8E10的濃度為0. 5mg/mL;
[0029] 混合包被1小時(shí)，加入BSA至所述BSA的濃度為1 %終止反應(yīng)。
[0030] 優(yōu)選的，所述心肌標(biāo)志物為心肌肌鈣蛋白cTnl時(shí)，所述心肌標(biāo)志物標(biāo)記免疫標(biāo)識(shí) 物包括：
[0031] lmg量子點(diǎn)平衡pH為7. 5~8. 5、濃度0. 01M的PBS緩沖液至所述量子點(diǎn)的濃度 為 0·lmg/mL;
[0032] 在平衡后的溶液中，分別加入EDC與NHS，至所述EDC和NHS的濃度均為0. 5mg/mL， 活化30分鐘后離心棄上清；
[0033] 以所述平衡前的PBS緩沖液復(fù)溶棄上清后的沉淀物；
[0034] 在復(fù)溶后的溶液中，加入抗體7G2，標(biāo)記20分鐘，加入BSA至所述BSA的濃度為1 % 終止反應(yīng)。
[0035] 優(yōu)選的，所述心肌標(biāo)志物為肌紅蛋白ΜΥ0時(shí)，包被抗體的免疫磁珠的制備包括：
[0036] 免疫磁珠平衡PB緩沖液至緩沖液的pH為7~8,離子強(qiáng)度為0. 1M;
[0037] 在平衡后的溶液中分別加入EDC與NHS，至所述EDC與NHS的濃度均為lmg/mL，反 應(yīng)20分鐘后離心棄上清；
[0038] 以所述平衡前的PB緩沖液復(fù)溶棄上清后沉淀物；
[0039] 在復(fù)溶得到的溶液中，加入抗體4E2至所述抗體4E2的濃度為0. 5mg/mL，混合包被 1小時(shí)，加入BSA至所述BSA的濃度為1 %終止反應(yīng)。
[0040] 優(yōu)選的，所述心肌標(biāo)志物為肌紅蛋白ΜΥ0時(shí)，所述心肌標(biāo)志物標(biāo)記免疫標(biāo)識(shí)物包 括：
[0041] lmg熒光微球平衡pH為7~9、濃度0. 01M的PBS緩沖液至熒光微球的濃度為 0.lmg/mL；
[0042] 在平衡后的溶液中分別加入EDC與NHS，至所述EDC與NHS的濃度均為0. 5mg/mL， 活化30分鐘后離心棄上清；
[0043] 以所述平衡前的PBS緩沖液復(fù)溶棄上清后的沉淀物；
[0044] 在復(fù)溶后的溶液中，加入抗體ΜΥ0,標(biāo)記20分鐘，加入BSA至所述BSA的濃度為1 % 終止反應(yīng)。
[0045] 優(yōu)選的，所述心肌標(biāo)志物為C反應(yīng)蛋白CRP時(shí)，包被抗體的免疫磁珠的制備包括：
[0046] 免疫磁珠平衡MES緩沖液至pH為4. 5~5. 5,離子強(qiáng)度為0. 1M;
[0047] 在平衡后的溶液中分別加入EDC與NHS，至所述EDC與NHS的濃度均為lmg/mL，反 應(yīng)20分鐘后離心棄上清；
[0048] 以所述平衡前的MES緩沖液復(fù)溶棄上清后的沉淀物，加入抗體CRP135至所述抗體 CRP135在復(fù)溶后的溶液中的濃度為0. 5mg/mL;
[0049] 混合包被1小時(shí)，加入BSA至所述BSA在復(fù)溶后的溶液中的濃度為1 %終止反應(yīng)。
[0050] 優(yōu)選的，所述心肌標(biāo)志物為C反應(yīng)蛋白CRP時(shí)，所述心肌標(biāo)志物標(biāo)記免疫標(biāo)識(shí)物包 括：
[0051 ] 40nm膠體金溶液以1(20)3溶液平衡至膠體金溶液pH為8. 5-9. 5 ;
[0052] 在平衡后的溶液中加入抗體CRP36,標(biāo)記1小時(shí)；
[0053] 標(biāo)記1小時(shí)后，在溶液中加入BSA至所述BSA的濃度為1 %終止反應(yīng)；
[0054] 終止反應(yīng)后離心，以離子強(qiáng)度為0. 1M、pH為7~9的PBS緩沖液復(fù)溶至終止反應(yīng) 時(shí)溶液體積的〇. 1倍。
[0055] 優(yōu)選的，所述標(biāo)志物為心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白FABP時(shí)，包被抗體的免疫磁珠的制 備包括：
[0056] 免疫磁珠平衡MES緩沖液至緩沖液pH為4~5，離子強(qiáng)度0. 1M;
[0057] 平衡后的溶液中分別加入EDC與NHS，至所述EDC和NHS的濃度均為lmg/mL，反應(yīng) 20分鐘后離心棄上清；
[0058] 以所述平衡前的MES緩沖液復(fù)溶棄上清后的沉淀物，在復(fù)溶后的溶液中加入抗體 FABP5B5至濃度為1.Omg/mL，混合包被1小時(shí)，加入BSA至BSA濃度為1 %終止反應(yīng)。
[0059] 優(yōu)選的，所述標(biāo)志物為心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白FABP時(shí)，所述心肌標(biāo)志物標(biāo)記免疫 標(biāo)識(shí)物包括：
[0060] lmg量子點(diǎn)平衡pH為7~8、濃度為0· 01M的PBS溶液至量子點(diǎn)濃度為0·lmg/mL;
[0061] 在平衡后的溶液中分別加入EDC與NHS，至EDC與NHS在溶液中的濃度均為0. 5mg/ mL，活化30分鐘后，離心棄上清；
[0062] 將棄上清之后的沉淀物以所述平衡前的PBS溶液復(fù)溶，加入抗體FABP28標(biāo)記20 分鐘；
[0063] 加入BSA至所述BSA濃度為1 %終止反應(yīng)。
[0064] 優(yōu)選的，所述心肌標(biāo)志物為N端腦鈉肽前體NT-proBNP時(shí)，包被抗體的免疫磁珠的 制備包括：
[0065] 免疫磁珠平衡PBS緩沖液至緩沖液的pH為6~7,離子強(qiáng)度為0. 01M;
[0066] 在平衡后的溶液中分別加入EDC與NHS，至所述EDC與NHS在溶液中的濃度均為 lmg/mL，反應(yīng)20分鐘后離心棄上清；
[0067] 以所述平衡前的PBS緩沖液復(fù)溶棄上清后的沉淀物，加入抗體18H5至所述抗體 18H5在復(fù)溶后的溶液中的濃度為lmg/mL;
[0068] 混合包被1小時(shí)，加入BSA至所述BSA復(fù)溶后的溶液中的濃度為1 %終止反應(yīng)。
[0069] 優(yōu)選的，所述心肌標(biāo)志物為N端腦鈉肽前體NT-proBNP時(shí)，所述心肌標(biāo)志物標(biāo)記免 疫標(biāo)識(shí)物包括：
[0070]lmg量子點(diǎn)平衡pH為7. 5-8. 5、濃度為0·01M的PBS緩沖液至量子點(diǎn)的濃度0·lmg/ mL；
[0071] 在平衡后的溶液中分別加入EDC與NHS，至所述EDC和NHS的濃度分別為0.5mg/ mL，活化30分鐘后離心棄上清；
[0072] 以所述平衡前的PBS緩沖液復(fù)溶棄上清之后的沉淀物，加入抗體15F11，標(biāo)記30分 鐘，加入BSA至所述BSA在復(fù)溶后的溶液中的濃度為1 %終止反應(yīng)。
[0073] 優(yōu)選的，所述心肌標(biāo)志物為髓過氧化物酶ΜΡ0時(shí)，包被抗體的免疫磁珠的制備包 括：
[0074] 免疫磁珠平衡PB緩沖液至溶液pH為7. 5~8. 5,離子強(qiáng)度0· 01M;
[0075] 在平衡后的溶液中分別加入EDC與NHS，至EDC與NHS在溶液中的濃度均為lmg/ mL，反應(yīng)20分鐘后離心棄上清；
[0076] 以所述平衡前的PB緩沖液復(fù)溶棄上清后的沉淀物，在復(fù)溶后的溶