振蕩混懸30-60min，使磁珠充分活化，磁 分離，去上清，用0. 〇25mol/L的pH值為4.5-6的2-嗎啉乙磺酸緩沖液10mL重懸，加入4-8mg的 鏈霉親和素，室溫混懸16_20h，再進(jìn)行磁分離，去上清，用百分比濃度0.5%的牛血清白蛋 白，百分比濃度0.5%脫脂奶粉和百分比濃度0.05%吐溫-20的2-嗎啉乙磺酸緩沖液10mL重 懸，室溫條件下混勾2~3h，再磁分離，去上清，用磁微粒緩沖液稀釋重懸到0.5mg/mL，在2~ 8°C下平衡16~24h，室溫條件下混勻2~3h后，使用超聲振蕩儀將混懸液中聚集成團(tuán)的磁珠 分散成單顆粒狀態(tài)，得到所述Anti-Jo-lIgG磁分離試劑。
[0035]進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供所述清洗液的制備步驟：
[0036] 加800mL純化水、12.1g的Tris和8.5g的NaCl于1L容器中，攪拌至完全溶解，再加入 5g的吐溫-20和5g的TritonlOO，攪拌，直至完全混勻，將pH值調(diào)為7.5-8.0，定容1L，使用0.2 μπι濾器過濾，將獲得的所述清洗濃縮液保存在2-8°C待用，使用前將所述清洗液按照每 7.5mL加純化水至lOOmL比例稀釋并混勻。
[0037]本發(fā)明還提供了一種使用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光定量檢測抗Jo-Ι抗體IgG的試劑盒的檢 測方法，所述試劑盒的檢測方法包括以下步驟：
[0038]步驟1.將Anti-Jo-lIgG校準(zhǔn)品放到全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測試位置，得到由 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀輸出的擬合曲線；
[0039]步驟2.將Anti-Jo-lIgG質(zhì)控品放到上述分析儀測試位置，得到由全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光 免疫分析儀輸出的所述質(zhì)控品的測試發(fā)光值和通過步驟1得到的擬合曲線擬合得到Anti-Jo-lIgG質(zhì)控品的濃度值；
[0040] 步驟3.將待測樣品放到上述分析儀測試位置，由所述分析儀自動(dòng)按1:20將樣品稀 釋，得到由全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀輸出的待測樣品的濃度值。
[0041] 進(jìn)一步，本發(fā)明提供了所述的一種使用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光定量檢測抗Jo-Ι抗體IgG 的試劑盒的檢測方法，所述步驟1、步驟2和步驟3均包括全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀的全自 動(dòng)檢測步驟：
[0042]步驟1)加20yL校準(zhǔn)品或質(zhì)控品或1:20稀釋后的待測標(biāo)本至檢測管中；
[0043] 步驟2)加50yL的Anti-Jo-lIgG試劑1號至步驟1)所述檢測管中，混勻后，37±0.5 °C 溫育 lOmin;
[0044] 步驟3)加 50yL的Anti-Jo-1 IgG磁分離試劑至步驟2)所述檢測管中，混勾后，37 土 0.5°C溫育5min，進(jìn)行磁分離，去上清；
[0045]步驟4)加300yL的清洗液至檢測管中，混勻，進(jìn)行磁分離去上清；
[0046] 步驟5)重復(fù)步驟4)兩遍；
[0047] 步驟6)加150yL的Anti-Jo-1 IgG試劑2號至檢測管中，混勻后，37±0.5°C溫育 10min，進(jìn)行磁分離去上清；
[0048]步驟7)加300yL的清洗液至檢測管中，混勻，進(jìn)行磁分離去上清；
[0049] 步驟8)重復(fù)步驟7)兩遍；
[0050]步驟9)加200yL的化學(xué)發(fā)光底物至檢測管中，混勻，檢測發(fā)光強(qiáng)度。
[0051]與現(xiàn)有技術(shù)相比，優(yōu)越效果在于：
[0052] 1、所述試劑盒中的Anti-Jo-ι IgG 試劑1 號、Anti-Jo-ι IgG 試劑2號、Ant i-J〇-l IgG 磁分離試劑是該反應(yīng)體系下的更優(yōu)配方，給該試劑盒的使用效期及檢測性能提供了有力保 障；
[0053] 2、所述試劑盒中的Anti-Jo-lIgG磁分離試劑參與反應(yīng)時(shí)間僅為5分鐘，可大限度 地避免非特異性吸附；
[0054] 3、所述試劑盒中的Anti-Jo-1 IgG磁分離試劑為高分散性的超順磁性微粒，保證磁 微粒在保存和使用過程中完全不會(huì)發(fā)生聚集；
[0055] 4、所述試劑盒中的Anti-Jo-lIgG試劑2號中的堿性磷酸酶可催化發(fā)光底物發(fā)光， 且5秒鐘即達(dá)發(fā)光反應(yīng)平臺(tái)期，并保持平穩(wěn)的光信號，保證高檢測精度和效率。
[0056] 5、所述試劑盒中的Anti-Jo-lIgG試劑2號是堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人多克隆抗 體，羊抗人多克隆抗體的使用，降低了試劑盒的成本；
[0057] 6、本試劑盒成功避免與抗nRNP/Sm抗體、抗Sm抗體、抗SS-A抗體、抗SS-B抗體、抗 Sc 1-70抗體、抗著絲點(diǎn)抗體的交叉反應(yīng)；
[0058] 7、所述試劑盒中的待測標(biāo)本需要量為1:20倍稀釋后的20yL標(biāo)本，降低了試劑盒的 成本；
[0059] 8、所述檢測方法在傳統(tǒng)的膜條免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法的基礎(chǔ)上，將靈敏度和線 性范圍在提高3-5個(gè)數(shù)量級、實(shí)現(xiàn)真正意義的定量檢測，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好 等特點(diǎn)；
[0060] 9、所述檢測方法配合全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)使用，操作簡便，結(jié) 果判斷客觀等優(yōu)點(diǎn)，對于臨床診斷具有重要價(jià)值，應(yīng)用前景廣闊。
【附圖說明】
[0061] 圖1為本發(fā)明所述抗Jo-Ι抗體IgG的試劑盒的空白限評價(jià)測試中A，B點(diǎn)連點(diǎn)擬合曲 線不意圖；
[0062]圖2為本發(fā)明所述的抗Jo-Ι抗體IgG的試劑盒線性范圍評價(jià)的曲線圖；
[0063]圖3為本發(fā)明所述的試劑盒的磁微粒化學(xué)發(fā)光定量測定血清檢測結(jié)果與商品化的 抗Jo-Ι抗體IgG檢測試劑盒酶聯(lián)免疫吸附法檢測結(jié)果的相關(guān)性評價(jià)。
[0064]圖3中的橫坐標(biāo)X為對比方法的試劑盒樣品測值，濃度單位為RU/mL，縱坐標(biāo)y為所 述試劑盒樣品測值，濃度單位為RU/mL。
【具體實(shí)施方式】
[0065] 實(shí)施例1
[0066] -種使用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光定量檢測抗Jo-Ι抗體IgG的試劑盒，該試劑盒包括： Anti-Jo-1 IgG 校準(zhǔn)品、Anti-Jo-1 IgG 試劑1 號、Anti-Jo-1 IgG 試劑2 號、Anti-Jo-1 IgG 磁分離 試劑、Ant i-Jo-1 IgG質(zhì)控品和清洗液。
[0067] 本發(fā)明所述試劑盒的分析性能評價(jià)：
[0068] 1)準(zhǔn)確度評價(jià)
[0069]將濃度約為200RU/mL，允許其濃度偏差為±20 %的抗Jo-Ι抗體IgG樣品A加入到血 清或其他相應(yīng)基質(zhì)的樣品B中，所加入A的體積不超過總體積A+B的10%，根據(jù)公式（1)計(jì)算 回收率R，本方法的回收率在85-115%范圍內(nèi)，數(shù)據(jù)參見表1。
[0070]
[0071] R:回收率；
[0072] V:樣品A液的體積；
[0073] Vo:樣品B液的體積；
[0074] C:樣品B液加入樣品A液后的檢測濃度；
[0075] Co:測量樣品B液的濃度；
[0076] Cs:樣品A液的濃度。
[0077] 表1-準(zhǔn)確度評價(jià)一添加回收實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
[0078]
?
[0079] 2)空白限評價(jià)
[0080] 用零濃度校準(zhǔn)品作為樣品進(jìn)行檢測，重復(fù)測定20次，得出20次測量結(jié)果的RLU，RLU 為相對發(fā)光值，計(jì)算其平均值Μ和標(biāo)準(zhǔn)差SD，得出M+2SD所對應(yīng)的RLU值，根據(jù)零濃度校準(zhǔn)品 與相鄰校準(zhǔn)品之間的濃度-RLU值結(jié)果進(jìn)行兩點(diǎn)回歸擬合得出一次方程，將M+2SD所對應(yīng)的 RLU值帶入上述方程中，求出對應(yīng)的濃度值，即為空白限。本方法的空白限不大于IRU/mL。具 體數(shù)據(jù)參見表2，A、B點(diǎn)連點(diǎn)擬合曲線如圖1所示。
[0081] 表2空白限評價(jià) 「00821
[0083] 3)線性范圍評價(jià)
[0084]將接近線性范圍上限為200RU/mL的高值樣品按一定比例稀釋為至少5種濃度，其 中低值濃度的樣品須接近線性范圍的下限。按試劑盒說明書進(jìn)行操作，對每一濃度的樣品 均重復(fù)檢測2次，計(jì)算其平均值，將結(jié)果平均值和稀釋比例用最小二乘法進(jìn)行直線擬合，并 計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)r，本方法的線性范圍為2~200RU/mL，相關(guān)系數(shù)r應(yīng)2 0.9900。數(shù)據(jù)參見 表3和曲線見圖2。
[0085] 表3線性范圍評價(jià)
[0086]
[0087] 4)重復(fù)性評價(jià)
[0088] 取本實(shí)施例中的試劑盒重復(fù)檢測濃度為20±4RU/mL和100±20RU/mL的樣品各10 次，計(jì)算10次測量結(jié)果的平均值Μ和標(biāo)準(zhǔn)差SD，根據(jù)公式CV = SD/M X 100 %得出變異系數(shù)CV， 本方法變異系數(shù)(CV)不大于8%。數(shù)據(jù)參見表4。
[0089] CV = SD/MX100%......(2)
[0090] 式中：CV-變異系數(shù);SD -10次測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差;Μ -10次測量結(jié)果的平均值。
[0091] 表4重復(fù)性評價(jià)
[0092]
[0093]~5)批間差評價(jià) '
' '
[0094] 將實(shí)施例的試劑盒取三批，每批試劑盒均測定濃度在20 ± 4RU/mL和100 ± 20RU/mL 范圍內(nèi)的樣品，每批重復(fù)測定10次，計(jì)算30次測定結(jié)果的平均值(Μ)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，根據(jù)公 式(3)計(jì)算變異系數(shù)(CV)，本方法變異系數(shù)(CV)不大于15%。數(shù)據(jù)參見表5。
[0095] CV = SD/MX100%......(3)
[0096] 公式中：CV-變異系數(shù);SD-30次測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差;Μ-30次測定結(jié)果的平均值。 [0097] 表5批間差評價(jià)
[0098]
[0099] 6)特異性評價(jià)
[0100] 取6份Anti-Jo-lIgG含量為0的樣品，分別加入抗nRNP/Sm抗體、抗Sm抗體、抗SS-A 抗體、抗SS-B抗體、抗Scl-70抗體、抗著絲點(diǎn)抗體，使樣品中交叉反應(yīng)物濃度為200RU/mL，使 用該試劑盒對該樣品進(jìn)行檢測，測定樣品中的Anti-Jo-lIgG含量。結(jié)果見表6,本方法與抗 nRNP/Sm抗體、抗Sm抗體、抗SS-A抗體、抗SS-B抗體、抗Sc 1 -70抗體、抗著絲點(diǎn)抗體無交叉反 應(yīng)。
[0101] 表6特異性實(shí)驗(yàn)
[0102]
[0103] 7)相關(guān)性評價(jià)
[0104] 用實(shí)施例的試劑盒和商品化的抗Jo-1抗體IgG檢測試劑盒酶聯(lián)免疫吸附