operm/Cytof ix試 劑300μ1，固定、穿孔15min;PBS漂洗3次，每次5分鐘，之后加入wash buffer 300μ1，封閉 30min;加入CK8/18/19、Q)45-抗混懸液300μ1，兩種一抗均以wash buffer稀釋，混勾后的 終濃度為1:250，室溫下孵育45min;Wash buffer冼滌3次，每次5分鐘，之后加入二抗混懸液 300μ1，兩種二抗均以wash buffer稀釋，混勾后的終濃度為1:500，室溫下避光孵育30min; Wash buffer洗滌3次，每次5分鐘，之后加入Hoechst 300μ1，洗染細(xì)胞核5min;PBS漂洗2次， 每次3分鐘，之后取出濾膜7置于載玻片上，滴加10μ1抗熒光淬滅封閉液封片;熒光顯微鏡下 2h內(nèi)觀察結(jié)果，拍照、記錄CTC情況(如實驗組1觀察到CTC則應(yīng)用實驗組2進(jìn)行下一步檢測）。 [0063]檢測結(jié)果:8例健康志愿者均未查到循環(huán)腫瘤細(xì)胞;在8例晚期乳腺癌患者外周血 中有6例檢測到CTC存在。
[0064]三、運(yùn)用細(xì)胞蠟塊技術(shù)制作薄層切片：
[0065] 從過濾裝置中取下實驗2組中檢測到CTC編號的濾器3,打開并移走濾器上口 6,將 循環(huán)腫瘤細(xì)胞染色液加入到濾器3中，染色2min，PBS緩沖液沖洗干凈，用眼科鑷子取下濾膜 7，放置在載玻片上，適當(dāng)干燥后在顯微鏡下觀察，證實存在CTC;
[0066] 將上述載玻片上的濾膜7取下，置于脫色液中浸泡4-6小時，脫去CTC染色液，所述 脫色液為:95%酒精與100%二甲苯按體積比1:1混勻；浸泡結(jié)束后取出濾膜7,用吸水紙包 裹;將包裹物置于10%中性福爾馬林中，固定4_6h;固定結(jié)束后取出包裹物，脫水后置于石 蠟包埋盒中，浸蠟包埋制作細(xì)胞石蠟塊;用切片機(jī)將細(xì)胞石蠟塊連續(xù)切片，制成厚度為2-4μ m的薄層切片。
[0067]四、通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的ER表達(dá)情 況：
[0068]將獲取的石蠟切片應(yīng)用行免疫組織化學(xué)法檢測ER基因的表達(dá)情況，將切片在60°C 恒溫箱中烤片2小時，切片于兩瓶二甲苯中分別放置5分鐘，將切片依次在無水乙醇、95%乙 醇、85%乙醇中分別放置1分鐘(視室內(nèi)溫度情況稍作調(diào)整）：自來水、蒸餾水沖洗；
[0069]抗原修復(fù):根據(jù)第一抗體說明書及具體實驗操作經(jīng)驗，對實驗切片使用不同的方 法進(jìn)行抗原修復(fù)，本實驗使用EDTA(PH=9.0)高壓熱修復(fù):在電磁爐上將高壓鍋內(nèi)的修復(fù)液 (EDTA)煮沸，放入切片至完全沒入修復(fù)液蓋上高壓鍋蓋及壓力閥，800W加熱至高壓鍋噴氣 后1.5分鐘，離火，將高壓鍋稍冷卻打開鍋蓋，切片在修復(fù)液中自然冷卻，然后用蒸餾水沖 洗，沖洗后去除內(nèi)源性過氧化物酶：（采用過氧化物酶的檢測系統(tǒng)，必須進(jìn)行內(nèi)源性過氧化 物酶封閉處理，如果不進(jìn)行處理，組織中的紅細(xì)胞、粒細(xì)胞會干擾染色結(jié)果的判定)本實驗 用3%H202作用切片10分鐘，對染色結(jié)果集抗原保存都沒有影響，封閉效果比較顯著，蒸餾 水沖洗，PBS浸洗5次各1.5分鐘，滴加 ER-抗，4°C冰箱中過夜，然后將其放入PBS浸洗5次，每 次浸洗1.5分鐘；滴加二抗，37°C水浴鍋中孵育20分鐘，PBS浸洗5次各1.5分鐘，顯微鏡下控 制，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木精染液復(fù)染2分鐘，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，自來水沖洗5分 鐘，75%-95%-100%梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性快干膠封片，2-3名細(xì)胞病理學(xué)專家 閱片，判讀ER表達(dá)情況。
[0070] 檢測結(jié)果:8例健康志愿者均未查到循環(huán)腫瘤細(xì)胞;在8例晚期乳腺癌患者外周血 檢測到的CTC，其中6例經(jīng)免疫組化檢測到其有ER表達(dá)，陽性率為75.0% (表1)。
[0071] 圖4為乳腺癌患者外周血分離獲取的循環(huán)腫瘤細(xì)胞影像圖，其細(xì)胞核較大，細(xì)胞核 形狀不規(guī)則;高核質(zhì)比。
[0072] 圖5為乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞ER免疫組化染色圖像，細(xì)胞膜和細(xì)胞漿黃 染。根據(jù)其染色分布和強(qiáng)度判定陽性程度，細(xì)胞著色占細(xì)胞小于10%為(_)，著色1〇%_25% 為(+ )，著色25%-50%為(++)，著色大于50%為(+++)。
[0073]表1實施例檢測結(jié)果(ER)
[0074]
【主權(quán)項】
1. 一種晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞ER基因的檢測方法，其特征在于，利用膜 過濾裝置分離獲取晚期乳腺癌患者外周血中的CTC;鑒定晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤 細(xì)胞;運(yùn)用細(xì)胞蠟塊技術(shù)制作薄層切片;進(jìn)而檢測晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的 ER表達(dá)情況。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞ER基因的檢測方法，其 特征在于，所述的膜過濾裝置包括濾器(3)、血樣容器(2)、廢液缸(5)和鐵架臺（1)，所述鐵 架臺（1)設(shè)有底座（11)、立架（12)和支架（13)，所述血樣容器(2)通過支架（13)設(shè)置于鐵架 臺（1)上部，血樣容器(2)的下方為濾器(3)，濾器(3)通過輸液器(4)聯(lián)通至廢液缸(5)，廢液 缸(5)設(shè)置于底座（11)上。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞ER基因的檢測方法，其 特征在于:所述濾器(3)包括濾器上口（6)、濾膜(7)、載濾膜平臺（8)和濾器下口（9)，濾膜 (7)置于載濾膜平臺8上;濾器上口（6)接血樣容器(2)，濾器下口（9)通過輸液器(4)接廢液 缸(5)。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞ER基因的檢測方法，其 特征在于:所述濾膜(7)為疏水材料制成，其上均勻布滿口徑為10微米的濾孔(10)。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞ER基因的檢測方法，其 特征在于，所述的利用膜過濾裝置分離獲取晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞，步驟如 下： 1) 采集晚期乳腺癌癥患者外周血:肘正中靜脈5ml; 2) 將外周血樣進(jìn)行預(yù)處理:將采集的外周血樣10倍稀釋，稀釋液成分EDTA+ 0.1 %BSA，稀釋后用4%多聚甲U全固定外周血樣10分鐘； 3) 利用膜過濾裝置分離外周血樣，富集外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞:將預(yù)處理的外周血樣加 入到膜過濾裝置的血樣容器(2)中，使其依靠重力自然過濾； 4) 過濾結(jié)束后，從膜過濾裝置中取下濾器（3)，PBS沖洗2-3次，外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞被 截留在濾膜(7)上。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞ER基因的檢測方法，其 特征在于，所述的鑒定晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞，步驟如下： 1) 向分離獲取外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的濾器(3)中加入Cytoperm/Cytof ix試劑300μ1，固 定、穿孔15min; 2. PBS漂洗3次，每次5分鐘，之后加入wash buffer 300μ1，封閉30min; 3) 加入CK8/18/19、CD45-抗混懸液300μ1，三種一抗均以washbuffer稀釋，混勻后的終 濃度為1:250，室溫下孵育45min; 4. Wash buffer洗滌3次，每次5分鐘，之后加入二抗混懸液300μ1，三種二抗均以wash buffer稀釋，混勻后的終濃度為1:500,室溫下避光孵育30min; 5. Wash buffer洗滌3次，每次5分鐘，之后加入Hoechst 300μ1，洗染細(xì)胞核5min; 6. PBS漂洗2次，每次3分鐘，之后取出濾膜(7)置于載玻片上，滴加10μ1抗熒光淬滅封閉 液封片； 7) 熒光顯微鏡下2h內(nèi)觀察結(jié)果，拍照、記錄CTC情況，確定是否存在CTC。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞ER基因的檢測方法，其 特征在于，所述的運(yùn)用細(xì)胞蠟塊技術(shù)制作薄層切片，步驟如下： 1) 外周血過濾后，從過濾裝置中取下濾器(3)，打開并移走濾器上口（6)，將循環(huán)腫瘤細(xì) 胞染色液加入到濾器(3)中，染色2min，PBS緩沖液沖洗干凈，用眼科鑷子取下濾膜(7)，放置 在載玻片上，適當(dāng)干燥后在顯微鏡下觀察，證實存在CTC; 2) 制作薄層切片： A、 脫色:將上述帶有CTC的濾膜(7)從載玻片上取下，置于95 %酒精與100 %二甲苯按體 積比1:1混勻的脫色液中浸泡4-6小時，脫去CTC染色液； B、 包裹:浸泡結(jié)束后取出濾膜(7 )，用吸水紙包裹； C、 固定:將包裹物置于10 %中性福爾馬林中，固定4-6h; D、 浸蠟包埋：固定結(jié)束后取出包裹物，脫水后置于石蠟包埋盒中，浸蠟包埋制作細(xì)胞石 錯塊； E、 薄層切片:用切片機(jī)將細(xì)胞石蠟塊連續(xù)切片，制成厚度為2-4μπι的薄層切片。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞ER基因的檢測方法，其 特征在于，所述的檢測晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的ER表達(dá)情況，步驟如下： 1) 烤片:CTC蠟塊薄層切片在60°C恒溫箱中烤片2小時； 2) 脫蠟:切片于兩瓶二甲苯中分別放置5分鐘； 3) 水化:將切片依次在無水乙醇、95 %乙醇、85 %乙醇中分別放置1分鐘，自來水、蒸餾 水沖洗； 4) 抗原修復(fù):將高壓鍋內(nèi)的修復(fù)液EDTA煮沸，放入切片至完全沒入修復(fù)液蓋上高壓鍋 蓋及壓力閥，加熱至高壓鍋噴氣后1.5分鐘，離火，將高壓鍋稍冷卻打開鍋蓋，切片在修復(fù)液 中自然冷卻； 5) 蒸餾水沖洗； 6) 去除內(nèi)源性過氧化物酶:用3 % H202作用切片10分鐘； 7) 蒸餾水沖洗； 8 )PBS浸洗5次各1.5分鐘； 9) 滴加 ER-抗，4°C冰箱中過夜，然后將其放入PBS浸洗5次，每次浸洗1.5分鐘； 10) 滴加二抗； 11) 37°C水浴鍋中孵育20分鐘； 12 )PBS浸洗5次各1.5分鐘； 13) 顯微鏡下控制，DAB顯色； 14) 自來水沖洗，蘇木精染液復(fù)染2分鐘，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)； 15) 自來水沖洗5分鐘； 16) 75 % -95 % -100 %梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性快干膠封片。 17) 細(xì)胞病理學(xué)專家閱片，判讀ER表達(dá)情況。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞ER基因的檢測方法：利用膜過濾裝置分離獲取晚期乳腺癌患者外周血中的CTC；利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)鑒定晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞；運(yùn)用細(xì)胞蠟塊技術(shù)制作薄層切片；進(jìn)而通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的ER表達(dá)情況。借助于ISET技術(shù)分離富集CTCs，依靠細(xì)胞免疫熒光技術(shù)鑒定CTCs，克服了單純ISET技術(shù)鑒定CTCs存在的困難和單純免疫學(xué)檢測技術(shù)存在的假陰性。該技術(shù)設(shè)備要求不高，方法易掌握，并能實時監(jiān)測。通過該技術(shù)方法，不用取材乳腺癌組織即可檢測到晚期乳腺癌患者ER表達(dá)情況。
【IPC分類】G01N33/574, G01N33/68
【公開號】CN105510600
【申請?zhí)枴緾N201610058960
【發(fā)明人】孫萍, 戴亮, 李勝, 王振丹
【申請人】山東省藥物研究院
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2016年1月28日