專利名稱：鼠抗人T淋巴細(xì)胞CD₃表面抗原單克隆抗體及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鼠抗人T淋巴細(xì)胞CD3表面抗原單克隆抗體及其制備方法和用 途，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
再生障礙性貧血(簡稱再障，AA)是由多種原因引起的骨髓造血功能衰 竭性疾病，臨床上呈全血細(xì)胞減少。近年來研究表明，免疫功能紊亂與再障 的發(fā)病密切相關(guān)。已知某些病毒、藥物及射線等因素與再障發(fā)病有關(guān)。隨著 經(jīng)濟(jì)建設(shè)的發(fā)展，環(huán)境生活因素的影響，我國再障的發(fā)病率逐漸增高，尤多 發(fā)生于青壯年、嬰幼兒，嚴(yán)重影響國民生產(chǎn)力及國民體質(zhì)健康。再障分急性 型(AAA)和慢性型(CAA)兩類，又根據(jù)臨床表現(xiàn)分為嚴(yán)重型(SAA)和極重 型(VSAA)。 SAA與VSAA發(fā)病急，進(jìn)展快，易出現(xiàn)嚴(yán)重出血、感染，死亡率高。 CAA以貧血為主，經(jīng)常出血，反復(fù)感染，長期遷延不愈，部分患者輸血要求頻 繁，CAA也可突然病情加劇，演變成SAA加速死亡。目前對(duì)再障的治療還沒有 特效藥物，再障至今被視為難治之癥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是通過雜交瘤技術(shù)，利用Balb/c小鼠以胎兒胸腺細(xì)胞進(jìn)行免 疫，用其脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合篩選出一特異性單抗，即鼠抗人T淋巴細(xì) 胞CD:,表面抗原單克隆抗體(簡稱抗CD3單抗)。該抗體作為細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)劑， 在臨床上可制成鼠抗人T淋巴細(xì)胞CD3表面抗原單克隆抗體注射液(MMA3)，主 要用于治療再障及其他細(xì)胞免疫功能紊亂性疾病，其療效顯著，副作用輕微， 復(fù)發(fā)率低。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是首先利用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)以胎兒胸腺細(xì)胞作 為免疫原，利用Balb/c小鼠進(jìn)行免疫，制備雜交瘤細(xì)胞，即保藏于中國典型 培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏號(hào)為CCTCC N0:C200803的抗T淋巴細(xì)胞單克 隆抗體雜交瘤細(xì)胞株CD3。然后將該雜交瘤細(xì)胞注射入Balb/c小鼠體內(nèi)，抽 取腹水產(chǎn)生鼠抗人T淋巴細(xì)胞CD3表面抗原單克隆抗體。
本發(fā)明涉及到的雜交瘤細(xì)胞已于2008年3月14日保存于中國典型培養(yǎng) 物保藏中心CCTCC，保存號(hào)為C200803,名稱為抗T淋巴細(xì)胞單克隆抗體雜 交瘤細(xì)胞株CD3。
本發(fā)明是通過以下過程實(shí)現(xiàn)的
一、 雜交瘤細(xì)胞CCTCC N0:C200803的產(chǎn)生
1、 制備免疫原在超凈臺(tái)內(nèi)無菌條件下取胎兒胸腺細(xì)胞作為免疫原。
2、 免疫第一次免疫用2X1()7胸腺細(xì)胞，腹腔注射，加強(qiáng)免疫二次，每 次間隔3周，融合前3天做末次免疫。
3、 融合與克隆化Balb/c小鼠經(jīng)胎兒胸腺細(xì)胞腹腔注射免疫后，取脾細(xì) 胞與Sp2/0細(xì)胞與50%PEG作用下融合后，置HAT選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加 Balb/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作飼養(yǎng)細(xì)胞，5天后可見集落長成，10—12天后換 HT培養(yǎng)液，待集落生長至孔面積1 / 4左右時(shí)，取上清以APAAP法進(jìn)行細(xì)胞株 篩選，得到抗體分泌陽性的雜交瘤細(xì)胞即抗T淋巴細(xì)胞單克隆抗體雜交瘤細(xì) 胞株CD3。
二、 由上述雜交瘤細(xì)胞CCTCC N0:C200803分泌的鼠抗人T淋巴細(xì)胞CD3 表面抗原單克隆抗體的制備通過以下步驟實(shí)現(xiàn)的
(1) 預(yù)注射液體石蠟
用酒精棉球消毒小鼠腹部皮膚，每只腹腔注射0. 5ml石蠟；
(2) 細(xì)胞擴(kuò)培
將獲得的雜交瘤細(xì)胞CCTCC N0:C200803接種到培養(yǎng)瓶中孵箱培養(yǎng)擴(kuò)增，收集細(xì)胞；
(3) 接種細(xì)胞
將上步收集到的細(xì)胞用生理鹽水稀釋調(diào)至lXl()6-3X106個(gè)/m1,每只小 鼠腹腔注射0.5ml;
(4) 采集腹水
挑出接種細(xì)胞后7-12天的小鼠抽腹水；腹水經(jīng)澄清、分子篩柱層析純化 后即可獲得鼠抗人T淋巴細(xì)胞CD3表面抗原單克隆抗體。
上述步驟獲得的鼠抗人T淋巴細(xì)胞CD3表面抗原單克隆抗體可進(jìn)一步制 成鼠抗人T淋巴細(xì)胞CD3表面抗原單克隆抗體注射液(MMA3),臨床上主要用于 治療再生障礙性貧血。
本發(fā)明臨床前研究.-
1. 藥效學(xué)研究表明，畫A3對(duì)PBMNC無致絲裂作用，對(duì)無造血系統(tǒng)疾病者的 骨髓CFU-GM及再生障礙性貧血患者骨髓CFU-CM的體外生長有明顯激活作用， 并呈雙向作用。
2. 藥理學(xué)研究表明，在高于臨床擬用劑量條件下，MMA3對(duì)貓的精神神系統(tǒng) 以及血壓、呼吸、心電等均無影響。
3. 藥代動(dòng)力學(xué)表明，IgG,在體內(nèi)存留8.3天，大部分時(shí)間分布于實(shí)驗(yàn)動(dòng) 物的組織中(占總停留時(shí)間的53%)，分布體積超過了血漿和間質(zhì)液體積，給 藥后迅速分布于多數(shù)器官，肝、脾、肺的平衡時(shí)間分別〈2.6min，腸道分布 較慢(<20min)，肌肉分布最慢(260min)，血漿濃度分布比>0.5%，在肌 肉中該比值〉0. 18，降解主要在腸道(72.8%)，其次是肝(20.5%)，脾(3.6 % )。在抗體被降解或分泌之前至少在體液組織之間進(jìn)行2. 8次/g組織器官重 量的循環(huán)。
4. 急性毒性實(shí)驗(yàn)表明，小鼠分別經(jīng)尾靜脈、皮下給藥未能測(cè)出LDs。；當(dāng)以 MMA:,最高濃度、最大給藥體積給藥后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未出現(xiàn)毒性反應(yīng)癥狀，I.V.和S.C.給藥的LD5。均大于90mg/kg，表明MMA3急性毒性甚低。
5. 亞急性毒性實(shí)驗(yàn)表明，小鼠給予臨床擬用劑量的40-90倍的MMA3后， 未見對(duì)小鼠產(chǎn)生明顯毒性作用。小鼠靜脈連續(xù)大劑量給藥的毒性很低。
6. 慢性毒性實(shí)驗(yàn)表明，連續(xù)注射給大鼠MMA3l2天后，多數(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物即可 產(chǎn)生抗醒A:，抗體。在連續(xù)給藥期及停藥觀察3個(gè)月期間，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般行 為、癥狀無明顯改變；血液學(xué)與血生化指標(biāo)，系統(tǒng)解剖與病理組織學(xué)以及骨 髓象學(xué)檢查項(xiàng)目均未見毒性反應(yīng)癥狀，與溶媒對(duì)照組比較均無明顯差異。結(jié) 果表明固A3對(duì)大鼠無明顯毒性作用。
7. 全身過敏實(shí)驗(yàn)表明，固A3對(duì)豚鼠無致敏作用。
8. 連續(xù)給藥的局部刺激性實(shí)驗(yàn)表明，MMA3連續(xù)給藥對(duì)給局部無刺激性作用。
9. 致突變實(shí)驗(yàn)表明，薩A3對(duì)人二倍體細(xì)胞無致突變作用。 MMA:,I期臨床研究表明，副作用輕微，安全性較好。
MMA:,根據(jù)《藥品注冊(cè)管理辦法》規(guī)定屬生物制品二類新藥，經(jīng)國家藥品監(jiān) 督管理局批準(zhǔn)進(jìn)行臨床研究[批件號(hào)為(1999)制申體字第34號(hào)]，目前已完 成I期臨床研究，進(jìn)入II期臨床研究，進(jìn)一步觀察其安全性和療效。由鄭州 大學(xué)第一附屬醫(yī)院作為組長單位(原河南醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)，河北醫(yī)科
大學(xué)第二醫(yī)院、蘭州大學(xué)第一醫(yī)院、濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院、蘭州軍區(qū)總醫(yī)院等作 為參加單位為本產(chǎn)品進(jìn)行多中心、隨機(jī)、雙肓雙模擬、平行對(duì)照的臨床研究。 本發(fā)明創(chuàng)新點(diǎn)
1.MMA3為一新型抗CD3單抗。本發(fā)明以胎兒胸腺細(xì)胞作為免疫原，通過鼠-鼠B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備得到了 MMA3雜交瘤細(xì)胞株。獲得的MMA3雜交瘤 細(xì)胞株經(jīng)山東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院鑒定，結(jié)果證明其為識(shí)別T淋巴細(xì)胞分化抗 原CD:,的單抗；抗CD3單抗經(jīng)中國藥品生物制品檢所檢定證明MMA3為鼠IgG1; MMA:,半成品、成品經(jīng)中國藥品生物制品檢定所檢定合格。MMA3為特異性明確的抗人T淋巴細(xì)胞CD凌面抗原的單克隆抗體，與己知的OKT汲WuT3單克隆抗體 識(shí)別抗原的不同表位，對(duì)正常骨髓粒-巨噬祖細(xì)胞(CFU-GM)體系生長有明顯 激活作用，且呈雙向調(diào)節(jié)作用特征。
2.薩A3純化方法獨(dú)特，重復(fù)性好，收率高。固A3純化方法選用了小鼠腹水 離心、過濾澄清，100%飽和度(NH4) 2S04沉淀離心，色譜層析。在色譜層析 方法的選擇上，發(fā)明人比較了離子交換、親和層析、分子排阻、疏水層析等 方法的優(yōu)缺點(diǎn)。離子交換層析在樣品上柱前需經(jīng)透析等手段除掉高鹽，增加 了操作步驟，且分離效果不理想。親和層析介質(zhì)成本高且不夠穩(wěn)定。而用分 子排阻介質(zhì)S印hacryl S-300 HR初步純化，洗脫液直接接上Phenyl S印harose 6 FF(high sub)進(jìn)行疏水層析(HIC)純化，可以在高鹽條件下上樣，在低鹽
條件下洗脫，得到的MMA3純度高且重復(fù)性好，其純化效果見表l。
表lMMA3純化結(jié)果匯總
產(chǎn)量回收率純度石蠟殘留量DNA殘留量純化
(mg)(%)(%)(mg/ml)(pg)倍數(shù)
100ml腹水2001002080〉1001
硫酸銨沉淀18090700.5〉1003.5
S-300HR1608091無<1004.6
HIC1507598無<1004.9
3.對(duì)適應(yīng)癥再障礙性貧血的選擇合理。發(fā)明人對(duì)薩A3治療AA的機(jī)理迷行 了一第系列的研究，結(jié)果表明，機(jī)體免疫調(diào)解機(jī)制紊亂在AA發(fā)病中起重要作 用，特別是無明顯誘因的患者。具體再現(xiàn)為a.T淋巴細(xì)胞亞群分布異常，CD8 +細(xì)胞比例的增大，CD4/CD8比值下降；b.異常細(xì)胞克?。籧.負(fù)造血調(diào)控因子(干 擾素Y、腫瘤壞死因子a等)表達(dá)增強(qiáng)；d.HLA-DR表達(dá)增強(qiáng)。
TCR/CD3復(fù)合體是T細(xì)胞特異性的主要調(diào)節(jié)者，抗TCR-CD3單克隆抗體能模 擬其重量性配體并與之結(jié)合，然而這些抗體導(dǎo)致T細(xì)胞呈現(xiàn)兩個(gè)相反效應(yīng)一T細(xì)胞的活化和抑制。MMA3用于治療就是基于抗CD3單克隆抗體的上述兩個(gè)生物 學(xué)效應(yīng)。MMA:,對(duì)正常及AA患者骨髓CFU-GM體外生長作用研究表明，MMA3對(duì)正 常及AA患者骨髓CFU-GM有明顯激活作用，且呈雙向調(diào)節(jié)效應(yīng)。本項(xiàng)目曾作 為科研項(xiàng)目，研究結(jié)果表明MMA甜AA的治療總有效率為79. 3。％,且起效迅速、 毒副作用較小。
MMA:，是國內(nèi)唯一主要用于治療再障的單抗制劑，美國0KT3和國內(nèi)WuT3產(chǎn) 品盡管在技術(shù)和質(zhì)量指標(biāo)上與畫A3有相同之處，但它們作用的抗原決定簇位 點(diǎn)與麗A.,不同(經(jīng)競爭抑制試驗(yàn)表明位點(diǎn)不同)，來源均是鼠源性，前兩者主 要用于治療器官移植中的抗排斥反應(yīng)。 治療典型病例
例一邢某，男，56歲，患慢性再障12年，經(jīng)常規(guī)治療多年無效，Hb 41g/L'WBC2.5X109， Pit 6X 109需輸血維持， 一周輸血200ml。經(jīng)用醒3治療 兩療程好轉(zhuǎn)，血常規(guī)基本恢復(fù)正常，無需輸血，繼用固A3鞏固治療一療程， 隨訪至今，情況良好。
例二趙某，男，45歲，患慢性再障3年，經(jīng)用司坦唑醇、達(dá)那唑、再 障升血片治療無好轉(zhuǎn)。麗A3治療兩療程好轉(zhuǎn)，隨訪至今，Hb 101g/L，WBC 4.5 X10 Plt 126X10、隨訪至今病情穩(wěn)定。
例三李某，女，12歲，患急性再障一月，高熱，Hb 32g/L,WBC 1.5X 109，Plt 11X109，用MMA3治療三療程好轉(zhuǎn)，Hb 100g/L，WBC 4.7X109,Plt 112 X109，至今情況良好。


附圖1為雜交瘤細(xì)胞制備基本程序框圖。 附圖2為MMA3生產(chǎn)技術(shù)路線框圖。
具體實(shí)施例方式
一、雜交瘤細(xì)胞CCTCC N0:C200803的產(chǎn)生1. 材料
① 親本細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞SP2/0，由澳大利亞引進(jìn)；Balb/c種屬，不合 成免疫球蛋白，染色體數(shù)為72條。
② 免疫親代細(xì)胞動(dòng)物種系與來源Balb/c小鼠，雄性，8 — 10周齡， 山東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
③ MMA:,細(xì)胞株免疫原——胎兒胸腺細(xì)胞胎兒胸腺來源于濟(jì)南市歷下區(qū) 人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，胎兒為女嬰，孕齡為7個(gè)月，系手術(shù)引產(chǎn)。胎兒母親李某， 年齡28歲，系第二胎，計(jì)劃生育引產(chǎn)；胎兒母親身體健康，HBsAg陰性，肝 功、血常規(guī)正常，問診無家族遺傳史。胎兒引產(chǎn)后尚有弱呼吸，無畸形，健 康0
2. 方法
2. 1制備免疫原在超凈臺(tái)內(nèi)無菌條件下先取出胎兒胸腺，獲取胎兒胸腺 細(xì)胞為免疫原。
2.2免疫第一次免疫用2X1()7胸腺細(xì)胞，腹腔注射，加強(qiáng)免疫二次，每 次間隔3周，融合前3天做末次免疫。
2. 3融合與克隆化Balb/c小鼠經(jīng)2乂107胎兒胸腺細(xì)胞腹腔注射免疫3 次，于末次免疫3天后，取脾細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞與50XPEG (分子量1540, Sigma)作用下融合后，置HAT選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加Balb/c小鼠腹腔巨噬 細(xì)胞作詞養(yǎng)細(xì)胞，5天后可見集落長成，10 —12天后換HT培養(yǎng)液，待集落生 長至孔面積1 / 4左右時(shí)，取上清以APAAP法進(jìn)行細(xì)胞株篩選，對(duì)抗體分泌陽 性的雜交瘤細(xì)胞以有限稀釋法進(jìn)行亞克隆3次，至所有亞克隆細(xì)胞均成陽性 反應(yīng)(陽性克隆率100%)。
2.4雜交瘤細(xì)胞檢定細(xì)胞核學(xué)特征檢査細(xì)胞分裂中期染色體，應(yīng)符合 雜交瘤細(xì)胞的核型。
①試劑秋水仙素；0. 075mol / L氯化鉀低滲溶液；細(xì)胞固定液(甲醇3份，冰乙酸l份)；姬姆氏染色液；樹脂
② 器材尖底離心管(lOml)，吸管，載玻片，蓋玻片，離心機(jī)(水平式 轉(zhuǎn)頭)，顯微鏡。
③ 方法在細(xì)胞傳代培養(yǎng)48小時(shí)后，加秋水仙素，最終濃度為0. 1 U g/ml， 繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。移入離心管，1000rpm離心10分鐘，棄上清液；加入5ml 預(yù)溫至37。C的0.075mol/L氯化鉀低滲液，用吸管吹打均勻，置37。C水浴20 分鐘；每管加入lml新鮮配制的固定液混勻，1000rpm離心10分鐘，棄上清 液。再加5ml固定液，靜止30分鐘后，1000r/min離心10分鐘，棄上清；沉 淀物中加5ml固定液，輕輕吹散細(xì)胞，吸取2—3滴細(xì)胞懸液，滴于預(yù)冷的潔 凈載玻片上，立即輕輕吹散，使細(xì)胞分布均勻，并在火焰上通過幾次，使細(xì) 胞平鋪于載玻片上，自然干燥；用姬姆氏染液染色10分鐘，經(jīng)自來水洗去染 色液，自然干燥，樹脂封片后，用顯微鏡檢測(cè)；每個(gè)標(biāo)本計(jì)數(shù)100個(gè)完整的 中期細(xì)胞核，記錄染色體數(shù)，分析染色體數(shù)的分布。并作顯微鏡攝影。
二、由上述雜交瘤細(xì)胞CCTCC N0:C200803分泌的鼠抗人T淋巴細(xì)胞CD3 表面抗原單克隆抗體的制備 l.材料
① 細(xì)胞培養(yǎng)用小牛血清支原體檢測(cè)應(yīng)為陰性，經(jīng)小量試驗(yàn)適于雜交瘤
細(xì)胞生長。
② 培養(yǎng)液采用RPMI — 1640培養(yǎng)液，G1BC0生產(chǎn)。
③ 化學(xué)試劑各種生產(chǎn)應(yīng)用化學(xué)試劑應(yīng)達(dá)到分析純化上。
0.4MNaCl:干烤NaC146. 752g，加無熱原水2000ml，用0.2MNaOH調(diào)pH 至6. 8-7.0;
0.2 MNaOH: NaOH4g，加無熱原水500ml;
100%飽和硫酸銨(ASA):硫酸銨400g，放入大燒杯中，加無熱原水500ml， 用電爐子加熱助溶，邊加熱邊攪拌至硫酸銨完全溶解，稍冷卻，過濾。④動(dòng)物種系與來源Balb/c小鼠，8周齡以上，由北京軍科院提供。制 備腹水動(dòng)物使用Balb/c小鼠，生產(chǎn)用鼠必需經(jīng)過檢査，應(yīng)無鼠源病毒污染， 并有合格證明。在腹水生產(chǎn)過程中如發(fā)現(xiàn)動(dòng)物不健康、咬傷、感染者均應(yīng)廢棄。
2.方法
2.1預(yù)注射液體石蠟。進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后，穿隔離服，戴好帽子、口罩、手 套，將適量液體石蠟倒入干烤過的小瓶內(nèi)，用酒精棉球消毒手套，用注射器 吸取適量石蠟，用酒精棉球消毒小鼠腹部皮膚，腹腔注射0. 5ml/只石蠟，(7 天之后注射細(xì)胞)作好標(biāo)記。
2.2接種細(xì)胞。
2. 2. 1物品高壓蒸汽滅菌小號(hào)培養(yǎng)瓶、彎頭吸管、直頭吸管、刻度吸管、 尖底離心管，121°C， 20min; 2.2.2無菌室紫外線消毒；
2.2.3打開水浴箱，設(shè)定39°C,水浴箱中放一盛開水的大燒杯，使其溫 度為39°C。
2.2.4復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞(需無菌操作)
2. 2. 5向小號(hào)培養(yǎng)瓶中加入含15%小牛血清的1640培養(yǎng)液10ml。
2. 2. 6用刻度吸管取8ml1640培養(yǎng)液，放入尖嘴離心管中。
2. 2. 7從液氮罐中取出要復(fù)蘇的細(xì)胞，迅速放入盛有39'C溫水的燒杯中，
再將燒杯迅速放入39。C水浴箱中，用鑷子夾住凍存管下部快速轉(zhuǎn)動(dòng)，使其迅
速融化(以稍稍帶一點(diǎn)冰核為好)。
2.2.8打開凍存管，用直頭吸管將其內(nèi)細(xì)胞液吸出，放入盛1640培養(yǎng)液
的尖底離心管中，混勻，蓋好蓋，用封口膜封住離心管口， 1000轉(zhuǎn)/分，離心
10min。
2.2.9離心后，在超凈臺(tái)內(nèi)棄去上清，吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液將離心底的細(xì)胞輕輕吹起，放入盛有培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，擰好瓶塞(不要太緊，以
擰開時(shí)稍有阻力為好)，輕輕晃勻，作好標(biāo)記(種類，日期)，放入37°CC02
孵箱培養(yǎng)。
2.2.10換液。4-6小時(shí)后，給剛復(fù)蘇的細(xì)胞換一次液。輕輕搖晃兩下培 養(yǎng)瓶，倒去培養(yǎng)液(視細(xì)胞多少來決定倒去多少培養(yǎng)液)，補(bǔ)加含15%小牛血 清的1640培養(yǎng)液至lOml，放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)。
2.3細(xì)胞擴(kuò)增。細(xì)胞經(jīng)幾次傳代后，選出效價(jià)高的擴(kuò)培制備腹水。
2.3.1物品高壓蒸汽滅菌大號(hào)培養(yǎng)瓶、彎頭吸管、刻度吸管；
2.3.2無菌室紫外線消毒。
2.3.3細(xì)胞擴(kuò)培(需無菌操作)。
2.3.4用彎頭吸管輕輕吹打細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。
2.3.5向大號(hào)培養(yǎng)瓶中加入適量細(xì)胞懸液(具體依細(xì)胞數(shù)量而定)。
2. 3. 6用刻度吸管分別向每個(gè)大號(hào)培養(yǎng)液中加入35ml含10%小牛血清的 1640培養(yǎng)液，輕輕搖勻，擰好瓶蓋，作好標(biāo)記(種類，日期)，放入孵箱培養(yǎng)。
2. 3. 7擴(kuò)培的細(xì)胞培養(yǎng)2-3天，觀察細(xì)胞生長情況，當(dāng)細(xì)胞幾乎覆蓋整 個(gè)瓶底時(shí)，開始收集。
2.3.8用彎頭吸管輕輕吹打細(xì)胞，動(dòng)作要輕，形成細(xì)胞懸液，倒入塑料 離心管中，蓋好蓋，用封口膜封口。
2.3.9離心1600轉(zhuǎn)/分，10min。
2.3.10洗滌在超凈臺(tái)內(nèi)棄掉上清，用生理鹽水吹打均勻，合并入l-2 個(gè)離心管里，加生理鹽水混勻，蓋好蓋，用封口膜封口， 1600轉(zhuǎn)/分離心10min。
2.3.11計(jì)數(shù)在超凈臺(tái)內(nèi)棄掉上清，離心管底部的細(xì)胞用生理鹽水作適 當(dāng)定量稀釋，顯微鏡下記數(shù)，然后用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度為1X106-3X106 個(gè)/ml，迅速送至動(dòng)物室給小鼠注射。
2.4接種細(xì)胞將培養(yǎng)的細(xì)胞調(diào)至1Xl()6個(gè)/ml，每只Balb/c小鼠腹腔注射0.5ml，注射細(xì)胞前要先搖勻，放射要迅速，細(xì)胞放置時(shí)間不宜過長， 記錄細(xì)胞種類、注射數(shù)量、日期等。
2.5釆集腹水挑出接種細(xì)胞后約7-12天，腹部脹大，變紫，四肢及尾 部發(fā)白，行動(dòng)遲緩，精神不振的小鼠待抽腹水。在超凈臺(tái)內(nèi)，用酒精棉球消 毒小鼠腹部皮膚，右手捏住針頭中間，斜面向上刺入小鼠腹腔，變換針頭同 小鼠的相對(duì)位置，使腹水快速流入離心管，可多次采集。抽取腹水時(shí)注意不 要觸及針頭兩端，離心管口及內(nèi)壁等，保證腹水不被熱原污染。
2.6腹水處理腹水內(nèi)含有紅細(xì)胞、細(xì)胞碎渣、纖維蛋白凝塊及脂質(zhì)等, 需離心除去。4°C， 3000轉(zhuǎn)/分，15分鐘，吸取上部澄清腹水放入無熱原鹽水 瓶內(nèi)，作好標(biāo)記，-2(TC凍存，沉渣棄去。
2. 7腹水在處理前需提前12小時(shí)從-2(TC拿出放4。C冰箱融化。
2. 8腹水處理
2.8.1吸取石蠟融化的腹水液面有一層石蠟，用無熱原吸管吸出棄掉， 盡量吸干凈。留樣檢測(cè)效價(jià)。
2.8.2腹水處理，Xml腹水加入Xml0.4MNaCl溶液，再加入2Xmll009()飽和 硫酸銨(少量多次加入，邊加邊搖勻)用氨水調(diào)pH至6. 8—7. 0， 4""C放置4小時(shí)
或過夜o
2.8.3在4。C， 10 000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，上清棄去(檢測(cè)效價(jià)為陰性)， 沉淀留下。
2. 9分子篩柱層析
① 柱型號(hào)35X1000 (mm)。
② 膠型號(hào)S印hacryl S-300 HR (Pharmacia) 750ml全部裝入，按說明
書裝膠。
③ 流量；3ml/min。
流動(dòng)相0. 2mNaCl (MMA8)或0.4mNaCl (MMA3) pH7.0。 '⑤ 上樣量1一5%柱床體積(7. 5 37. 5ml)，樣品中總蛋白濃度〈40mg/ml。
⑥ 樣品處理樣品沉淀用流動(dòng)相溶液吹打均勻，總體積在20 30ml左右為宜。
⑦ 加樣方式用無熱原移液管把樣品液沿繞柱內(nèi)壁小心的加入。不要沖 擊著膠表面，待樣品剛剛進(jìn)入膠面后，向柱內(nèi)加約10cm高流動(dòng)相，洗脫，收峰。
⑧ 膠在位清洗(每上3次樣約300rnl腹水清洗一次)沖無熱原水約300ml， 流速3ml/min —沖0. 2mNaOH 400ml，流速lml/min—沖無熱原水至pH為水 的pH值，流速lml/min —沖流動(dòng)相。
2. 10半成品檢定
上步中純化后得到的抗體進(jìn)行效價(jià)檢定、無菌試驗(yàn)、蛋白含量測(cè)定、熱 原試驗(yàn)、電泳等檢測(cè)。 2. 10. 1效價(jià)
① 細(xì)胞上清1:10; 1:20; 1:40; 1:80; 1:160
② 腹水1:10; 1:100; 1:1000; 1:2000; 1:4000; 1:8000; 1:16000
③ 銨沉上清1:10; 1:100; 1:200; 1:400
半成品、成品1:10; 1:100; 1:200; 1:400; 1:800; 1:1600
步驟
① 準(zhǔn)備片子將血膜片從-2(TC冰箱中取出，室溫下放置30min;打開包 裝，將正面對(duì)著風(fēng)扇吹干，約30min;
② 固定將固定液從4。C冰箱中取出，放入血膜片(保證所用的圈完全浸 入固定液中)固定30秒后立即用自來水沖洗(沖洗時(shí)要小心，防止將細(xì)胞沖 掉)，吹干；
③ 鏡檢在顯微鏡下觀察各圈內(nèi)的細(xì)胞，選出可使用的，用記號(hào)筆在小 圈的周圍畫上網(wǎng)格線，作好標(biāo)記； 加一抗把片子放在濕盒內(nèi)，將稀釋好的樣品即一抗，按稀釋倍數(shù)由 大到小依次加入各圈內(nèi)(注意不要使樣品溢出圈外相混，也不能太少，以免 樣品干涸)，室溫放置l小時(shí)；用pH7.2 ， 0.01MPBS緩沖液沖洗片子，吹干；
⑤ 加二抗向各圈中加二抗(羊抗鼠Ig抗血清)，在濕盒內(nèi)放置30min; 用pH7. 2 ， 0. 01M PBS緩沖液沖洗片子，吹干；
⑥ 加三抗向各圈中加三抗(鼠抗堿性磷酸酶)，在濕盒內(nèi)放置30min; 用pH7. 2 , 0. 01M PBS緩沖液沖洗片子，吹干；
⑦ 染色臨用時(shí)現(xiàn)配制顯色液(底物緩沖液lml加入堅(jiān)固紅lmg)，在混 合器上充分混勻(以稍顯橙黃色為宜)，立即滴加到每個(gè)小圈內(nèi)，將裝有片子 的濕盒放入37t:水浴箱內(nèi)作用30miri;自來水沖洗片子，吹干；
⑧ 復(fù)染向每個(gè)小圈中滴加復(fù)染液，作用30秒，立即用自來水沖洗干凈， 吹干；
⑨ 封片將封片劑用熱水溶解，滴在片子上，加蓋玻片封片(防止產(chǎn)生 氣泡)；
⑩ 觀察結(jié)果在顯微鏡下觀察細(xì)胞，陽性者細(xì)胞膜被染成玫瑰紅色，細(xì) 胞核被染成藍(lán)色。依據(jù)細(xì)胞膜被染色的程度由深到淺，依次用#、 +++、 ++、 +、 ±、一來表示。
2. 10.2無菌試驗(yàn)每個(gè)青霉素小瓶加3 4ml培養(yǎng)基，加lml藥液，37 。C培養(yǎng)48h。
2. 10. 3熱原試驗(yàn)兔熱原檢查法。在兔子耳朵靜脈注射MMAs量為2mg/kg。
① 選擇健康家兔雌雄均可，雌應(yīng)無孕，體重1.7—3.0kg，體重差異不 超過700g。
② 室溫變化《3。C,避免噪音干擾，室溫18—28'C。
③ 家兔在測(cè)試前1小時(shí)開始停食并置于家兔固家盒中，至試驗(yàn)完畢。
④ 溫度記錄用肛溫計(jì)插入肛門6cm，時(shí)間》1.5分鐘，記錄。⑤實(shí)驗(yàn)用器皿應(yīng)置烘箱中25(TC加熱30分鐘或18(TC加熱2小時(shí)。 (D正常體溫測(cè)定與家兔分組家兔固定至少1小時(shí)后，每隔30分鐘測(cè)體
溫一次， 一般測(cè)定兩次，兩次之差不超過0.2'C，以這兩次體溫平均值作為該
兔的正常體溫(38—39.6°0，各兔體溫之差不超過rc 2. 10.4蛋白質(zhì)含量測(cè)定
① 4呢碳酸鈉溶液。取4g碳酸鈉，加蒸餾水溶解成100ml
② 0. 2mol/L氫氧化鈉溶液。取0. 8g氫氧化鈉加蒸餾水溶解成100ml
③ 0. 04mol/L硫酸銅溶液。取0. 5gCuS04 5H20加蒸餾水溶解成50ml 2%酒石酸鉀(或酒石酸鈉)，加蒸餾水溶解成50ml
⑤ 堿性銅液。臨用前取試劑①和②各25ml，試劑③和④各0. 5ml混勻配制 而成。
⑥ 酚試劑稱取100g鎢酸鈉，25g鉬酸鈉，置1500ml燒杯瓶中，加入 700ml蒸餾水，50ml85y。磷酸及100ml濃硫酸，上聯(lián)回流管微沸回流10小時(shí)， 取下回流管，加入150g硫酸鋰，50ml蒸餾水，幾滴溴液，煮沸約15分鐘， 驅(qū)除過量的溴。冷卻，加蒸餾水稀釋至1000ml，過濾，為酚試劑貯備液。酚 試劑貯備液經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉滴定，測(cè)定酸濃度，而后用蒸餾水稀釋相當(dāng)lmol/L 鹽酸濃度，即為酚試劑。
⑦ 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。取牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)確稀釋至lmg/ml(含ml 于0.02呢NaN3)，為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)貯備液。精確量取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)貯備液2.5ml于 25ral容量瓶中，用含0.02%NaN3的蒸餾水稀釋至刻度，為標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液
(勤ug/ml)。
⑧ 樣品。精確量取一定體積樣品(含蛋白質(zhì)50ug左右)于試管中，加5ml 堿性銅溶液，混勻，于室溫放置10分鐘，快速加入0.5ml酚試劑，搖勻，于 室溫放置30分鐘，用650nm波長濾光片比色(呈色后，如發(fā)現(xiàn)渾濁，經(jīng)3000rpm 離心15分鐘后再比色)。⑨標(biāo)準(zhǔn)曲線。精確量取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(100ug/ml) 0、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 l,Oml，分別置于試管中，加蒸餾水補(bǔ)至lml，其余操作同樣品，可得一 標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2. 10. 5電泳還原及非還原SDS-PAGE法
① 濃縮膠濃度5%，分離膠濃度15%
② 濃縮膠電流15mA,分離膠電流20mA
③ 電極緩沖液50mol/L Tris-38m mol/L甘氨酸，PH8. 3， 0. 1%SDS
④ 電泳時(shí)間:lh
⑤ 樣品處理樣品與處理液3: 1混合，IO(TC， 3min，進(jìn)行還原和非還 原處理，上樣量每孔〉5.0ug
⑥ 染色方法考馬斯亮蘭染色。 2. 11過濾除菌 2.11.1過濾除菌前準(zhǔn)備工作
① 過濾前需干烤物品磨口瓶(2500ml) 2個(gè)；鹽水瓶若干；量筒；吸管； 刻度吸管；小燒杯；藥匙；青霉素瓶；NaCl;漏斗；鋼盤；飯盒；濾器；過
濾用玻璃管及套管。
② 過濾前需泡NaOH物品鹽水瓶塞；青霉素瓶塞；過濾管；密封墊。
③ 用干烤的鋼盤、無熱原水泡大濾膜。
④ 過濾前需高壓滅菌物品培養(yǎng)基；鹽水瓶；吸管；整套濾器。 2.11.2加保護(hù)劑檢定合格的半成品用相應(yīng)的流動(dòng)相稀釋至蛋白濃度為
0.5mg/ml，按O. 1% (V/V)的量加入吐溫-80，按2% (W/V)的量加入甘氨酸， 搖勻。
2.11.3過濾除菌在無菌條件下用0.22um微孔濾膜過濾除菌，先用無熱 原水預(yù)過濾，確保濾膜無破損后再過濾藥液，作無菌試驗(yàn)。 2. 12定量分裝2. 12. 1分裝前的準(zhǔn)備工作
① 分裝前需干烤物品安瓿瓶；小漏斗(裝在搪瓷缸內(nèi))；分裝瓶；飯盒; 磨口瓶(2500ml) 2個(gè)；大平皿、小平皿。
② 需泡雙氧水物品分裝器；針頭；針頭套。
③ 分裝前需高壓滅菌物品衣服；帽子；口罩；培養(yǎng)基；青霉素小瓶； 吸管；分裝用針頭；安瓿瓶；漏斗；整套分裝器。
2.12.2分裝在無菌條件下，5ml易折安瓿瓶定量分裝，5.0ml/支，即 為成品。過敏試驗(yàn)針為lml/支，200ug, 5支成品配1支。 2. 13成品檢定項(xiàng)目效價(jià)；無菌試驗(yàn)；熱原試驗(yàn)。
具體方法與半成品檢定方法一樣。 2. 14包裝，入庫。
權(quán)利要求
1、鼠抗人T淋巴細(xì)胞CD3表面抗原單克隆抗體，其特征在于，該抗體是由保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號(hào)為CCTCC NOC200803的抗T淋巴細(xì)胞單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株CD3分泌的單克隆抗體。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鼠抗人T淋巴細(xì)胞CD3表面抗原單克隆抗體， 其特征在于，制備方法步驟如下(1) 預(yù)注射液體石蠟 用酒精棉球消毒小鼠腹部皮膚，每只腹腔注射0.5ml石蠟；(2) 細(xì)胞擴(kuò)培將獲得的雜交瘤細(xì)胞CCTCC N0:C200803接種到培養(yǎng)瓶中孵箱培養(yǎng)擴(kuò)增， 收集細(xì)胞；(3) 接種細(xì)胞將上步收集到的細(xì)胞用生理鹽水稀釋調(diào)至1X106-3X106個(gè)/m1,每只小 鼠腹腔注射0.5ml;(4) 采集腹水挑出接種細(xì)胞后7-12天的小鼠抽腹水；腹水經(jīng)澄清、分子篩柱層析純化 后即可獲得鼠抗人T淋巴細(xì)胞CD3表面抗原單克隆抗體。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鼠抗人T淋巴細(xì)胞CD3表面抗原單克隆抗 體，其特征在于，所述抗體為IgG,亞類。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鼠抗人T淋巴細(xì)胞CD3表面抗原單克隆抗 體，其特征在于，可進(jìn)一步制成鼠抗人T淋巴細(xì)胞CD3表面抗原單克隆抗體注 射液(MMA:,)，臨床上主要用于治療再生障礙性貧血。
全文摘要
本發(fā)明公開了鼠抗人T淋巴細(xì)胞CD₃表面抗原單克隆抗體及其制備方法和用途。本發(fā)明利用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)以胎兒胸腺細(xì)胞作為免疫原，利用Balb/c小鼠進(jìn)行免疫，制備鼠抗人T淋巴細(xì)胞CD₃表面抗原單克隆抗體。然后利用該抗體在Balb/c小鼠體內(nèi)制備腹水，進(jìn)一步制成鼠抗人T淋巴細(xì)胞CD₃表面抗原單克隆抗體注射液(MMA₃)。該注射液在臨床上主要用于治療再生障礙性貧血，其療效顯著，副作用輕微，復(fù)發(fā)率低。
文檔編號(hào)A61P37/02GK101307109SQ200810016668
公開日2008年11月19日 申請(qǐng)日期2008年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月4日
發(fā)明者張傳林 申請(qǐng)人:張傳林