一種食源性致病菌分子生物學(xué)檢測試劑盒的評價(jià)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種分子生物學(xué)檢測試劑盒的評價(jià)技術(shù)，尤其涉及食源性致病菌分子生物學(xué)檢測試劑盒質(zhì)量評價(jià)方法。所述評價(jià)方法是基于核苷酸為檢測對象的試劑盒定性方法的確認(rèn)，應(yīng)驗(yàn)證以下參數(shù)：包容性和排他性、相對靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度、檢出限、耐變性和批間變異本發(fā)明的食源性致病菌分子生物學(xué)試劑盒的評價(jià)方法，可以更加客觀準(zhǔn)確地對此類試劑盒進(jìn)行必要的技術(shù)評價(jià)，以保證市場上流通的試劑盒性能指標(biāo)滿足相關(guān)要求。
【專利說明】一種食源性致病菌分子生物學(xué)檢測試劑盒的評價(jià)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種分子生物學(xué)檢測試劑盒的評價(jià)技術(shù)，尤其涉及食源性致病菌分子生物學(xué)檢測試劑盒質(zhì)量評價(jià)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]試劑盒在分析檢測工作中主要是作為一種快速篩查的方法而存在，開始時(shí)是以傳統(tǒng)經(jīng)典方法的替代方法出現(xiàn)的，幾乎所有的試劑盒方法在發(fā)現(xiàn)問題時(shí)都需要以傳統(tǒng)的檢測方法作為最終確認(rèn)的依據(jù)，因此，人們大多認(rèn)同試劑盒方法的一些方法學(xué)上的不穩(wěn)定性，比如假陽性率、假陰性率、定量精密度較差等等，并接受了這種可能的結(jié)果錯(cuò)誤。而恰恰是這種認(rèn)同使得人們忽視了對試劑盒方法進(jìn)行更為科學(xué)深入的方法學(xué)性能指標(biāo)探討，而這種忽視在一些敏感領(lǐng)域的分析中是十分危險(xiǎn)的。
[0003]試劑盒因操作方便，結(jié)果可快速獲得，呈現(xiàn)快速上升趨勢。但試劑盒的生產(chǎn)、銷售及認(rèn)證認(rèn)可體制尚不完善，我國還沒有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)或質(zhì)量評價(jià)政策，以及對試劑盒技術(shù)參數(shù)進(jìn)行評估的標(biāo)準(zhǔn)方法。一方面是試劑盒的發(fā)展向好，另一方面存在的問題也愈來愈突出。正是基于目前試劑盒產(chǎn)品的現(xiàn)狀，需要對試劑盒進(jìn)行規(guī)范管理，以保證市場上流通的試劑盒性能指標(biāo)滿足相關(guān)要求。食品領(lǐng)域是當(dāng)前問題最多、最受關(guān)注的領(lǐng)域，這個(gè)領(lǐng)域的檢測包括了物理、化學(xué)、微生物及分子生物學(xué)基礎(chǔ)理論，無論是按檢測原理、用途還是其它分類方式，涉及食品安全檢測項(xiàng)目的試劑盒的品種是最全最多的。因此，從該領(lǐng)域著手從事評價(jià)方法的研究，便于獲得基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)結(jié)果，并由此推廣至動植物檢疫及其它領(lǐng)域是十分必要也是很有意義的。
[0004]隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，其在生物檢測領(lǐng)域、醫(yī)學(xué)臨床檢測領(lǐng)域的應(yīng)用也日益推廣普及，已成為生物、醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域不可或缺的檢測技術(shù)。近年來相關(guān)隨著相關(guān)分析設(shè)備的日益自動化、智能化，使用到的試劑材料也更多地以配套試劑盒產(chǎn)品的形式出現(xiàn)。國內(nèi)外研發(fā)產(chǎn)品的速度日益加快，品種也不斷擴(kuò)大。從國內(nèi)市場上調(diào)研的產(chǎn)品情況，目前已商品化的食品分子生物學(xué)檢測試劑盒主要應(yīng)用于食源性致病菌如沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌等，食品中病毒如諾如病毒，轉(zhuǎn)基因成分、過敏原、物種成分鑒定等方面。可按不同原理分主要有5類產(chǎn)品:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測試劑盒(PCR試劑盒)，實(shí)時(shí)定量PCR檢測試劑盒，基因芯片雜交檢測試劑盒，基因探針檢測試劑盒，恒溫核酸擴(kuò)增檢測試劑盒(LAMP試劑盒)
坐寸ο
[0005]國外自20世紀(jì)80年代末起就開始了對試劑盒的評價(jià)工作，取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，獲得了良好的效果。但出于種種原因，幾乎現(xiàn)所有的評價(jià)體系都存在一些缺陷。最為關(guān)鍵的就是由于試劑盒品種繁多，事實(shí)上“試劑盒”這個(gè)術(shù)語至今沒有規(guī)范的定義，在市場上銷售的稱之為“試劑盒”的產(chǎn)品各式各樣，而不同的試劑盒檢測原理差異懸殊，使得在構(gòu)建評價(jià)體系的技術(shù)法規(guī)時(shí)存在相當(dāng)大的技術(shù)難度，迄今為止，國內(nèi)尚未開展對試劑盒的管理規(guī)范工作，而國外官方僅采用直接注冊進(jìn)行管理，國際上最為成功的評定機(jī)構(gòu)之一 AFNOR僅對微生物檢測用試劑盒進(jìn)行評價(jià)，依據(jù)是IS016140《食品和動物飼料的微生物學(xué)替代檢測方法驗(yàn)證準(zhǔn)則》，而另一影響廣泛的機(jī)構(gòu)AOAC更多地依靠技術(shù)專家的力量，以專家小組來決定需要驗(yàn)證的技術(shù)指標(biāo)。
[0006]正是基于目前分子生物學(xué)檢測試劑盒產(chǎn)品的現(xiàn)狀，以及目前國內(nèi)外對可供借鑒的成熟的評價(jià)制度方案不多，而試劑盒本身的性質(zhì)也使其不能直接照搬其他產(chǎn)品的評價(jià)方案和技術(shù)，因此建立針對食源性致病菌的分子生物學(xué)試劑盒評價(jià)方法，可以更加客觀準(zhǔn)確地對此類試劑盒進(jìn)行必要的技術(shù)評價(jià)，以保證市場上流通的試劑盒性能指標(biāo)滿足相關(guān)要求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種食源性致病菌分子生物學(xué)檢測試劑盒質(zhì)量評價(jià)方法。
[0008]本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下:
一種食源性致病菌分子生物學(xué)檢測試劑盒質(zhì)量評價(jià)方法，是基于核苷酸為檢測對象的試劑盒定性方法的確認(rèn)，應(yīng)驗(yàn)證以下參數(shù):包容性和排他性、相對靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度、檢出限、耐變性和批間變異。
[0009]具體驗(yàn)證程序如下:
(1)包容性和排他性
對試劑盒方法的包容性和排他性測試時(shí)，沙門氏菌需要測試包括參考菌株和分離菌株在內(nèi)的100株目標(biāo)菌株和50株非目標(biāo)菌株；其他致病性細(xì)菌測試包括參考菌株和分離菌株在內(nèi)的30株目標(biāo)菌株和20株非目標(biāo)菌株；
(2)相對靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度
A、樣品種類要求
選擇5個(gè)食品種類，15個(gè)食品類型的樣品；
B、樣品制備要求
1)人工污染樣品制備方法
a.污染水平
每種食品基體需要有3個(gè)污染水平樣品，標(biāo)準(zhǔn)的測試組分為25g，其中一個(gè)未污染、一個(gè)樣品的污染水平為POD值在0.25~0.75、一個(gè)樣品的POD值為1.00，其中POD值為0.25~0.75的目標(biāo)菌濃度為0.2~2cfu/25g、P0D值為I的目標(biāo)菌濃度為4~6cfu/25g ；必要時(shí)調(diào)整水平使部分檢測結(jié)果呈陽性；
b.競爭菌群
至少I種食品必須采用競爭菌群進(jìn)行檢測；如果采用人工污染的方式，競爭菌株濃度必須比目標(biāo)菌至少高10倍；
c.污染方式
液體樣品:在大體積的樣品中加入稀釋的目標(biāo)菌，混勻；
干樣:在樣品中加入凍干菌，混勻；
固體/濕潤的樣品:滴加稀釋的目標(biāo)菌，均質(zhì)、噴霧；
要求進(jìn)行大體積接種；在采用準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基接種時(shí)應(yīng)保證樣品基體不發(fā)生變化；小心操作以免樣品基體被接種體稀釋；
2)自然污染樣品要求
2個(gè)不同批，每批20次平行檢測；至少I批要求有部分回收率數(shù)據(jù)；對于每份基體的每個(gè)水平，均需分別采用LAMP方法與參考方法進(jìn)行測試。
[0010]3)樣品測試數(shù)量
選擇人工污染樣品或自然污染樣品共計(jì)15種食品基質(zhì)樣品，對于低和高的污染水平，分別進(jìn)行20次平行測試，未接種的樣品進(jìn)行5次平行測試，同時(shí)用參考方法進(jìn)行驗(yàn)證，以檢測方法的重復(fù)性；
(3)檢出限
計(jì)算每種食品基體分別采用試劑盒方法與參考方法的POD值。
[0011]POD值為檢出陽性結(jié)果占所有檢測結(jié)果的比率，包括PODk-參考方法的POD值、PODc-采用試劑盒方法檢測的POD值；
POD= I，其中X為檢出陽性結(jié)果次數(shù)，N為測定總次數(shù)；
N
POD值>0.5時(shí)，25g基質(zhì)中的菌含量即為方法的檢出限；
(4)耐變性
A、試驗(yàn)菌株和測試數(shù)量
采用純培養(yǎng)的I株目標(biāo)菌與I株非目標(biāo)菌進(jìn)行耐變性實(shí)驗(yàn)，目標(biāo)菌的濃度在POD值為0.25~0.75的水平。每種測試條件10次平行。目標(biāo)菌采用檢測方法所要求的培養(yǎng)基；非目標(biāo)菌采用非選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；采用試劑盒方法進(jìn)行分析。報(bào)出每種條件下檢測的POD 值。
[0012]B、耐變因素選擇
確定需要評價(jià)的變量2個(gè):反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間，每個(gè)變量取兩個(gè)不同的水平。
[0013]C、結(jié)果判斷
如果當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件改變，POD值〈0.9，表明該條件對檢測結(jié)果有重要影響。
[0014](5)批間變異
采用純培養(yǎng)的I株目標(biāo)菌與I株非目標(biāo)菌進(jìn)行批間變異實(shí)驗(yàn)，目標(biāo)菌的濃度在POD值為0.25~0.75的水平。目標(biāo)菌采用檢測方法所要求的培養(yǎng)基；非目標(biāo)菌采用非選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；采用試劑盒方法進(jìn)行分析，取3個(gè)不同批號的試劑盒產(chǎn)品進(jìn)行檢測，每種測試條件10次平行，報(bào)出每種條件下檢測的POD值；
如果不同批次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的POD值出現(xiàn)〈±0.1的偏差，表明試劑盒產(chǎn)品批次間差異不顯著，POD值偏差>±0.2，表明試劑盒產(chǎn)品批次間差異顯著。
[0015](6)協(xié)同驗(yàn)證
選擇I種食品，添加目標(biāo)菌，制備未接種、低、高三個(gè)接種水平樣品，每一水平8個(gè)平行樣品。同時(shí)用試劑盒方法和參考方法進(jìn)行測試，至少8家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行協(xié)同實(shí)驗(yàn)。
[0016]本發(fā)明的食源性致病菌分子生物學(xué)試劑盒的評價(jià)方法，可以更加客觀準(zhǔn)確地對此類試劑盒進(jìn)行必要的技術(shù)評價(jià)，以保證市場上流通的試劑盒性能指標(biāo)滿足相關(guān)要求。

【具體實(shí)施方式】
[0017]I 范圍
本方法適用于以細(xì)菌核苷酸(DNA)為檢測對象的試劑盒定性方法的確認(rèn)(也稱驗(yàn)證)。(定性方法是指用直接或間接的方法檢測被分析物是否存在的分析方法。)2試劑盒方法驗(yàn)證要素
基于核苷酸為檢測對象的目標(biāo)細(xì)菌的試劑盒評價(jià)方法為篩選方法。應(yīng)驗(yàn)證以下參數(shù):包容性和排他性、相對靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度、檢出限、耐變性和批間變異。
[0018]3室內(nèi)驗(yàn)證程序
3.1包容性和排他性
對試劑盒方法的包容性和排他性測試時(shí)，沙門氏菌至少需要測試包括參考菌株和分離菌株在內(nèi)的100株目標(biāo)菌株和50株非目標(biāo)菌株；其他致病性細(xì)菌測試包括參考菌株和分離菌株在內(nèi)的30株目標(biāo)菌株和20株非目標(biāo)菌株。
[0019]3.2相對靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度
3.2.1樣品種類要求
選擇5個(gè)食品種類，15個(gè)食品類型的樣品。(參考食品種類表)
3.2.2樣品制備要求
(I)人工污染樣品制備方法 A.污染水平
每種食品基體需要有3個(gè)污染水平樣品(標(biāo)準(zhǔn)的測試組分為25g)，其中一個(gè)未污染(L。)、一個(gè)樣品的污染水平為POD (檢出概率)值在0.25~0.75(^)、一個(gè)樣品的POD值為LOO(L2)0其中POD值為0.25~0.75的目標(biāo)菌濃度大約為0.2~2cfu/25g、P0D值為I的目標(biāo)菌濃度大約為5cfu/25g ;必要時(shí)調(diào)整水平使部分檢測結(jié)果呈陽性。
[0020]競爭菌群
至少I種食品必須采用競爭菌群進(jìn)行檢測(自然的或人工污染樣品)；如果采用人工污染的方式，競爭菌株濃度必須比目標(biāo)菌至少高10倍。
[0021]注:結(jié)合在上述I種食品基質(zhì)實(shí)驗(yàn)中。
[0022]污染方式
液體樣品:在大體積的樣品中加入稀釋的目標(biāo)菌，混勻；
干樣:在樣品中加入凍干菌，混勻。
[0023]固體/濕潤的樣品:滴加稀釋的目標(biāo)菌，采用合適方法均質(zhì)；噴霧。
[0024]要求進(jìn)行大體積接種；在采用準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基接種時(shí)應(yīng)保證樣品基體不發(fā)生變化；小心操作以免樣品基體被接種體稀釋。
[0025](2)自然污染樣品要求
2個(gè)不同批，每批20次平行檢測；至少I批要求有部分回收率數(shù)據(jù)?？梢酝ㄟ^長時(shí)間放置或采用未被污染的產(chǎn)品稀釋等方式，獲得所希望的合適濃度水平。
[0026]對于每份基體的每個(gè)水平，均需分別采用LAMP方法與參考方法進(jìn)行測試。
[0027]3.2.3樣品測試數(shù)量
選擇人工污染樣品或自然污染樣品共計(jì)15種食品基質(zhì)樣品，當(dāng)采用人工污染樣品時(shí)，按3.2.2 (I)條要求，當(dāng)采用自然污染樣品時(shí)，按3.2.2 (2)條要求。
[0028]對于低和高的污染水平，分別進(jìn)行20次平行測試，未接種的樣品進(jìn)行5次平行測試。同時(shí)用參考方法進(jìn)行驗(yàn)證，以檢測方法的重復(fù)性。

【權(quán)利要求】
1.一種食源性致病菌分子生物學(xué)檢測試劑盒質(zhì)量評價(jià)方法，其特征在于:所述評價(jià)方法是基于核苷酸為檢測對象的試劑盒定性方法的確認(rèn)，應(yīng)驗(yàn)證以下參數(shù):包容性和排他性、相對靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度、檢出限、耐變性和批間變異； 具體驗(yàn)證程序如下: (1)包容性和排他性 對試劑盒方法的包容性和排他性測試時(shí)，沙門氏菌需要測試包括參考菌株和分離菌株在內(nèi)的100株目標(biāo)菌株和50株非目標(biāo)菌株；其他致病性細(xì)菌測試包括參考菌株和分離菌株在內(nèi)的30株目標(biāo)菌株和20株非目標(biāo)菌株； (2)相對靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度 A、樣品種類要求 選擇5 個(gè)食品種類，15個(gè)食品類型的樣品； B、樣品制備要求 . 1)人工污染樣品制備方法 a.污染水平 每種食品基體需要有3個(gè)污染水平樣品，標(biāo)準(zhǔn)的測試組分為25g，其中一個(gè)未污染、一個(gè)樣品的污染水平為POD值在0.25~0.75、一個(gè)樣品的POD值為1.00，其中POD值為.0.25~0.75的目標(biāo)菌濃度為0.2~2cfu/25g、P0D值為I的目標(biāo)菌濃度為4~6cfu/25g ；必要時(shí)調(diào)整水平使部分檢測結(jié)果呈陽性； b.競爭菌群 至少I種食品必須采用競爭菌群進(jìn)行檢測；如果采用人工污染的方式，競爭菌株濃度必須比目標(biāo)菌至少高10倍； c.污染方式 液體樣品:在大體積的樣品中加入稀釋的目標(biāo)菌，混勻； 干樣:在樣品中加入凍干菌，混勻； 固體/濕潤的樣品:滴加稀釋的目標(biāo)菌，均質(zhì)、噴霧； 要求進(jìn)行大體積接種；在采用準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基接種時(shí)應(yīng)保證樣品基體不發(fā)生變化；小心操作以免樣品基體被接種體稀釋； .2)自然污染樣品要求 . 2個(gè)不同批，每批20次平行檢測；至少I批要求有部分回收率數(shù)據(jù)； 對于每份基體的每個(gè)水平，均需分別采用LAMP方法與參考方法進(jìn)行測試； . 3)樣品測試數(shù)量 選擇人工污染樣品或自然污染樣品共計(jì)15種食品基質(zhì)樣品，對于低和高的污染水平，分別進(jìn)行20次平行測試，未接種的樣品進(jìn)行5次平行測試，同時(shí)用參考方法進(jìn)行驗(yàn)證，以檢測方法的重復(fù)性； (3)檢出限 計(jì)算每種食品基體分別采用試劑盒方法與參考方法的POD值； POD值為檢出陽性結(jié)果占所有檢測結(jié)果的比率，包括PODk-參考方法的POD值、P0D。-采用試劑盒方法檢測的POD值；POD= X/n，其中X為檢出陽性結(jié)果次數(shù)，N為測定總次數(shù)； POD值>0.5時(shí)，25g基質(zhì)中的菌含量即為方法的檢出限； (4)耐變性 A、試驗(yàn)菌株和測試數(shù)量 采用純培養(yǎng)的I株目標(biāo)菌與I株非目標(biāo)菌進(jìn)行耐變性實(shí)驗(yàn)，目標(biāo)菌的濃度在POD值為.0.25~0.75的水平；每種測試條件10次平行，目標(biāo)菌采用檢測方法所要求的培養(yǎng)基；非目標(biāo)菌采用非選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；采用試劑盒方法進(jìn)行分析，報(bào)出每種條件下檢測的POD 值； B、耐變因素選擇 確定需要評價(jià)的變量2個(gè):反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間，每個(gè)變量取兩個(gè)不同的水平； C、結(jié)果判斷 如果當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件改變，POD值〈0.9，表明該條件對檢測結(jié)果有重要影響； (5)批間變異 采用純培養(yǎng)的I株目標(biāo)菌與I株非目標(biāo)菌進(jìn)行批間變異實(shí)驗(yàn)，目標(biāo)菌的濃度在POD值為0.25~0.75的水平； 目標(biāo)菌采用檢測方法所要求的培養(yǎng)基；非目標(biāo)菌采用非選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；采用試劑盒方法進(jìn)行分析，取3個(gè)不同批號的試劑盒產(chǎn)品進(jìn)行檢測，每種測試條件10次平行，報(bào)出每種條件下檢測的POD值； 如果不同批次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的POD值出現(xiàn)〈±0.1的偏差，表明試劑盒產(chǎn)品批次間差異不顯著，POD值偏差>±0.2，表明試劑盒產(chǎn)品批次間差異顯著； (6 )協(xié)同驗(yàn)證 選擇I種食品，添加目標(biāo)菌，制備未接種、低、高三個(gè)接種水平樣品，每一水平8個(gè)平行樣品； 同時(shí)用試劑盒方法和參考方法進(jìn)行測試，至少8家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行協(xié)同實(shí)驗(yàn)。
【文檔編號】C12Q1/10GK104131116SQ201410427208
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月27日
【發(fā)明者】鄭晶, 陳彬, 鄭潔, 林杰, 彭華毅 申請人:福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心