DKK1單克隆抗體2的保護(hù)液由pH = 7. 2的 10mM磷酸鹽緩沖液、0. 5%的牛血清白蛋白、0. 01%的硫柳汞和50%甘油組成；所述酶標(biāo)記 的DKK1單克隆抗體2的存貯條件為-20°C，且濃度大于100ug/ml ;酶標(biāo)記的DKK1單克隆抗 體2的工作濃度稀釋倍數(shù)為1 :400,酶標(biāo)記的DKK1單克隆抗體2所采用的酶為辣根過(guò)氧化 物酶（HRP)。
[0022] 實(shí)施例2 :
[0023] -種用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物DKK1濃度的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法，具體包括如 下步驟：
[0024] ①制備包被有DKK1單克隆抗體1的多孔板：用pH = 7-8的磷酸緩沖液將DKK1 單克隆抗體1稀釋，然后將稀釋后的DKK1單克隆抗體1溶液加入到多孔板的孔中，37°C孵 育2小時(shí)；包被后用磷酸鹽緩沖液洗板拍干；用5%牛血清白蛋白溶液加入到多孔板各孔， 37°C封閉1小時(shí)；封閉后用磷酸鹽緩沖液洗板拍干，將其保存于4°C。②制備酶標(biāo)記的DKK1 單克隆抗體2 :將5mg/ml的HRP (辣根過(guò)氧化物酶）加入0. 2ml的0. 1M高碘酸鈉 NaI04溶 液中，室溫避光攪拌20分鐘；將上述溶液對(duì)ImM pH4. 4的醋酸鈉緩沖液4°C透析過(guò)夜；透 析后，加20 μ 1 0. 2M pH9. 5的碳酸鹽緩沖液，然后立即加入10mg DKK1單克隆抗體2,室溫 避光攪拌2小時(shí)；加入0. lml新配的4mg/ml NaBH 4溶液，混勻，4°C放置2小時(shí)；將上述溶 液對(duì)10mM pH7. 2PBS緩沖液4°C透析過(guò)夜；在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，4°C放置 1小時(shí)；3000rpm離心半小時(shí)，棄上清；沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量 10mM pH7. 2的PBS中；將上述溶液對(duì)酶標(biāo)抗體保護(hù)液4°C透析過(guò)夜，lOOOOrpm離心30分鐘 去除沉淀后分裝冷凍保存。
[0025] 實(shí)施例3 :
[0026] 本發(fā)明對(duì)DKK1的極高靈敏度檢測(cè)：將DKK1標(biāo)準(zhǔn)品做梯度稀釋，即0. 0125ng/ml、 0. 0625ng/ml、0. 03125ng/ml、0. 015625ng/ml……用本試劑盒測(cè)量其吸光值5次，并計(jì)算平 均值和標(biāo)準(zhǔn)差。同時(shí)測(cè)量DKK1零參考標(biāo)準(zhǔn)品5次，計(jì)算其吸光均值和標(biāo)準(zhǔn)差。用"t檢驗(yàn)" 檢驗(yàn)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品與零參考標(biāo)準(zhǔn)品的之間顯著差異性，結(jié)果見(jiàn)表1。經(jīng)測(cè)定本發(fā)明對(duì)DKK1的 檢測(cè)極限小于 〇· 〇15625ng/ml (ρ〈0· 01)。
[0027]表 1
[0028]
[0029] 實(shí)施例4 :
[0030] 本發(fā)明對(duì)DKK1的高特異度檢測(cè)：將同源蛋白DKK2、DKK3、DKK4、DKKL1和DKK1梯 度稀釋至相同濃度，用本試劑盒進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。此結(jié)果表明，本發(fā)明能夠高特異度地 測(cè)定DKK1。
[0031] 表 2
[0032]
[0033] 實(shí)施例5 :
[0034] 準(zhǔn)確度測(cè)試：采用回收法評(píng)價(jià)本發(fā)明的準(zhǔn)確性，選擇合適濃度的血清樣本，分成體 積相同的3份，在其中2份加入不同濃度的待回收DKK1標(biāo)準(zhǔn)蛋白，制成不同加入濃度的待 回收分析樣本；在另一份血清中加入相同體積的無(wú)待測(cè)物的溶劑，制成基礎(chǔ)樣本；分別測(cè) 定和計(jì)算基礎(chǔ)樣本和待回收分析樣本中DKK1的濃度，結(jié)果見(jiàn)表3 ;
[0035] 表 3
[0036]
[0037] 其中：平均回收率=(117. 8% +96. 4% )/2 = 107. 1%。
[0038] 實(shí)施例6 :
[0039] 精密度（批內(nèi)差）測(cè)試：選取高、中、低3份不同濃度的DKK1標(biāo)準(zhǔn)品，用同一批次 的試劑盒進(jìn)行測(cè)定，每份標(biāo)準(zhǔn)品分別測(cè)定10次，結(jié)果見(jiàn)表4。此結(jié)果表明，本發(fā)明的批內(nèi)差 小于15%，與進(jìn)口試劑盒（貨號(hào)DKK100，R&DSystems公司，美國(guó)）的批內(nèi)差相當(dāng)。
[0040] 表 4 [0041 ]
[0042] 實(shí)施例7 :
[0043] 穩(wěn)定性測(cè)試：將本發(fā)明試劑盒存放于37°C環(huán)境中保存，定期對(duì)不同濃度DKK1標(biāo)準(zhǔn) 品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表5。將本發(fā)明的酶標(biāo)抗體放于37°C環(huán)境中保存，定期對(duì)不同濃度DKK1 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表6。常認(rèn)為在37°C存放一天相當(dāng)于4-KTC存放1. 5個(gè)月，此結(jié)果 表明，本發(fā)明試劑盒在37°C恒溫下保持9天，對(duì)各濃度的DKK1標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)量均無(wú)顯著變化，相 當(dāng)于可在4°C恒溫下保存13. 5個(gè)月以上；本發(fā)明的酶標(biāo)抗體在37°C恒溫下保持6天，對(duì)各 濃度的DKK1標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)量均無(wú)顯著變化，相當(dāng)于可在4°C恒溫下保存9個(gè)月以上。
[0044] 表 5
[0045]
[0048] 實(shí)施例8 :
[0049] 本發(fā)明與進(jìn)口試劑盒的相關(guān)性測(cè)試：將本試劑盒與進(jìn)口試劑盒（貨號(hào)DKK100，R&D Systems公司，美國(guó)）同時(shí)對(duì)348份血清進(jìn)行定量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2。此結(jié)果表明，本發(fā)明與 進(jìn)口試劑盒的測(cè)定值高度相關(guān)（r = 0. 903, p〈0. 0001)，可以替代進(jìn)口試劑盒。
[0050] 對(duì)所公開(kāi)的實(shí)施例的上述說(shuō)明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。 對(duì)上述實(shí)施例的多種修改對(duì)本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的，本文中所定義的 一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實(shí)施例中實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明 將不會(huì)被限制于本文所示的這些實(shí)施例，而是要符合與本文所公開(kāi)的原理和新穎特點(diǎn)相一 致的最寬的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物DKK1濃度的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，由包被有DKK1單克 隆抗體1的多孔板、酶標(biāo)記的DKK1單克隆抗體2、顯色底物和底物終止液組成；其中，DKK1 單克隆抗體1為10C3 ;DKK1單克隆抗體2為6E8。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物DKK1濃度的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在 于，所述酶標(biāo)記的DKK1單克隆抗體2的保護(hù)液由pH = 7. 2的10mM磷酸鹽緩沖液、0. 5%的 牛血清白蛋白、0. 01 %的硫柳汞和50 %甘油組成。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物DKK1濃度的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在 于，所述酶標(biāo)記的DKK1單克隆抗體2的存貯條件為-20°C，且濃度大于100ug/ml。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物DKK1濃度的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在 于，所述酶標(biāo)記的DKK1單克隆抗體2的工作濃度稀釋倍數(shù)為1:500-1:2500。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的一種檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物DKK1濃度的酶聯(lián)免疫試劑 盒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：①制備包被有DKK1單克隆抗體1的多孔板：用 pH = 7-8的磷酸緩沖液將DKK1單克隆抗體1稀釋后加入到多孔板的孔中，37°C孵育2小時(shí) 進(jìn)行包被；包被后用磷酸鹽緩沖液洗板拍干；用5%牛血清白蛋白溶液37°C封閉1小時(shí)；封 閉后用磷酸鹽緩沖液洗板拍干，將其保存于4°C ;②制備酶標(biāo)記的DKK1單克隆抗體2 :用高 碘酸鈉 NaI04將酶表面的糖分子氧化成醛基；醛化后的酶再與DKK1單克隆抗體2上的氨基 相反應(yīng)，形成Schiff堿；并進(jìn)一步用NaBH 4還原生成穩(wěn)定的酶標(biāo)記檢測(cè)單克隆抗體；酶標(biāo)后 的抗體通過(guò)硫酸銨沉淀進(jìn)行純化，最后對(duì)保護(hù)液進(jìn)行低溫透析以便長(zhǎng)期貯存待用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物DKK1濃度的酶聯(lián)免疫試劑盒，由包被有型號(hào)為10C3的DKK1單克隆抗體1的多孔板、酶標(biāo)記的型號(hào)為6E8的DKK1單克隆抗體2、顯色底物和底物終止液組成；同時(shí)公開(kāi)了上述酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法及性能指標(biāo)。本發(fā)明采用全國(guó)產(chǎn)化的試劑，制造了與大多數(shù)醫(yī)院現(xiàn)有儀器相匹配的酶聯(lián)免疫試劑盒，實(shí)現(xiàn)了對(duì)DKK1濃度極高靈敏、高特異和相對(duì)廉價(jià)的檢測(cè)，有利于大規(guī)模地對(duì)肝細(xì)胞癌進(jìn)行普查，盡早診斷，提高我國(guó)全民身體健康。
【IPC分類】G01N33/577
【公開(kāi)號(hào)】CN105588941
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510090581
【發(fā)明人】王 鋒, 高鵬, 吳丹, 沈秋瑾, 覃文新
【申請(qǐng)人】蘇州飛康生物醫(yī)藥有限公司
【公開(kāi)日】2016年5月18日
【申請(qǐng)日】2015年2月28日