一種測定植物組織氨基酸泄漏率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及植物抗逆性鑒定技術(shù)，具體是指一種測定植物組織氨基酸泄漏率的方 法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003] 受全球氣候變暖的影響，環(huán)境變化程度增大，春夏季寒流天氣頻繁，對已進入生長 發(fā)育期的植物造成嚴(yán)重威脅，引起草原植被群落的變遷和結(jié)構(gòu)的改變，尤其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中 造成很大的減產(chǎn)，甚至絕收。另外，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，隨著化肥的投入使用，±壤鹽堿化問 題愈加突出，對農(nóng)作物造成一定程度的鹽害，嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)?？鼓嫘詮姷闹参镌谀婢趁{ 迫中產(chǎn)出性能強，減產(chǎn)小。因此，通過選育抗逆性強的植物新品種是改良植物抗逆性，保持 農(nóng)牧業(yè)增收的有效途徑。
[0004] 植物抗逆性快速鑒定的方法是植物抗逆育種的關(guān)鍵技術(shù)，一直受到研究者的關(guān) 注，但傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定法不能對抗逆性進行量化分析，分子鑒定技術(shù)成本高，操作難度大且 耗時，要求精密儀器才能完成。電導(dǎo)率法雖然能反映細(xì)胞的完整性，但測定時誤差難W控 審IJ。由于植物細(xì)胞為雙憐脂分子層通透性膜，中間鑲嵌大量蛋白質(zhì)和糖類分子，具有滲透調(diào) 節(jié)功能，也具有雙向選擇透性。當(dāng)植物受到低溫冷凍、鹽堿非生物環(huán)境因子脅迫后，機體內(nèi) 抗氧化系統(tǒng)失衡，自由基積累，一些蛋白質(zhì)被降解為游離氨基酸，膜蛋白降解后從生物膜脫 落下來，破壞了生物膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，造成生物膜不同程度出現(xiàn)孔桐，細(xì)胞內(nèi)含物開始向外泄 露，介質(zhì)中游離氨基酸增多。不同程度的環(huán)境脅迫引起蛋白質(zhì)降解的程度不同，造成氨基酸 泄露的程度就不同。然而，抗逆性強的植物具有較強的抗氧化系統(tǒng)，能及時清除多余的自由 基，維持體內(nèi)自由基的穩(wěn)定和平衡，保護功能蛋白質(zhì)不被降解，保持膜系統(tǒng)的完整性。因此， 當(dāng)植物遭到逆境脅迫后，抗逆性強的植物生物膜系統(tǒng)穩(wěn)定，蛋白質(zhì)相對穩(wěn)定，氨基酸泄露率 低。根據(jù)自由基學(xué)說、生物膜損傷原理和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性原理，可通過測定植物組織細(xì)胞氨基 酸泄漏的程度，來衡量生物膜系統(tǒng)的完整性和蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，運對于鑒定植物的抗逆性 和選育抗逆性強的植物新品種均有著實際的應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 鑒于上述，本發(fā)明的目的在于提供一種測定植物組織氨基酸泄漏率的方法。本方 法利用氨基酸在28化m處有一吸收高峰為依據(jù)，W殺死組織后280nm吸光度為參照，通過試 驗準(zhǔn)備-準(zhǔn)備樣品-浸提-離屯、-去除雜蛋白干擾-測定鮮組織吸光度-高壓滅殺-合并離屯、-測定殺死組織吸光度，最后計算氨基酸泄露率。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過W下技術(shù)方案來實現(xiàn)： 一種測定植物組織氨基酸泄漏率的方法，其步驟是： a.試驗準(zhǔn)備 根據(jù)試驗處理數(shù)，準(zhǔn)備足量5-lOml帶螺蓋離屯、管，用無離子水洗凈后烘干備用； b.準(zhǔn)備樣品 處理前用蒸饋水沖洗待測植物組織，用濾紙吸干表面水分；處理結(jié)束，準(zhǔn)確稱取各處 理植物新鮮組織0.0401-0.0509 g，置a步驟準(zhǔn)備的離屯、管中； C.浸提 在b步驟含植物新鮮組織的離屯、管中各加入4mL蒸饋水，在室溫條件下，浸提2-3 h，搖 床輕搖浸提3 h; d. 罔心 浸提結(jié)束，立即將C步驟的浸提管放置在轉(zhuǎn)速為3000rev/min的離屯、機離屯、5-10分鐘； e. 去除雜蛋白干擾 上述d步驟離屯、結(jié)束，吸取浸提管中的上清液3.0 ml，轉(zhuǎn)入另一測試管，加入0.3ml的 72%(w/v)S氯乙酸(TCA)溶液，再在3000rev/min離屯、5-10分鐘，W沉淀去除雜蛋白干擾； f. 測定鮮組織的吸光度 將e步驟離屯、后的測試管上清液倒入比色杯，在紫外分光光度計讀取波長280nm的吸光 度值A(chǔ)280nm，空白為蒸饋水，獲得鮮組織在波長280nm的吸光度值A(chǔ)280皿，測定后將比色杯 液體倒回測試管中； g. 局壓滅殺 將e步驟吸取上清液后留有植物組織和Iml浸提液的浸提管上蓋置高壓滅菌鍋滅殺 20min，浸提管稱之滅殺管； h. 合并離屯、 將e步驟測試管測試液全部回倒入其g步驟對應(yīng)滅殺管中，合并后再在3000rev/min離 屯、5-10分鐘，W沉淀去除雜蛋白干擾； i. 測定殺死組織的吸光度 將上述h步驟合并離屯、的滅殺管上清液倒入比色杯，空白為蒸饋水，再次測定吸光度值 Ak280nm，即為殺死樣品在波長280nm的吸光度值A(chǔ)k280nm; j. 計算氨基酸泄漏率 氨基酸泄漏率為各處理鮮組織在波長280nm的吸光度值A(chǔ)280nm占?xì)⑺罉悠吩诓ㄩL 280nm的吸光度值A(chǔ)k280nm的比率，按下列公式計算： 氨基酸泄漏率(％)=A280nmX 100/Ak280nm。
[0007]本發(fā)明的優(yōu)點和產(chǎn)生的有益效果是： 1、本發(fā)明根據(jù)自由基學(xué)說和生物膜損傷機制，利用游離氨基酸在280nm處有一吸收高 峰為依據(jù)，W殺死組織后280nm吸光度作為游離氨基酸100%泄漏的參照值，通過測定各處理 鮮組織280nm吸光度，最后計算氨基酸泄露率，成本低廉，方法簡單，處理間可比性強，在植 物抗逆性鑒定中應(yīng)用成效顯著。
[000引2、本發(fā)明關(guān)鍵技術(shù)步驟在于樣品經(jīng)浸提、離屯、、去除雜蛋白干擾、通過測定鮮組織 和殺死組織280nm的吸光度，計算出氨基酸泄露率。在運一步驟中，鮮樣和殺死樣為同一樣 品，一次稱樣即可完成測定，樣品用量少，取樣部位靈活，鮮樣和殺死樣在280nm的吸光度值 可比性強，不存在因樣組織部位和質(zhì)量的不同造成280nm吸光度值的差異，測定誤差小。
[0009] 3、利用本方法測定氨基酸泄漏率快速方便，整個測定工作耗時不到地，可對一次 試驗各處理成批測定，處理間可比性強，穩(wěn)定性好，可快速鑒定植物的抗低溫冷凍性和抗鹽 性，在植物抗逆性研究中應(yīng)用性廣。
[0010]
【具體實施方式】： 下面，本發(fā)明結(jié)合實施實例，對本發(fā)明的技術(shù)方案再作進一步的說明： 實施例1 為了鑒定瓜果生長期間對寒流引起的冷、凍害的抗性，本發(fā)明采用抗寒性有差異的西 瓜品種京欣1號和晚豐早成品種，將出苗后在23/25°C培養(yǎng)30d的幼苗在4°C和(TC處理2地， 用25°C作為對照。測定京欣1號和晚豐早成西瓜在冷、凍脅迫下子葉氨基酸泄露率的變化。 試驗在中國科學(xué)院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所分子生物學(xué)實驗室進行，測定試驗重復(fù)3次。
[0011] -種測定植物組織氨基酸泄漏率的方法，其步驟是： 1. 試驗準(zhǔn)備 根據(jù)試驗處理數(shù)，準(zhǔn)備36個IOml帶螺蓋離屯、管，用無離子水洗凈后烘干備用； 2. 準(zhǔn)備樣品 將室內(nèi)溫度為23/25C條件下播種出苗并生長IOd的西瓜品種京欣1號和晚豐早成幼苗 用蒸饋水沖洗，用濾紙吸干表面水分，然后置4°C和(TC處理2地，對照留在23/25°C，處理結(jié) 束，準(zhǔn)確稱取各處理幼苗子葉3份，作為3次重復(fù)，每份0.0401-0.0409 g，分別置上述離屯、管 編號； 3. 浸提 在上述含子葉的離屯、管中各加入4血蒸饋水，在23/25°C條件下浸提2-3 h，期間每隔30 分鐘輕搖1次或置搖床輕搖浸提； 4. 離屯、 輕搖結(jié)束，立即將浸提管放置在轉(zhuǎn)速為3000rev/min的離屯、機離屯、10分鐘； 5. 去除雜蛋白干擾 吸取浸提管中上清液3.0 ml轉(zhuǎn)入另一測試管，加入0.3ml的72%(w/v)S氯乙酸(TCA)溶 液，再在轉(zhuǎn)速為3000rev/min的離屯、機離屯、10分鐘，W沉淀去除雜蛋白干擾； 6. 測定鮮樣品的吸光度 將測試管上清液倒入比色杯，在紫外分光光度計讀取波長280nm的吸光度值A(chǔ)280nm，空 白為蒸饋水，獲得鮮組織在波長280nm的吸光度值A(chǔ)280nm，測試結(jié)束將比色杯液體全部回收 入測試管中； 7. 局壓滅殺 將吸取浸提液后含有子葉和Iml浸提液的浸提離屯、管置高壓滅菌鍋滅菌20min，冷卻后 與對應(yīng)測試管浸提液合并； 8. 離屯、 將含合并液的殺滅離屯、管在轉(zhuǎn)速為3000rev/min的離屯、機離屯、10分鐘，W沉淀去除雜 蛋白干擾； 9. 測定殺死樣品的吸光度 將上述合并離屯、的滅殺管上清液倒入比色杯，在紫外分光光度計讀取波長28化m的吸 光度值A(chǔ)280nm，空白為蒸饋水;再次測定吸光度值A(chǔ)k280nm，即為殺死樣品在波長28化m的吸 光度值A(chǔ)k280nm; 10. 計算氨基酸泄漏率 氨基酸泄漏率為各處理子葉在波長280nm的吸光度值A(chǔ)280nm占高壓殺死子葉在波長 280nm的吸光度值A(chǔ)k280nm的比率，按下列公式計算： 氨基酸泄漏率(％)=A280nmX 100/Ak280nm 表1西瓜品種京欣I號幼苗分別經(jīng)4°C和(TC處理24h氨基酸泄露率的比較
表1表明，對照23/25°(：條件下京欣1號平均氨基酸泄漏率為5.22%，標(biāo)準(zhǔn)誤為1.11%，95% 置信區(qū)間為[0.44%，9.99%]; 4 °C處理2地平均氨基酸泄漏率為3.91%，標(biāo)準(zhǔn)誤為0.26%，95%置 信區(qū)間為[2.79%，5.02%];(TC處理2地平均氨基酸