一種昆蟲成蟲石蠟切片染色方法
【專利摘要】一種昆蟲成蟲石蠟切片染色方法，屬于顯微組織切片技術(shù)領(lǐng)域，包括組織固定、組織脫水、組織透明、浸蠟、包埋與切片、展片與烘片、脫蠟和組織復(fù)水、染色、脫水與透明、封片和觀察，最終切片對組織區(qū)分度高，能夠清晰觀察到蟲體內(nèi)各個器官及組織的空間結(jié)構(gòu)，適用于體壁堅硬、體腔液體含量較少的成蟲蟲體材料。采用該方法處理蚤蠅成蟲蟲體，在顯微鏡下可以清晰地觀察到內(nèi)部消化系統(tǒng)、排泄系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)。本發(fā)明昆蟲成蟲整體石蠟切片方法不僅可以填補昆蟲成蟲內(nèi)部器官及組織觀察的空白，還可以彌補局部觀察的不足，為昆蟲系統(tǒng)發(fā)育分析提供分類特征，操作簡單，耗時短，成本低。
【專利說明】一種昆蟲成蟲石蠟切片染色方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及一種昆蟲成蟲石蠟切片染色方法，屬于顯微組織切片技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種昆蟲成蟲石蠟切片染色方法。
【背景技術(shù)】
[0003]昆蟲石蠟切片及染色技術(shù)是研究昆蟲組織形態(tài)及組織病理的重要實驗技術(shù)，一般包括解剖、固定、脫水透明、包埋、切片、染色等步驟。目前石蠟切片及染色技術(shù)多用于昆蟲幼蟲及成蟲的局部組織或器官，如觸角、消化道、足等。這樣不能觀察到昆蟲成蟲內(nèi)部整體器官及組織的空間結(jié)構(gòu)。成蟲的內(nèi)部器官形態(tài)不僅反映其生理特征，并由于內(nèi)部結(jié)構(gòu)較之外部形態(tài)受環(huán)境影響小，常常更有著種的穩(wěn)定性。但因成蟲外骨骼堅硬，體腔液體含量少，目前常規(guī)的切片方法難以制作完整的石蠟切片;而成蟲局部組織或器官的切片方法不僅操作復(fù)雜，耗時長，且常需要真空負(fù)壓處理等較高級儀器設(shè)備，更重要的是最終固定、包埋、切片等的處理效果不夠理想，最終局部切片對組織區(qū)分度十分有限，難以觀察到完整蟲體內(nèi)部各系統(tǒng)及器官的空間結(jié)構(gòu)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種昆蟲成蟲石蠟切片染色方法，此方法不僅操作簡單、耗時短、成本低，還能夠清晰觀察到蟲體內(nèi)各個器官及組織的空間結(jié)構(gòu)。
[0005]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
一種昆蟲成蟲石蠟切片染色方法，包括以下步驟:
(I)組織固定:
取去除足和翅的昆蟲蟲體浸于組織固定液中，室溫下靜置I小時，再于4°C下靜置12小時;組織固定液為:濃度為0.5%的Tr i tonX-100-4%多聚甲醛混合固定液。保存溫度為零下200C，用量與蟲體體積比為50:1。
[0006](2)組織脫水:
將經(jīng)過(I)處理后的蟲體取出，在4°C條件下，蒸餾水進行漂洗，再于室溫下依次用濃度梯度為70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液脫水，每個梯度的處理時間為20分鐘；蒸餾水與乙醇用量與蟲體的體積比為50:1。
[0007](3)組織透明:
將經(jīng)過(2)處理后的蟲體取出，室溫下依次在二甲苯:乙醇1:3混合液、二甲苯:乙醇1:1混合液中浸泡1分鐘，再在純二甲苯溶液中浸泡5分鐘；
(4)浸蠟、包埋與切片；
將經(jīng)過(3)處理后的蟲體取出，在55°C的液體石蠟:二甲苯1:1混合液中浸泡2小時，再于60°C的液體石蠟中浸泡4小時，經(jīng)過冷卻、凝固、定形后取出，進行切片； (5)展片與烘片:
取切片移至涂抹過粘片劑并預(yù)熱至55°C的載玻片上，切片立即自然完全舒展，再置于370C條件下12小時烘片;粘片劑的組成為:蛋白液、甘油、水楊酸鈉。其比例為10:10:1。
[0008](6)脫蠟和組織復(fù)水:
取烘片后的載玻片浸泡在二甲苯溶液中，保持5分鐘，再依次浸泡濃度梯度為100%、95%、90%、80%、70%的乙醇溶液，再浸泡于蒸餾水中，每個梯度的處理時間為I?3分鐘。
[0009](7)染色:
取組織復(fù)水后的載玻片浸泡在蘇木精溶液中，保持5分鐘，移至蒸餾水中漂洗I分鐘，再移至返藍(lán)液浸泡I分鐘，再于分化液中30秒，最后于伊紅溶液中染色2分鐘。
[0010](8)脫水與透明:
取染色后的載玻片進行蒸餾水漂洗5分鐘，再依次浸泡在濃度梯度為70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液中2?5分鐘，移至二甲苯溶液中浸泡3分鐘。
[0011](9)封片和觀察
在切片組織上滴加中性樹膠，蓋上蓋玻片，置于通風(fēng)櫥中進行晾干后，在顯微鏡下觀察。
[0012]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明中昆蟲成蟲石蠟切片方法，操作簡單，耗時短，成本低，最終切片對組織區(qū)分度高，能夠清晰觀察到蟲體內(nèi)各個器官及組織的空間結(jié)構(gòu)，適用于體壁堅硬、體腔液體含量較少的成蟲蟲體材料。采用該方法處理蚤蠅成蟲蟲體，在顯微鏡下可以清晰地觀察到內(nèi)部消化系統(tǒng)、排泄系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)。本發(fā)明昆蟲成蟲整體石蠟切片方法不僅可以填補昆蟲成蟲內(nèi)部器官及組織觀察的空白，還可以彌補局部觀察的不足，為昆蟲系統(tǒng)發(fā)育分析提供分類特征。
【附圖說明】
[0013]
圖1為雌性蚤蠅成蟲腹部橫切圖；
圖2為雄性蚤蠅成蟲整體縱切圖。
【具體實施方式】
[0014]下述實施例僅對本發(fā)明作進一步詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。
[0015]實施例1
本實施例中為蚤蠅成蟲石蠟切片方法，包括以下步驟:
1、組織固定
在化學(xué)通風(fēng)櫥中配制濃度0.5%的1'1'；[1:01^-100-4%多聚甲醛混合固定液。
[0016]固定流程為:將試供蟲體收集后置于冰床上，去除足和翅后直接投放到混合固定液中，固定液的量與蟲體體積比為50:1，4°C溫度下靜置12小時;試驗昆蟲為人工智能培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)蚤蠅成蟲，飼養(yǎng)溫度26 0C，相對濕度70%
2、組織脫水
將經(jīng)過(I)處理后的蟲體取出，在4°C條件下，蒸餾水進行漂洗，再于室溫下依次用濃度梯度為70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液脫水，每個梯度的處理時間為20分鐘；蒸餾水與乙醇用量與蟲體的體積比為50:1。
[0017]3、組織透明:
將經(jīng)過(2)處理后的蟲體取出，室溫下依次在二甲苯:乙醇1:3混合液、二甲苯:乙醇1:1混合液中浸泡1分鐘，再在純二甲苯溶液中浸泡5分鐘；
4、浸蠟、包埋與切片；
將經(jīng)過(3)處理后的蟲體取出，在55°C的液體石蠟:二甲苯1:1混合液中浸泡2小時，再于60°C的液體石蠟中浸泡4小時，經(jīng)過冷卻、凝固、定形后取出，進行切片；
5、展片與烘片:
取切片移至涂抹過粘片劑并預(yù)熱至55°C的載玻片上，切片立即自然完全舒展，再置于370C條件下12小時烘片;粘片劑的組成為:蛋白液、甘油、水楊酸鈉。其比例為10:10:1。
[0018]6、脫蠟和組織復(fù)水:
取烘片后的載玻片浸泡在二甲苯溶液中，保持5分鐘，再依次浸泡濃度梯度為100%、95%、90%、80%、70%的乙醇溶液，再浸泡于蒸餾水中，每個梯度的處理時間為I?3分鐘。
[0019]7、染色:
取組織復(fù)水后的載玻片浸泡在蘇木精溶液中，保持5分鐘，移至蒸餾水中漂洗I分鐘，再移至返藍(lán)液浸泡I分鐘，再于分化液中30秒，最后于伊紅溶液中染色2分鐘。
[0020]8、脫水與透明:
取染色后的載玻片進行蒸餾水漂洗5分鐘，再依次浸泡在濃度梯度為70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液中2?5分鐘，移至二甲苯溶液中浸泡3分鐘。
[0021]9、封片和觀察
在切片組織上滴加中性樹膠，蓋上蓋玻片，置于通風(fēng)櫥中進行晾干后，在顯微鏡下觀察。
[0022]在顯微鏡下可以清晰地觀察到內(nèi)部消化系統(tǒng)、排泄系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)見圖1，圖2。
【主權(quán)項】
1.一種昆蟲成蟲石蠟切片染色方法，其特征在于，所述方法包括以下過程: 組織固定: 取去除足和翅的昆蟲蟲體浸于組織固定液中，室溫下靜置I小時，再于4°C下靜置12小時;組織固定液為:濃度為0.5%的TritonX-100-4%多聚甲醛混合固定液;保存溫度為零下200C，用量與蟲體體積比為50:1; (2)組織脫水: 將經(jīng)過(I)處理后的蟲體取出，在4°C條件下，蒸餾水進行漂洗，再于室溫下依次用濃度梯度為70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液脫水，每個梯度的處理時間為20分鐘；蒸餾水與乙醇用量與蟲體的體積比為50:1 ； (3)組織透明: 將經(jīng)過(2)處理后的蟲體取出，室溫下依次在二甲苯:乙醇1:3混合液、二甲苯:乙醇1:1混合液中浸泡1分鐘，再在純二甲苯溶液中浸泡5分鐘； (4)浸蠟、包埋與切片； 將經(jīng)過(3)處理后的蟲體取出，在55°C的液體石蠟:二甲苯1:1混合液中浸泡2小時，再于60°C的液體石蠟中浸泡4小時，經(jīng)過冷卻、凝固、定形后取出，進行切片； (5)展片與烘片: 取切片移至涂抹過粘片劑并預(yù)熱至55°C的載玻片上，切片立即自然完全舒展，再置于37°C條件下12小時烘片;粘片劑的組成為:蛋白液、甘油、水楊酸鈉;其比例為10:10:1； (6)脫蠟和組織復(fù)水: 取烘片后的載玻片浸泡在二甲苯溶液中，保持5分鐘，再依次浸泡濃度梯度為100%、95%、90%、80%、70%的乙醇溶液，再浸泡于蒸餾水中，每個梯度的處理時間為I?3分鐘； (7)染色: 取組織復(fù)水后的載玻片浸泡在蘇木精溶液中，保持5分鐘，移至蒸餾水中漂洗I分鐘，再移至返藍(lán)液浸泡I分鐘，再于分化液中30秒，最后于伊紅溶液中染色2分鐘； (8)脫水與透明: 取染色后的載玻片進行蒸餾水漂洗5分鐘，再依次浸泡在濃度梯度為70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液中2?5分鐘，移至二甲苯溶液中浸泡3分鐘； (9)封片和觀察 在切片組織上滴加中性樹膠，蓋上蓋玻片，置于通風(fēng)櫥中進行晾干后，在顯微鏡下觀察。
【文檔編號】G01N1/30GK105928752SQ201610226169
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月13日
【發(fā)明人】劉廣純, 褚夢穎, 馮典興
【申請人】沈陽大學(xué)