Mst1和磷酸化mst1作為子宮內膜容受性檢測的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種MST1和磷酸化MST1作為子宮內膜容受性檢測的方法，包括將人子宮內膜癌細胞系Ishikawa和HEK293T細胞維持培養(yǎng)于含有10％FBS和青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)；免疫印記實驗；免疫共沉淀；免疫組織化學；染色體免疫共沉淀(ChIP)/PCR分析MST1對HOXA10轉錄活性的調節(jié)；人絨毛膜癌細胞(BeWo)細胞球黏附實驗的步驟。本發(fā)明方便快捷檢測MST1和MST1磷酸化修飾在子宮內膜組織中的表達水平，將能直接反映出子宮內膜的容受性狀態(tài)。
【專利說明】
MST1和磷酸化MST1作為子宮內膜容受性檢測的方法
技術領域
[0001]本發(fā)明屬于婦產(chǎn)科學領域，特別涉及一種子宮內膜容受性檢測的方法。
【背景技術】
[0002]胚胎的成功著床離不開容受性發(fā)育良好的母體內膜。在月經(jīng)周期后期，受卵巢分泌的雌、孕激素的影響，正常子宮內膜產(chǎn)生一系列形態(tài)、生化方面的規(guī)律性變化，發(fā)育形成容受性內膜，為胚胎種植做準備。但在IVF-ET周期中，子宮腺肌病、薄型子宮內膜以及不明原因反復種植失敗患者的子宮內膜容受性發(fā)育缺陷，造成胚胎種植失敗，也是制約IVF-ET臨床妊娠率進一步提高的重要原因。同時，隨著十八大三中全會明確提出開放“單獨二胎”政策，將有近百萬個符合政策的高齡婦女或“失獨家庭”準備生育二胎。由于高齡或多次人流術后造成子宮內膜損傷，這部分婦女的子宮內膜容受性降低，反復著床失敗現(xiàn)象較為常見。需對這部分患者建立較為方便可靠的內膜容受性檢測方法，并進一步分析子宮內膜容受性降低原因，以期采取個體化治療措施。
[0003]如何評價子宮內膜容受性是否適合胚胎移植，臨床現(xiàn)有的指標主要分為:子宮內膜形態(tài)學和超聲學指標，但仍然無法準確、有效預測異常子宮內膜的容受性。胞飲突的出現(xiàn)標志著子宮內膜的最佳容受期。研究表明，胞飲突缺乏的患者，胚胎移植后種植反復失??；胞飲突越豐富的患者妊娠率越高。胞飲突被認為是子宮內膜容受性的超微結構性標記，可以準確反應子宮內膜的容受性，但是其檢測需要掃描電鏡觀察，制備過程復雜，很難在臨床大規(guī)模開展。
[0004]目前研究普遍認為，轉錄因子H0XA10是子宮內膜容受性關鍵性轉錄調控因子和標志性分子。在子宮內膜容受性的建立過程中，種植“窗口期”形成，H0XA10等分子調控子宮內膜上皮細胞的增殖與分化，確保胚胎的正確定位和黏附。而H0XA10基因敲除小鼠不孕，表現(xiàn)出著床障礙，而排卵正常。機制研究表明H0XA10基因缺陷導致內膜胞飲突形成缺乏，整合素β 3的表達降低和子宮內膜免疫功能紊亂，影響內膜容受性的建立。臨床資料分析子宮腺肌病和反復種植失敗患者顯示子宮內膜中Η0ΧΑ10的表達量降低，以及其下游調控胚胎著床的關鍵基因ITGB3和IGFBP-1等表達異常。
[0005]近期，通過酵母雙雜交篩選和免疫共沉淀技術我們發(fā)現(xiàn)子宮內膜組織中絲蘇氨酸激酶MSTl與Η0ΧΑ10生理性相互結合；腺病毒介導的MSTl過表達、基因沉默和體外磷酸化實驗證實MSTl介導了雌孕激素引起的子宮內膜細胞中Η0ΧΑ10蛋白Τ376位蘇氨酸的磷化修飾作用；當Η0ΧΑ10蛋白第376位蘇氨酸突變?yōu)橘嚢彼釙r，Η0ΧΑ10的對β 3-1ntegrin啟動子的轉錄激活做用喪失，表明H0XA10的磷酸化修飾對其轉錄活性具有重要調控作用；進一步胚胎與子宮內膜細胞粘附實驗表明轉錄因子H0XA10T376位蘇氨酸殘基磷酸化修飾參與子宮內膜細胞中容受性標志分子β 3-1ntegrin的表達而增加胚胎與內膜間的粘附作用；給予孕1.5天孕鼠宮角注射H0XA10T376突變腺病毒能明顯抑制小鼠胚胎的著床；在此基礎上，我們成功制備了針對H0XA10蛋白第376位蘇氨酸殘基特異性的磷酸化單克隆抗體。臨床樣本與小鼠圍種植期子宮內膜組織免疫印跡實驗證實MST1、磷酸化MSTl及H0XA10第376位蘇氨酸殘基磷酸化修飾水平能夠更好的反映子宮內膜容受性的變化狀況。
[0006]綜合文獻與我們的研究結果，子宮內膜容受性的狀態(tài)不僅可以通過MSTl和H0XA10蛋白表達量的變化，更可以結合MSTl和H0XA10蛋白磷酸化水平綜合加以評估。方便快捷檢測MSTl和H0XA10在子宮內膜組織中的表達及修飾水平，將能直接反映出子宮內膜的容受性狀態(tài)，這也將為子宮內膜容受性低下的快速診斷提供新的手段。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種MSTl和磷酸化MSTl作為子宮內膜容受性檢測的方法，以解決現(xiàn)有技術中存在的無法準確、有效預測異常子宮內膜的容受性問題。
[0008]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案:
[0009]一種MSTl和磷酸化MSTl作為子宮內膜容受性檢測的方法，其特征在于:包括以下步驟:
[0010]⑴細胞培養(yǎng)
[0011]將人子宮內膜癌細胞系Ishikawa和HEK293T細胞維持培養(yǎng)于含有10% FBS和青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液中，待細胞長至90%匯集時，用質量體積比為0.25%胰酶細胞消化液常規(guī)消化傳代，在37°C、5% CO2、飽和濕度中培養(yǎng)；
[0012](2)免疫印記實驗
[0013]步驟(I)處理的Ishikawa或HEK293T細胞經(jīng)預冷的PBS漂洗后，加入細胞裂解緩沖液，刮取收集細胞，4°C旋轉裂解30min ;12000g離心30min后收集上清；經(jīng)Bradford法測定蛋白質濃度后，取總蛋白進行10% SDS-PAGE膠電泳分離，并按常規(guī)方法轉印至PVDF膜上，加入以下相應抗體:ant1-Myc-HRP, ant1-Flag-HRP, ant1-MST I, Phospho-MSTl (Thrl83),ant 1-phosphothreonine, ant1-phosphoserine, ant1-H0XA10, ant1- β -actin, ant1-GAPDH，進行相關蛋白表達與磷酸化修飾檢測；
[0014](3)免疫共沉淀
[0015]HEK293T細胞長至80 %匯集后，采用脂質體FuGENE 6將Myc-HOXAlO和/或Flag-MSTlcDNA轉入HEK293T細胞，48小時后收集細胞總蛋白，分別與c_Myc Beads和/或Flag M2Beads4°C緩慢搖動孵育過夜，Beads經(jīng)預冷的RIPA buffer洗3次，每次5分鐘后，離心收集Beads，加入SDS上樣緩沖液，95°C加熱5分鐘，離心，取上清進行10% SDS-PAGE電泳，蛋白經(jīng)轉移至硝酸纖維素膜上后按Western blotting常規(guī)操作進行分析蛋白間相互作用情況；
[0016]Ishikawa 細胞總蛋白經(jīng) ProteinA/G agarose 4°C緩慢旋轉孵育 2h，5000g、4°C離心Imin后收集上清，分別加入H0XA10抗體與Rabbit IgG, 4°C緩慢旋轉孵育4h后，再加入ProteinA/G，在4°C緩慢旋轉孵育過夜，次日5000g、4°C離心Imin收集Beads，加入SDS上樣緩沖液，95°C金屬浴加熱5分鐘，冰上靜置5min，離心后取上清進行10% SDS-PAGE膠電泳分離，按照常規(guī)方法轉印到PVDF膜上，加入Ant1-MSTl抗體進行MSTl蛋白檢測，以明確Ishikawa細胞中MSTl與H0XA10相互結合情況；
[0017](4)免疫組織化學
[0018]收集臨床病人分泌中晚期子宮內膜組織，固定并石蠟包埋；石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，經(jīng)m)TA抗原修復后；PBST漂洗3次，每次5min，滴加3% H2O2-純甲醇溶液，37°C 30min滅活內源性過氧化物酶；PBST漂洗3次，每次5min，滴加5%山羊血清37°C封閉30min ;甩去多余的液體，滴加1:100稀釋的兔抗MSTl抗體和Phospho-MSTl (Thrl83)抗體，4°C孵育過夜，PBST漂洗3次，每次5min，滴加1:400生物素化山羊抗兔IgG，37°C孵育30min ;PBST漂洗4次，每次5min，按DAB顯色試劑盒所述方法進行顯色，室溫顯色5 - 15min后蒸餾水洗滌終止顯色，脫水、透明、封片后于顯微鏡下進行觀察人子宮內膜組織中MSTl及磷酸化MSTl的細胞定位及表達改變情況并拍照；
[0019](5)染色體免疫共沉淀(Chip) /PCR分析MSTl對H0XA10轉錄活性的調節(jié)
[0020](6)人絨毛膜癌細胞(BeWo)細胞球黏附實驗
[0021]利用人絨毛膜癌BeWo細胞系建立體外細胞球培養(yǎng)體系作為體外胚胎粘附于內膜細胞單層上的模型。
[0022]進一步的，所述步驟(5)的具體方法如下:
[0023]培養(yǎng)的Ishikaira接種于ΦΙΟαιι細胞培養(yǎng)皿中，待細胞長至60%匯集時，分別感染Ad-LacZ 腺病毒、Ad-H0XA10、Ad-HOXAlO (Τ376Α)、Ad-MSTl 和 Ad-MSTl 與 Ad-HOXAlO 腺病毒(Μ0Ι = 50)，6h后更換培養(yǎng)液以去除腺病毒，37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；72h后，細胞經(jīng)PBS漂洗后，加入甲醛至終濃度為I %，室溫交聯(lián)15min，加入終濃度為0.125M的甘氨酸終止交聯(lián)反應1min ;預冷的PBS漂洗細胞兩次，加入裂解液裂解細胞，3000rpm離心3min后，棄上清；加入核裂解液重懸細胞沉淀，冰上超聲震蕩，以獲取500-2000bp的染色質片段；超聲后裂解產(chǎn)物4°C，1000rpm離心15min，取上清；加入蛋白A/G-瓊脂糖，4°C旋轉孵育2h以去除非特異性結合的染色質片段；分別加入兔抗H0XA10抗體和兔IgG，4°C旋轉孵育過夜，加入蛋白A/G-瓊脂糖，室溫孵育2h，離心收集并漂洗瓊脂顆粒，65°C水浴30min打開交聯(lián)，加入洗脫液室溫孵育15min，去除瓊脂顆粒，保留洗脫液；洗脫液加入終濃度為0.3M NaCl和RNase，65°C水浴5h后，酒精沉淀DNA ;加入蛋白酶K，45°C孵育2h后用酚-氯仿提純CHIPDNA ;以純化的DNA片段為模板進行PCR擴增及測序；PCR擴增特異性β 3-1ntegrin啟動子的序列為:5’-AATGCCCTTGGCTGAGAGGAAG-3’和 5’-TTCCTAGCTACACCTCGTTTGCG-3’ (GenBankaccess1n n0.AF020552)。
[0024]進一步的，所述步驟(6)的具體方法如下:
[0025]a.用無水乙醇配置濃度為10mg/mL的poly-HEMA溶液，37°C搖床搖過夜，以充分溶解，溶液于常溫下保存；
[0026]b.構建懸浮培養(yǎng)環(huán)境:用10mg/mL的poly-HEMA溶液包被細胞培養(yǎng)孔板，待用；c.胰酶消化生長至融合度為90%的BeWo單層細胞，進行細胞計數(shù)，稀釋細胞密度為1x105個細胞/mL，將細胞接種于預先用poly-HEMA處理過的60mm的細胞培養(yǎng)皿中，放入37°C，5% 0)2培養(yǎng)箱中進行細胞的懸浮培養(yǎng)，并隨時觀察培養(yǎng)細胞是否成團；
[0027]d.將Ishikawa細胞消化接種于十二孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞融合度為80%時，感染50M0I MSTl和/或20M0I H0XA10腺病毒進行相應基因的過表達，48hr后，將已培養(yǎng)成球的BeWo細胞球接種于處理過的Ishikawa細胞單層之上，兩者共培養(yǎng)1.5hr，預熱至37°C的含鈣和鎂離子的PBS輕輕漂洗十二孔板兩次，4%多聚甲醛室溫固定30min，統(tǒng)計粘附的細胞球數(shù)，并計算細胞的粘附效率。
[0028]進一步的，所述步驟⑴中，青鏈霉素雙抗為100IU/mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素。
[0029]進一步的，所述步驟⑵中，細胞裂解緩沖液為50.0mmol/L Tris pH=7.6, 150.0mmol/L NaCl, 0.1 % SDS, 1.0 % NP-40, Protease InhibitorCocktail, Phosphatase Inhibitor Cocktail(Sigma)0
[0030]進一步的，所述ant1-pH0XA10抗體的制備方法是:多肽抗原信息:磷酸化肽(C-RSVHL (pT) DRQVK)，對照肽(C-RSVHLTDRQVK)進行免疫小鼠，按常規(guī)流程制備單克隆抗體。
[0031]進一步的，裂解液為20mM Tris-HCl pH 8.0,85mM KCl, ImM EDTA，0.5mM EGTA,
0.5% NP40, protease inhibitor cocktail。
[0032]進一步的，核裂解液為50mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA, I % SDS, and proteaseinhibitor cocktail。
[0033]進一步的，洗脫液為1% SDS，0.1M NaHC03。
[0034]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明方便快捷檢測MSTl和H0XA10在子宮內膜組織中的表達及修飾水平，將能直接反映出子宮內膜的容受性狀態(tài)。臨床樣本與小鼠圍種植期子宮內膜組織免疫印跡實驗證實MSTl、磷酸化MSTl及H0XA10第376位蘇氨酸殘基磷酸化修飾水平能夠更好的反映子宮內膜容受性的變化狀況子宮內膜容受性的狀態(tài)不僅可以通過MSTl和H0XA10蛋白表達量的變化，更可以結合MSTl和H0XA10蛋白磷酸化水平綜合加以評估。方便快捷檢測MSTl和H0XA10在子宮內膜組織中的表達及修飾水平，將能直接反映出子宮內膜的容受性狀態(tài)，這也將為子宮內膜容受性低下的快速診斷提供新的手段。
【附圖說明】
[0035]圖1是MSTl與H0XA10相互結合；
[0036]圖2是MSTl磷酸化H0XA10第376位蘇氨酸殘基；
[0037]圖3是MSTl磷酸化H0XA10促進胚胎黏附；
[0038]圖4是MSTl和H0XA10及其蛋白磷酸化修飾在圍種植期孕鼠子宮組織中高表達；
[0039]圖5是MSTl和磷酸化MSTl在反復種植失敗患者子宮內膜組織中低表達。
【具體實施方式】
[0040]下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明做進一步說明。
[0041]一種磷酸化H0XA10作為子宮內膜容受性檢測的方法，包括以下步驟:
[0042](I)細胞培養(yǎng)
[0043]人子宮內膜癌細胞系Ishikara和肥(2931'細胞維持培養(yǎng)于含10% FBS和青鏈霉素雙抗(100IU/mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素)的DMEM/F12培養(yǎng)液中(GibcoBRL/Invitrogen)，待細胞長至90 %匯集時，用質量體積比為0.25%的胰酶細胞消化液(Trypsin-EDTA, Gibco BRL/Invitrogen)常規(guī)消化傳代，37°C、5% CO2、飽和濕度中培養(yǎng)。
[0044](2)免疫印記實驗(Western Blot)
[0045]Ishikawa或HEK293T細胞經(jīng)預冷的PBS漂洗兩次后，加入500 μ L細胞裂解緩沖液[50.0mmol/L Tris pH = 7.6，150.0mmol/L NaCl, 0.1 % SDS,1.0 % NP-40, ProteaseInhibitor Cocktail, Phosphatase Inhibitor Cocktail (Sigma)]，刮取收集細胞，4°C旋轉裂解30min ；12000g離心30min后收集上清；經(jīng)Bradford法測定蛋白質濃度后，取30 μ g的總蛋白進行10% SDS-PAGE膠電泳分離，并按常規(guī)方法轉印至PVDF膜上(Millipore)，加入相應抗體[ant1-Myc-HRP (1:5000, Invitrogen), ant1-Flag-HRP (1:5000, sigma), ant1-MSTI (1:1000, CellSignaling Technology), Phospho-MSTl(Thrl83)(1:1000, Cell SignalingTechnology), ant1-phosphothreonine(1:1000, sigma), ant1-phosphoserine(1:1000, sigma), ant1-HOXA10(1:1000, Santa Cruz), ant1-β -actin(1:10, 000, Abeam), ant1-GAPDH(I:10, 000, Abeam)]進行相關蛋白表達與磷酸化修飾檢測。
[0046](3)免疫共沉淀
[0047]HEK293T細胞長至80 %匯集后，采用脂質體FuGENE 6將3 μ g Myc-HOXAlO和/或Flag-MSTlcDNA轉入HEK293T細胞，48小時后收集細胞總蛋白，分別與c_MycBeads (Invitrogen)和 / 或 Flag M2Beads (Sigma) 4°C緩慢搖動孵育過夜。Beads 經(jīng)預冷的RIPA buffer洗3X5分鐘后，離心收集Beads，加入30 μ L 2XSDS上樣緩沖液，95°C加熱5分鐘，離心，取上清進行10% SDS-PAGE電泳。蛋白經(jīng)轉移至硝酸纖維素膜上后按Westernblotting常規(guī)操作進行分析蛋白間相互作用情況。
[0048]Img Ishikawa 細胞總蛋白經(jīng) ProteinA/G agarose 4°C緩慢旋轉孵育 2h，5000g、4°C離心Imin后收集上清，分別加入2 μ g H0XA10抗體(H-90，Santa Cruz)與2 μ g RabbitIgG，4°C緩慢旋轉孵育4h后，再加入30 μ L ProteinA/G，在4°C緩慢旋轉孵育過夜。次日5000g、4°C離心Imin收集Beads。加入50 μ L 2XSDS上樣緩沖液，95°C金屬浴加熱5分鐘，冰上靜置5min，離心后取上清進行10% SDS-PAGE膠電泳分離，按照常規(guī)方法轉印到PVDF膜上，加入Ant1-MSTl抗體進行MSTl蛋白檢測，以明確Ishikara細胞中MSTl與H0XA10相互結合情況。
[0049](4)免疫組織化學
[0050]收集臨床病人分泌中晚期子宮內膜組織，固定并石蠟包埋。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，經(jīng)m)TA抗原修復后；PBST漂洗3 X 5min，滴加3 % H202-純甲醇溶液，37°C 30min滅活內源性過氧化物酶；PBST漂洗3X5min，滴加5%山羊血清37°C封閉30min ;甩去多余的液體，滴加1:100稀釋的兔抗MSTl抗體和Phospho-MSTl (Thrl83)抗體。4°C孵育過夜，PBST漂洗3X5min，滴加1:400生物素化山羊抗兔IgG，37°C孵育30min ;PBST漂洗4X 5min，按DAB顯色試劑盒所述方法進行顯色(于ImL蒸餾水中加入試劑盒中的A、B、C試劑各I滴，混勻后滴加到組織片上)，室溫顯色5 - 15min后蒸餾水洗滌終止顯色。脫水、透明、封片后于顯微鏡下進行觀察人子宮內膜組織中MSTl及磷酸化MSTl的細胞定位及表達改變情況并拍照。
[0051](5)染色體免疫共沉淀(ChIP) /PCR分析MSTl對H0XA10轉錄活性的調節(jié)以H0XA10已知革E基因β 3-1ntegrin為例詳述實驗方法。培養(yǎng)的Ishikawa接種于Φ 1cm細胞培養(yǎng)皿中，待細胞長至60%匯集時，分別感染Ad-LacZ腺病毒、Ad-HOXA1, Ad-HOXAlO (T376A)、Ad-MSTl和Ad-MSTl與Ad-HOXAlO腺病毒(Μ0Ι = 50)，6h后更換培養(yǎng)液以去除腺病毒，37°C,5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；72h后，細胞經(jīng)PBS漂洗后，加入甲醛至終濃度為I %，室溫交聯(lián)15min，加入終濃度為0.125M的甘氨酸終止交聯(lián)反應1min ;預冷的PBS漂洗細胞兩次，加入 ImL 裂解液(20mM Tris-HCl pH 8.0,85mM KCl, ImM EDTA，0.5mM EGTA,0.5% NP40,protease inhibitor cocktail)裂解細胞，3000rpm 離心 3min 后，棄上清。加人 500 μ L 核裂解液(50mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA, I % SDS, and protease inhibitor cocktail)重懸細胞沉淀，冰上超聲震蕩，以獲取500-2000bp的染色質片段；超聲后裂解產(chǎn)物4°C，1000rpm 離心 15min，取上清。加入 30 μ L 蛋白 A/G-瓊脂糖(Protein A/G - Agarose,Invitrogen)4°C旋轉孵育2h以去除非特異性結合的染色質片段；分別加入5 μ g兔抗HOXAlO抗體和兔IgG，4°C旋轉孵育過夜，加入30 μ L蛋白A/G-瓊脂糖，室溫孵育2h，離心收集并漂洗瓊脂顆粒，65°C水浴30min打開交聯(lián)，加入洗脫液(1% SDS, 0.1M NaHC03)室溫孵育15min，去除瓊脂顆粒，保留洗脫液。洗脫液加入終濃度為0.3M NaCl和RNase，65°C水浴5h后，酒精沉淀DNA ;加入蛋白酶K 45°C孵育2h后用酚-氯仿提純CHIP DNA ;以純化的DNA片段為模板進行PCR擴增及測序。PCR擴增特異性β 3-1ntegrin啟動子的序列為:5，-AATGCCCTTGGCTGAGAGGAAG-3，和 5，-TTCCTAGCTACACCTCGTTTGCG-3，(GenBank access1nn0.AF020552)。
[0052](6)人絨毛膜癌細胞(BeWo)細胞球黏附實驗
[0053]利用人絨毛膜癌BeWo細胞系建立體外細胞球培養(yǎng)體系作為體外胚胎粘附于內膜細胞單層上的模型。具體方法簡述如下:
[0054](I)用無水乙醇配置濃度為10mg/mL的poly-HEMA溶液(sigma貨號:041M0024U)，37°C搖床搖過夜，以充分溶解，溶液于常溫下保存。
[0055](2)構建懸浮培養(yǎng)環(huán)境:用10mg/mL的poly-HEMA溶液包被細胞培養(yǎng)孔板，以6孔板為例:6孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入2mL配置好的終濃度為10mg/mL的poly-HEMA，待乙醇揮發(fā)干燥后再重復操作兩次，揮發(fā)干燥后無菌保存待用，使用之前用無菌PBS清洗3次，超凈臺紫外燈下照射30min，待用。
[0056](3)胰酶消化生長至融合度為90%的BeWo單層細胞，進行細胞計數(shù)，稀釋細胞密度為1x105個細胞/mL，將細胞接種于預先用poly-HEMA處理過的60mm的細胞培養(yǎng)皿中，放入37°C,5% C02培養(yǎng)箱中進行細胞的懸浮培養(yǎng)，并隨時觀察培養(yǎng)細胞是否成團。
[0057](4)將Ishikawa細胞消化接種于十二孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞融合度為80%時，感染50M0I MSTl和/或20M0I H0XA10腺病毒進行相應基因的過表達。48hr后，將已培養(yǎng)成球的BeWo細胞球接種于處理過的Ishikawa細胞單層之上，兩者共培養(yǎng)1.5hr。預熱至37°C的含鈣和鎂離子的PBS輕輕漂洗十二孔板兩次，4%多聚甲醛室溫固定30min，統(tǒng)計粘附的細胞球數(shù)，并計算細胞的粘附效率。
[0058]ant1-ρΗΟΧΑΙΟ抗體的制備方法是:多肽抗原信息:磷酸化肽(C-RSVHL (pT)DRQVK)，對照肽(C-RSVHLTDRQVK)進行免疫小鼠，按常規(guī)流程制備單克隆抗體。
【主權項】
1.一種MSTl和磷酸化MSTl作為子宮內膜容受性檢測的方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)細胞培養(yǎng) 將人子宮內膜癌細胞系Ishikawa和HEK293T細胞維持培養(yǎng)于含有10% FBS和青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液中，待細胞長至90%匯集時，用質量體積比為0.25%胰酶細胞消化液常規(guī)消化傳代，在37°C、5% CO2、飽和濕度中培養(yǎng)； (2)免疫印記實驗 步驟(I)處理的Ishika^i或HEK293T細胞經(jīng)預冷的PBS漂洗后，加入細胞裂解緩沖液，刮取收集細胞，4°C旋轉裂解30min ；12000g離心30min后收集上清；經(jīng)Bradford法測定蛋白質濃度后，取總蛋白進行10% SDS-PAGE膠電泳分離，并按常規(guī)方法轉印至PVDF膜上，加入以下相應抗體:ant1-Myc-HRP, ant1-Flag-HRP, ant1-MSTI, Phospho-MSTl (Thrl83), ant1-phosphothreonine, ant1-phosphoserine, ant1-H0XA10, ant1-β -actin, ant1-GAPDH,進行相關蛋白表達與磷酸化修飾檢測； (3)免疫共沉淀 HEK293T細胞長至80%匯集后，采用脂質體FuGENE 6將Myc-HOXAlO和/或Flag-MSTlcDNA轉入HEK293T細胞，48小時后收集細胞總蛋白，分別與c_Myc Beads和/或FlagM2Beads4°C緩慢搖動孵育過夜，Beads經(jīng)預冷的RIPA buffer洗3次，每次5分鐘后，離心收集Beads，加入SDS上樣緩沖液，95°C加熱5分鐘，離心，取上清進行10% SDS-PAGE電泳，蛋白經(jīng)轉移至硝酸纖維素膜上后按Western blotting常規(guī)操作進行分析蛋白間相互作用情況； Ishikawa細胞總蛋白經(jīng)ProteinA/G agarose 4°C緩慢旋轉孵育2h，5000g、4°C離心Imin后收集上清，分別加入H0XA10抗體與Rabbit IgG，4°C緩慢旋轉孵育4h后，再加入ProteinA/G，在4°C緩慢旋轉孵育過夜，次日5000g、4°C離心Imin收集Beads，加入SDS上樣緩沖液，95°C金屬浴加熱5分鐘，冰上靜置5min，離心后取上清進行10% SDS-PAGE膠電泳分離，按照常規(guī)方法轉印到PVDF膜上，加入Ant1-MSTl抗體進行MSTl蛋白檢測，以明確Ishikawa細胞中MSTl與H0XA10相互結合情況； (4)免疫組織化學 收集臨床病人分泌中晚期子宮內膜組織，固定并石蠟包埋；石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，經(jīng)EDTA抗原修復后；PBST漂洗3次，每次5min，滴加3% H2O2-純甲醇溶液，37°C 30min滅活內源性過氧化物酶；PBST漂洗3次，每次5min，滴加5%山羊血清37°C封閉30min ;甩去多余的液體，滴加1:100稀釋的兔抗MSTl抗體和Phospho-MSTl (Thrl83)抗體，4°C孵育過夜，PBST漂洗3次，每次5min，滴加1:400生物素化山羊抗兔IgG，37°C孵育30min ；PBST漂洗4次，每次5min，按DAB顯色試劑盒所述方法進行顯色，室溫顯色5 - 15min后蒸餾水洗滌終止顯色，脫水、透明、封片后于顯微鏡下進行觀察人子宮內膜組織中MSTl及磷酸化MSTl的細胞定位及表達改變情況并拍照； (5)染色體免疫共沉淀(ChIP)/PCR分析MSTl對H0XA10轉錄活性的調節(jié) (6)人絨毛膜癌細胞(BeWo)細胞球黏附實驗 利用人絨毛膜癌BeWo細胞系建立體外細胞球培養(yǎng)體系作為體外胚胎粘附于內膜細胞單層上的模型。2.如權利要求1所述的MSTl和磷酸化MSTl作為子宮內膜容受性檢測的方法，其特征在于:所述步驟(5)的具體方法如下: 培養(yǎng)的Ishil?wa接種于ΦΙΟαιι細胞培養(yǎng)皿中，待細胞長至60%匯集時，分別感染Ad-LacZ 腺病毒、Ad-H0XA10、Ad-HOXAlO (Τ376Α)、Ad-MSTl 和 Ad-MSTl 與 Ad-HOXAlO 腺病毒(Μ0Ι = 50)，6h后更換培養(yǎng)液以去除腺病毒，37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；72h后，細胞經(jīng)PBS漂洗后，加入甲醛至終濃度為I %，室溫交聯(lián)15min，加入終濃度為0.125M的甘氨酸終止交聯(lián)反應1min ;預冷的PBS漂洗細胞兩次，加入裂解液裂解細胞，3000rpm離心3min后，棄上清；加入核裂解液重懸細胞沉淀，冰上超聲震蕩，以獲取500-2000bp的染色質片段；超聲后裂解產(chǎn)物4°C，1000rpm離心15min，取上清；加入蛋白A/G-瓊脂糖，4°C旋轉孵育2h以去除非特異性結合的染色質片段；分別加入兔抗H0XA10抗體和兔IgG，4°C旋轉孵育過夜，加入蛋白A/G-瓊脂糖，室溫孵育2h，離心收集并漂洗瓊脂顆粒，65°C水浴30min打開交聯(lián)，加入洗脫液室溫孵育15min，去除瓊脂顆粒，保留洗脫液；洗脫液加入終濃度為0.3M NaCl和RNase，65°C水浴5h后，酒精沉淀DNA ;加入蛋白酶K，45°C孵育2h后用酚-氯仿提純CHIPDNA ;以純化的DNA片段為模板進行PCR擴增及測序；PCR擴增特異性β 3-1ntegrin啟動子的序列為:5’-AATGCCCTTGGCTGAGAGGAAG-3’和 5’-TTCCTAGCTACACCTCGTTTGCG-3’ (GenBankaccess1n n0.AF020552)。3.如權利要求1所述的MSTl和磷酸化MSTl作為子宮內膜容受性檢測的方法，其特征在于:所述步驟出)的具體方法如下: a.用無水乙醇配置濃度為10mg/mL的poly-HEMA溶液，37°C搖床搖過夜，以充分溶解，溶液于常溫下保存； b.構建懸浮培養(yǎng)環(huán)境:用10mg/mL的poly-HEMA溶液包被細胞培養(yǎng)孔板，待用； c.胰酶消化生長至融合度為90%的BeWo單層細胞，進行細胞計數(shù)，稀釋細胞密度為1x105個細胞/mL，將細胞接種于預先用poly-HEMA處理過的60mm的細胞培養(yǎng)皿中，放入37°C,5% 0)2培養(yǎng)箱中進行細胞的懸浮培養(yǎng)，并隨時觀察培養(yǎng)細胞是否成團； d.將Ishikawa細胞消化接種于十二孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞融合度為80%時，感染50M0I MSTl和/或20M0I H0XA10腺病毒進行相應基因的過表達，48hr后，將已培養(yǎng)成球的Beffo細胞球接種于處理過的Ishikawa細胞單層之上，兩者共培養(yǎng)1.5hr，預熱至37°C的含鈣和鎂離子的PBS輕輕漂洗十二孔板兩次，4%多聚甲醛室溫固定30min，統(tǒng)計粘附的細胞球數(shù)，并計算細胞的粘附效率。4.如權利要求1所述的MSTl和磷酸化MSTl作為子宮內膜容受性檢測的方法，其特征在于:所述步驟(I)中，青鏈霉素雙抗為100IU/mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素。5.如權利要求1所述的MSTl和磷酸化MSTl作為子宮內膜容受性檢測的方法，其特征在于:所述步驟(2)中，細胞裂解緩沖液為50.0mmoI/L Tris pH = 7.6，150.0mmoI/LNaCl, 0.1 % SDS, 1.0 % NP-40, Protease Inhibitor Cocktail, Phosphatase InhibitorCocktail(Sigma)。6.如權利要求1所述的MSTl和磷酸化MSTl作為子宮內膜容受性檢測的方法，其特征在于:所述ant1-ρΗΟΧΑΙΟ抗體的制備方法是:多肽抗原信息:磷酸化肽(C-RSVHL(pT)DRQVK)，對照肽(C-RSVHLTDRQVK)進行免疫小鼠，按常規(guī)流程制備單克隆抗體。7.如權利要求2所述的MSTl和磷酸化MSTl作為子宮內膜容受性檢測的方法，其特征在于:裂解液為 20mM Tris-HCl pH 8.0,85mM KCl, ImM EDTA,0.5mM EGTA,0.5% NP40,protease inhibitor cocktail。8.如權利要求2所述的MSTl和磷酸化MSTl作為子宮內膜容受性檢測的方法，其特征在于:核裂解液為 50mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA, I % SDS, and protease inhibitorcocktailo9.如權利要求2所述的MSTl和磷酸化MSTl作為子宮內膜容受性檢測的方法，其特征在于:洗脫液為1% SDS, 0.1M NaHCO30
【文檔編號】G01N33/577GK105988002SQ201510094925
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年3月3日
【發(fā)明人】顏桂軍, 孫海翔, 蔣玥, 閆薔, 程茜
【申請人】南京鼓樓醫(yī)院