麻欠精油在制備預(yù)防和治療子宮內(nèi)膜異位癥藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了麻欠精油在制備預(yù)防和治療子宮內(nèi)膜異位癥藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明以原代培養(yǎng)的人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞(ESC)為模型，篩選發(fā)現(xiàn)麻欠精油具有很好的抑制子宮內(nèi)膜異位種植活性，麻欠精油在較低濃度(體積濃度不低于0.01‰)時可以抑制TNF?α誘導(dǎo)的原代人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞IL?8分泌，較高濃度(體積濃度不低于0.08‰)時抑制人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞增值并誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞凋亡和壞死。麻欠精油作為一種傣藥成分，避免了西藥的諸多不良反應(yīng)，服藥期間不會影響內(nèi)分泌生理功能，也不會影響女性患者的正常生育要求，具有明顯的臨床優(yōu)勢。
【專利說明】
麻欠精油在制備預(yù)防和治療子宮內(nèi)膜異位癥藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及麻欠精油在制備預(yù)防和治療子宮內(nèi)膜異位癥藥物 中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 子宮內(nèi)膜的健康狀況關(guān)乎女性的生理、心理和生殖健康，越來越受到臨床醫(yī)務(wù)人 員的重視，其中，子宮內(nèi)膜異位癥是一種常見的子宮內(nèi)膜疾病。
[0003] 子宮內(nèi)膜異位癥（圖1)，又稱子宮外子宮內(nèi)膜異位癥，是指子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子 宮體以外的部位。子宮內(nèi)膜異位癥是生育年齡婦女的多發(fā)病，發(fā)病率為3~6%，近幾年發(fā)病 率有明顯上升趨勢，主要引起疼痛和不育，不孕發(fā)生率高達30~50%，癥狀與體征及疾病的 嚴重性不成比例，病變廣泛、形態(tài)多樣。子宮內(nèi)膜異位癥雖是一種良性疾病，但卻具有惡性 腫瘤的粘連、浸潤、復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移的特點，嚴重影響廣大女性的身心健康和生活質(zhì)量，該 病也從局部疾病逐漸分類為類似于腫瘤樣的復(fù)雜的慢性系統(tǒng)疾病。
[0004] 目前臨床上子宮內(nèi)膜異位癥的治療主要包括手術(shù)治療和藥物治療以及兩者相結(jié) 合的方法，鑒于子宮內(nèi)膜異位癥手術(shù)難于治愈，術(shù)后又容易復(fù)發(fā)，因此，藥物治療仍占據(jù)重 要地位。藥物治療的要點是減滅和消除病灶、緩解和解除疼痛、改善和促進生育、減少或避 免復(fù)發(fā)。
[0005] 子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制尚未完全明了，發(fā)病機制學說包括經(jīng)血逆流學說、種 植學說、激素依賴性疾病、自身免疫系統(tǒng)疾病、遺傳性疾病以及環(huán)境因素引起的疾病。子宮 內(nèi)膜侵襲性異位種植是多因素參與的復(fù)雜過程，包括黏附、侵襲、血管形成過程，在此過程 中，機體全身及局部免疫狀態(tài)和功能，激素、細胞因子和酶起著重要作用，其中子宮內(nèi)膜間 質(zhì)細胞(ESC)在子宮內(nèi)膜異位種植中起著重要作用，因此，以調(diào)控子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞黏附、 侵襲和血管生成等生物學功能為靶標，研究開發(fā)治療子宮內(nèi)膜異位癥的創(chuàng)新藥物是目前的 熱點。
[0006] 目前認為腹腔鏡是子宮內(nèi)膜異位癥的診斷金標準和首選治療手段，但腹腔鏡下手 術(shù)只能去除肉眼可見的病灶，對于肉眼不可見病灶或不典型病灶往往不能有效去除而殘 留，術(shù)后殘留病灶可繼續(xù)受到激素影響而復(fù)發(fā)。腹腔鏡術(shù)后如不加藥物控制，子宮內(nèi)膜異位 癥復(fù)發(fā)率明顯升高，術(shù)后的復(fù)發(fā)率可達40~50%。子宮內(nèi)膜異位癥術(shù)后復(fù)發(fā)一直是困擾著 婦產(chǎn)科醫(yī)師的難題，尤其對于有生育要求的患者，術(shù)后妊娠的黃金時間為半年至1年，術(shù)后 西藥療法主要是采用激素療法，但這會延遲患者受孕時間且副作用大。
[0007] 此時，中草藥和民族藥由于其多成分、多靶點、作用溫和且可調(diào)理患者的全身狀況 的特點，在子宮內(nèi)膜異位癥的藥物治療中可以發(fā)揮其優(yōu)勢。復(fù)旦大學附屬婦產(chǎn)醫(yī)院臨床研 究發(fā)現(xiàn)術(shù)后采用中藥治療可預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)，提高妊娠率，取得很好的臨床療效。因此腹腔鏡 手術(shù)結(jié)合中草藥或民族藥治療是目前認為子宮內(nèi)膜異位癥較好的治療模式。中草藥或民族 藥用于子宮內(nèi)膜異位癥的術(shù)后輔助治療具有如下特點：（1)在臨床療效上與西藥療效相當； (2)中草藥或民族藥治療后患者無轉(zhuǎn)氨酶升高、體重增加、更年期綜合征表現(xiàn)、骨質(zhì)疏松等 不良反應(yīng)；（3)中草藥或民族藥服藥期間一般不會影響內(nèi)分泌生理功能，而且可調(diào)經(jīng)助孕。 因此，如何發(fā)掘療效較好的中草藥或民族藥用于子宮內(nèi)膜異位癥的治療，是目前子宮內(nèi)膜 異位癥研究的重要內(nèi)容。
[0008] 云南西雙版納地區(qū)是藥用植物種類豐富多樣和民族傳統(tǒng)藥用植物知識豐厚的熱 帶地區(qū)，傣族傳統(tǒng)藥用植物是我國民族文化中的瑰寶。麻欠(Maqian)是傣藥的一種，又稱毛 大葉臭花椒(Zanthoxylum myriacanthum var.Pubescens)，為蕓香科花椒屬大葉臭花椒 (Zanthoxylum myriacanthum)的一個變種，因其葉軸、小葉柄、小葉兩面及花序軸均被長柔 毛而得名。傣族醫(yī)藥書籍記載麻欠可用于治療腫痛等疾病，西雙版納當?shù)卮鲎迦罕姵Ｓ迷?藥用于抗炎、鎮(zhèn)痛以及緩解腫脹等。目前，未見有關(guān)麻欠用于治療子宮內(nèi)膜異位癥的文獻報 道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供麻欠精油在制備預(yù)防和治療子 宮內(nèi)膜異位癥藥物中的應(yīng)用。
[0010] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
[0011] 麻欠精油在制備預(yù)防和治療子宮內(nèi)膜異位癥藥物中的應(yīng)用。
[0012] 優(yōu)選的，所述子宮為人子宮。
[0013] 所述麻欠精油為從麻欠植物中提取的揮發(fā)性物質(zhì)。
[0014] 所述麻欠精油的提取方法，選自：水蒸氣蒸餾法、擠壓法、冷浸法或溶劑提取法。
[0015] 優(yōu)選的，麻欠精油是由以下方法制得：
[0016] 取麻欠植物加入水中，經(jīng)過浸泡和/或超聲后，加熱至沸騰，手機餾出液，有機溶劑 萃取其有機相，揮干有機相即得麻欠精油。
[0017] 所述的麻欠植物選自麻欠的果實、果皮、種子和莖中的一種或多種。
[0018] 優(yōu)選的，所述麻欠植物為粗粉或碎片。
[0019] 優(yōu)選的，所述有機溶劑為乙醚。
[0020] 優(yōu)選的，麻欠精油是由以下方法制得:取新鮮麻欠植物，干燥，之后在45~65°C溫 水中浸泡60~150分鐘，然后超聲波超聲處理30~60分鐘，加熱至沸騰，提取2~3小時，用乙 醚萃取，揮干乙醚即得麻欠精油。
[0021] 本發(fā)明的有益效果：
[0022] 本發(fā)明以原代培養(yǎng)的人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞(ESC)為模型，篩選發(fā)現(xiàn)麻欠精油 具有很好的抑制子宮內(nèi)膜異位種植活性，麻欠精油在較低濃度(體積濃度不低于〇.〇1%。)時 可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的原代人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞IL-8分泌，較高濃度(體積濃度不低于 0.08%。)時抑制人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞增殖并誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞凋亡 和壞死。故麻欠精油可用于制備預(yù)防或治療子宮內(nèi)膜異位癥藥物。
[0023] 麻欠精油作為一種傣藥成分，避免了西藥的諸多不良反應(yīng)，服藥期間不會影響內(nèi) 分泌生理功能，也不會影響女性患者的正常生育要求，具有明顯的臨床優(yōu)勢。
【附圖說明】
[0024] 圖1是子宮內(nèi)膜異位癥解剖示意圖；
[0025]圖2a和圖2b為人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞免疫組化鑒定，其中，圖2a為Vimentin陽 性，圖2b為cytokeratin陰性；
[0026]圖3為麻欠精油對人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞活力的影響；
[0027]圖4為麻欠精油誘導(dǎo)人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞凋亡和壞死；
[0028]圖5為麻欠精油抑制TNF-α誘導(dǎo)的人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞IL_8(白細胞介素8)分 泌。
【具體實施方式】
[0029]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進行進一步的闡述，應(yīng)該說明的是，下述說明僅 是為了解釋本發(fā)明，并不對其內(nèi)容進行限定。
[0030] 實施例
[0031] 1.材料與方法
[0032] 1.1麻欠精油的制備:新鮮麻欠果實于11月采自西雙版納孟旺鄉(xiāng)，干燥后備用。將 麻欠干燥果實浸泡在溫水(60°C，120分鐘）。然后超聲波超聲處理50分鐘，加熱至沸騰，提取 2.5小時。用乙醚萃取，揮干乙醚，得麻欠精油。
[0033] 2.試驗方法
[0034] 2.1人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞分離培養(yǎng)和鑒定
[0035] 從確診的子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位子宮內(nèi)膜組織標本中成功分離得到人子宮 異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞，具體分離純化方法參照文獻方法(唐雪蓮，謝梅青，張鳳麗.高純度分離 子宮內(nèi)膜腺上皮及間質(zhì)細胞和體外培養(yǎng)技術(shù).中山大學學報（醫(yī)學科學版）.2003,24(6): 589-592.)，并參照文獻方法對所分離得到的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞進行免疫組化鑒定（張婷 婷，張瑞曉.膠原酶分離及低速離心結(jié)合篩網(wǎng)過濾法純化子宮內(nèi)膜細胞的研究[J].生殖與 避孕.2014,34(1) :12-16.)以原代培養(yǎng)的人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞(ESC)作為子宮內(nèi)膜異 位癥的藥物篩選模型，圖2a和圖2b示出了人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞免疫組化鑒定結(jié)果。
[0036] 2.2麻欠精油對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞存活率影響實驗
[0037] 參照文獻方法以Cell Counting Kit-8(CCK-8)法測定細胞存活率(Tominaga，H.; Ishiyama,M.；Ohseto,F.；Sasamoto,K.；Hamamoto,T.；Suzuki,K.；ffatanabe,M.A water-soluble tetrazolium salt useful for colorimetric cell viability assay.[J] Anal. Commun. , 1999,36 (2), 47-50.)。CCK-8方法的原理是利用Do j indo開發(fā)的水溶性四唑 鹽一 WST￡-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉 鹽），它在電子載體1-Methoxy PMS存在的情況下能夠被還原成水溶性的甲臜染料。CCK-8溶 液可以直接加入到細胞樣品中；不需要預(yù)配各種成分。CCK-8法是用于測定細胞增殖或毒性 實驗中活細胞數(shù)目的一種高靈敏度，無放射性的比色檢測法。WSTl>-8被細胞內(nèi)脫氫酶氧 化還原后生成的橙黃色甲臜染料能夠溶解在組織培養(yǎng)基中，生成的甲臜量與活細胞數(shù)量成 正比。
[0038]將對數(shù)生長期的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞以1 X 105cells/孔接種于96孔板中，每孔200μ L培養(yǎng)體系，加入不同劑量的麻欠精油(體積濃度分別為:0.01%。，0.02%。，0.04%。，0.08%〇， 0.16%。），作用時間為24h后，每孔加入10yL CCK-8試劑，培養(yǎng)箱中孵育2h后以酶標儀450nm 讀取吸光度。
[0039] 細胞存活率（％ ) = [ (As-Ab)/(Ac-Ab) ] X 100%
[0040] As:實驗孔(含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8、麻欠精油）
[00411 Ac:對照孔(含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8)
[0042] Ab:空白孔(不含細胞和麻欠精油的培養(yǎng)基、CCK-8)
[0043] 細胞存活率檢測結(jié)果見圖3,從圖3可以看出，當麻欠精油濃度大于0.08%。時，子宮 內(nèi)膜間質(zhì)細胞細胞存活率迅速降低。
[0044] 2.3流式細胞儀檢測細胞凋亡率
[0045] 采用流式細胞儀測定細胞凋亡率，子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞接種于六孔板中，加入不同 劑量的麻欠精油（體積濃度分別為:〇. 〇 1 %。，〇. 〇2%。，0.04%。，0.08%。，0.16%。），作用時間為 24h后，收集細胞，預(yù)冷D-Hanks洗滌，重懸于binding buffer(10mmol/L HEPES，pH 7.4， 140mmol/L NaCl，2.5mmol/L CaCl2)，細胞濃度 1 X106cells/mL。取 100yL細胞懸液，加5yL Annexin V -FITC和5yL PI (50yg/mL)，于室溫黑暗中孵育 15min，加入400yL binding buffer，輕輕混勻，lh內(nèi)上流式細胞儀檢測。計算凋亡細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比。凋亡細 胞為Annexin V陽性細胞(AV+/PI-和AV+/PI+象限），壞死細胞為PI陽性細胞(AV-/PI+)。 [0046]細胞凋亡檢測結(jié)果見圖4,從圖4可以看出，當麻欠精油濃度大于0.08%。時，子宮內(nèi) 膜間質(zhì)細胞細胞凋亡率和壞死率顯著增加。
[0047] 2.4麻欠精油抑制了吧-€(誘導(dǎo)的原代人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞11^8分泌 [0048]通過TNF-a(10ng/ml，sigma公司）刺激原代人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞模擬炎癥狀 態(tài)環(huán)境，采用ELISA檢測麻欠精油對TNF-α誘導(dǎo)的原代人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞IL-8分泌的 影響，子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞接種于六孔板中，加入不同劑量的麻欠精油（體積濃度分別為： 0.01%。，0.02%。，0.04%。，0.08%。，0.16%。），作用時間為24h后，離心，收集上清液按下述方法 測定：
[0049] 1)實驗前2h從冰箱中取出試劑盒(RD公司），平衡至室溫；
[0050] 2)雙蒸水稀釋濃縮洗滌液。未用完4 °C保存；
[0051] 3)標準品配制:凍干標準品用標準品/標本稀釋液復(fù)溶，混勻，靜置15分鐘，然后倍 比稀釋，未用完標準品-20°C保存；
[0052] 4)生物素化抗體:臨用前將濃縮生物素化抗體用生物素化抗體稀釋液按說明書方 法稀釋；
[0053] 5)酶結(jié)合物:臨用前將濃縮酶結(jié)合物用酶結(jié)合物稀釋液按說明書方法稀釋；
[0054] 6)取出所需板條，其它板條密封放回4°C;
[0055] 7)除空白孔外，在其它各孔中分別加入細胞上清液(稀釋20倍)或已稀釋好的不同 濃度的標準品溶液，用封板膠紙封住反應(yīng)，37°C孵育90min;
[0056] 8)洗板4次:甩盡板孔內(nèi)液體，每孔加洗滌液300yL，靜止30S后甩盡液體，在后迭吸 水紙上拍干，再加入洗液；
[0057] 9)每孔加生物素化抗體工作液100yL，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 °C孵育60min;
[0058] 10)洗板4次；
[0059] 11)每孔加酶結(jié)合物工作液100yL，封住板孔，37 °C孵育30min;
[0060] 12)洗板4次；
[0061 ] 13)每孔加顯色劑100yL，避光，37°C孵育15-25min(視顏色深淺掌握）；
[0062] 14)每孔加終止液100yL，混勻，即刻在450nm處讀數(shù)(5分鐘內(nèi)）；
[0063] 15)結(jié)果計算:每個標準品和樣品的0D值應(yīng)減去零孔的0D值，以標準品濃度和0D值 繪制標準曲線，通過樣品0D值求出其濃度，再乘以稀釋倍數(shù)。
[0064] 檢測結(jié)果見圖5,結(jié)果顯示麻欠精油在不影響細胞活力的濃度下即可抑制TNF-α誘 導(dǎo)的人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞IL-8分泌（圖5)
[0065]上述雖然結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】進行了描述，但并非對本發(fā)明保護范 圍的限制，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做 出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護范圍以內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 麻欠精油在制備預(yù)防和治療子宮內(nèi)膜異位癥藥物中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述子宮為人子宮。
【文檔編號】A61K36/758GK106038781SQ201610644674
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月9日 公開號201610644674.4, CN 106038781 A, CN 106038781A, CN 201610644674, CN-A-106038781, CN106038781 A, CN106038781A, CN201610644674, CN201610644674.4
【發(fā)明人】楊必成, 張萍, 黃歐平
【申請人】中國科學院西雙版納熱帶植物園