人組織激肽釋放酶1膠體金定量檢測試紙卡的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及檢測人組織激肽釋放酶1(hK1)膠體金定量檢測試紙卡及其相關(guān)抗體。本發(fā)明制備了多種單克隆抗體，并進行配對篩選，獲得靈敏度及特異性均能滿足需求的抗體組合(A24及A32)；同時其方便大量生產(chǎn)，可滿足日后大規(guī)模臨床應(yīng)用的需求。對上述抗體組合進行檢測體系的調(diào)試優(yōu)化工作，獲得操作簡便，靈敏度，特異性及相關(guān)檢測性能都較好的人組織激肽釋放酶1的膠體金免疫層析定量檢測卡。
【專利說明】
人組織激化釋放酶1膠體金定量檢測試紙卡
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于免疫化學技術(shù)領(lǐng)域，具體的設(shè)及檢測人組織激膚釋放酶1 OiKl)膠體 金定量檢測試紙卡及其相關(guān)抗體。
【背景技術(shù)】
[0002] 屯、腦血管疾病是嚴重危害人類健康的主要慢性非傳染性疾病。其中冠屯、病及腦卒 中是世界上最常見的死亡原因。在我國，隨著人口的老齡化，W冠屯、病，腦卒中為代表的屯、 腦血管疾病的發(fā)病率，致死率及致殘率呈逐年上升的趨勢。但是，80%的腦卒中是可W預防 的。糖尿病腎病是糖尿病最常見的并發(fā)癥，嚴重危害糖尿病患者的生命質(zhì)量和醫(yī)療消費質(zhì) 量。若不從循證醫(yī)學的高度采取積極的干預措施，糖尿病腎病就會在較短的時間內(nèi)發(fā)展為 不可逆轉(zhuǎn)的終末期腎病，嚴重威脅患者的生存壽命。因此，積極尋找有效的方法，早期診斷 腦卒中、糖尿病腎病W進行有效的防護直接關(guān)系著患者的生命質(zhì)量及生存壽命。
[000引激膚釋放酶一激膚系統(tǒng)化allikrein-kinin system, KK巧又稱激膚系統(tǒng)，廣泛存 在于動物體內(nèi)的多個系統(tǒng)，尤其是在屯、血管系統(tǒng)內(nèi)分布更為密集。該系統(tǒng)有廣泛生物學活 性，并且和凝血系統(tǒng)、腎素-血管緊張素系統(tǒng)W及多種血管活性因子系統(tǒng)等存在密切的聯(lián) 系和交叉對話，共同維護人體多器官正常的生理機能和參與各種復雜的病理生理過程，具 有調(diào)節(jié)屯、血管、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)和葡萄糖代謝，舒張血管、參與炎癥反應(yīng)、疼痛刺激和休克反 應(yīng)。近年來關(guān)于激膚系統(tǒng)的臨床研究主要集中在屯、血管、腎臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作 用。
[0004] 人組織激膚釋放酶是激膚系統(tǒng)最重要的組成部分，是一組分泌型絲氨酸蛋白酶， 包含15個成員。在所有已知的組織激膚釋放酶中，只有人組織激膚釋放酶1 (膜/腎激膚 釋放酶，Human kalIikrein l，hKl，KLKl，又稱激膚原酶，Kininogenase)能有效水解低分子 量激膚原（LMWK)，釋放具有活性的激膚，進而發(fā)揮屯、血管系統(tǒng)及腎臟功能的調(diào)節(jié)作用。基礎(chǔ) 研究表明，在多種高血壓動物模型中已證實，hKl具有降低血壓，減輕腎臟和屯、臟肥大及纖 維化的作用；其在進行屯、臟重塑，減輕腎臟損害，降低腦梗死發(fā)生率W及降低神經(jīng)損傷危害 等方面的作用。同時，通過外源性給藥的方法，亦證明了 hKl在防止中風，屯、腦血管W及腎 臟疾病方面的作用。近些年來，進一步的研究表明，MQ水平在人的屯、腦血管疾病的發(fā)生發(fā) 展的過程中具有重要的臨床意義，可能作為預測腦卒中發(fā)病率的指標。MQ水平可預測腦卒 中的發(fā)病及五年無事件性生存率，可讓患者早期預防并采取相應(yīng)的措施，從而一定程度上 降低腦卒中的發(fā)生概率。另外，MQ較尿微量白蛋白排泄率可更早的診斷早期糖尿病腎病。 綜上可見，hKl的水平對于人的屯、腦血管疾病及糖尿病腎臟疾病具有重要的預測價值。因 此，準確測定MQ的水平，在臨床及科研中均具有重要的意義。 陽0化]鑒于MQ在屯、腦血管疾病及糖尿病腎臟疾病中的治療及預測作用，制備MQ定量 檢測試劑盒具有重要臨床的應(yīng)用價值。國內(nèi)外已有MQ科研用定量檢測試劑盒：其中部分 試劑盒采用競爭法，抗體為多克隆抗體，其操作繁雜，計算繁瑣且易出現(xiàn)非特異性結(jié)合而導 致檢測結(jié)果誤差較大；部分試劑盒采用多克隆抗體的夾屯、法檢測模式，亦存在非特異性結(jié) 合的影響；另外一些試劑盒采用多克隆抗體及單克隆抗體的雙抗體夾屯、的模式，其檢測性 能有待進一步驗證。雙抗體夾屯、法的檢測模式可有效避免上述問題。因此，多表位，高靈 敏度，特異性的抗體的制備是高質(zhì)量的人組織激膚釋放酶1定量檢測試劑盒的關(guān)鍵因素之 一。天然MQ存在多個糖基化位點，因而重組表達MQ在糖基化位點等其他構(gòu)象方面可能 與天然蛋白存在較大的差異。在特異性抗體篩選時采用重組MQ進行篩選就會出現(xiàn)篩選的 特異性抗體不能有效識別天然MQ的問題。本發(fā)明采用人天然MQ進行抗體的篩選工作， 可有效避免上述情況的發(fā)生，且已證實其與天然MQ的結(jié)合力。
[0006] 同時，為滿足市場的不同應(yīng)用需求，本發(fā)明制備了=種MQ定量檢測試劑盒：人組 織激膚釋放酶IELISA定量檢測試劑盒，可滿足一般小型綜合醫(yī)院的應(yīng)用需求，且日后可發(fā) 展升級為化學發(fā)光法定量檢測（全自動），滿足大型綜合醫(yī)院的全自動檢測的應(yīng)用需求。人 組織激膚釋放酶1膠體金定量檢測試紙卡及人組織激膚釋放酶1巧光定量檢測試紙卡，均 可滿足快速檢測及床邊檢測的需求。其中膠體金定量檢測法靈敏度和準確度雖不如巧光定 量檢測法，但其使用方便易于推廣且成本較低，可基本滿足疾病指標的定量檢測，適合于基 層醫(yī)療系統(tǒng)中的即時檢測。巧光定量具備更高的檢測靈敏度，適用于檢測要求較高的檢驗 中屯、或大型醫(yī)院臨床科室的床邊診斷的應(yīng)用需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供能有效的、特異性結(jié)合人組織激膚釋放酶1的抗 體。更具體地說：
[0008] 本發(fā)明的第一目的在于提供兩種抗人組織激膚釋放酶1抗體。
[0009] 第一種抗人組織激膚釋放酶1抗體（A24)，
[0010] 其重鏈可變區(qū)含有W下的互補決定區(qū)：氨基酸序列如序列SEQ ID NO :1所示的 HCDR1、如序列沈Q ID NO :2所示的HCDR2和/或如序列沈Q ID NO :3所示的HCDR3 ; W11] 化及其輕鏈可變區(qū)序列含有W下的互補決定區(qū)：氨基酸序列如序列SEQ ID NO :4 所示的LCDR1、如序列SEQ ID N0:5所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID N0:6所示的LCDR3。
[0012] 優(yōu)選的是本發(fā)明中的抗體A24的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示， 輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示。
[0013] 第二種抗人組織激膚釋放酶1抗體（A32)，
[0014] 其重鏈可變區(qū)含有W下的互補決定區(qū)：氨基酸序列如序列SEQ ID NO :9所示的 HCDR1、如序列沈Q ID NO :10所示的HCDR2和/或如序列沈Q ID NO :11所示的HCDR3 ; 陽0巧]W及其輕鏈可變區(qū)序列含有W下的互補決定區(qū)：氨基酸序列如序列SEQ ID NO: 12所示的LCDRl、如序列沈Q ID NO : 13所示的LCDR2和/或如序列沈Q ID NO : 14所示的 LCDR3。
[0016] 優(yōu)選的是本發(fā)明中的抗體A32的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:15所示， 輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示。
[0017] 本發(fā)明第二個目的是提供兩種單鏈抗體，所述單鏈抗體A24的氨基酸序列如SEQ ID NO: 17所示；所述單鏈抗體A32的氨基酸序列如SEQ ID NO: 18所示。優(yōu)選的，所述單鏈 抗體A24、A32中不含由六個組氨酸構(gòu)成的HIS標簽。
[0018] 本發(fā)明第=個目的是提供兩種編碼上述單鏈抗體的核巧酸序列，編碼單鏈抗體 A24的核巧酸序列如SEQ ID NO: 19所示，和編碼單鏈抗體A32的核巧酸序列如SEQ ID NO: 20所示。
[0019] 本發(fā)明第四個目的是提供一種含有上述核巧酸序列的表達載體。
[0020] 本發(fā)明第五個目的是提供一種含有上述表達載體的重組宿主細胞。所屬宿主細胞 可W是大腸桿菌、酵母或哺乳動物細胞，優(yōu)選為畢赤酵母。
[0021] 本發(fā)明第六個目的是提供一種生產(chǎn)上述單鏈抗體的方法，包括：
[0022] 1)在合適的條件下培養(yǎng)上述重組宿主細胞表達抗體； 陽023] 2)然后從宿主細胞中純化、收集抗體。
[0024] 本發(fā)明的第屯個目的在于提供上述抗人組織激膚釋放酶1抗體在檢測人組織激 膚釋放酶1含量中的應(yīng)用。
[00巧]本發(fā)明的第八個目的在于提供一組可進行配對并檢測人組織激膚釋放酶1的抗 體對組合；該抗體對組合的檢測靈敏度高，特異性好。
[00%] 本發(fā)明的第九個目的在于提供一種利用所述抗人組織激膚釋放酶1抗體檢測人 組織激膚釋放酶1的酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒，包括包被了 A24或A32抗體的酶標板、樣品 稀釋液、標準品、含有酶標抗體A32或A24的檢測液、洗涂液、顯色液及終止液。其檢測步驟 主要包括：
[0027] (1)向包被A24或A32抗體的酶標板中加入樣本稀釋液后，再加入樣本稀釋液稀釋
[0028] 的標準品、陰性對照及血清或血漿等待檢樣本；
[0029] (2)加入樣本稀釋液稀釋的檢測液；
[0030] 做加入顯色液
[0031] (4)加入終止液并讀取OD值。
[0032] 所述酶標抗體A32或A24是辣根過氧化物酶標記的抗體A32或A24 (A32-HRP或 A24-HR巧或者堿性憐酸酶標記的抗體A32或A24(A32-AP或A24-AP);所述標準品為中國倉 鼠卵巢細胞（CHO)表達重組人組織激膚釋放酶1的純化蛋白。
[0033] 本發(fā)明的第十個目的在于提供一種利用所述抗人組織激膚釋放酶1抗體檢測人 組織激膚釋放酶1的膠體金免疫層析定量檢測卡，包括樣品吸收墊、金標墊、反應(yīng)膜和吸水 墊；所述金標墊噴涂有膠體金顆粒標記的抗體A32或A24,所述反應(yīng)膜上有檢測帶和質(zhì)控 帶，檢測帶位置包被有抗體A24或A32,質(zhì)控帶位置包被抗化S標簽抗體或Protein L。
[0034] 本發(fā)明第十一個目的在于提供一種利用所述抗人組織激膚釋放酶1抗體檢測人 組織激膚釋放酶1的時間分辨免疫巧光層析定量檢測卡，包括樣品吸收墊、巧光微球墊、反 應(yīng)膜和吸水墊；所述巧光微球墊噴涂有巧光微球標記的上述所述抗體A32或A24,所述反 應(yīng)膜上有檢測帶和質(zhì)控帶，檢測帶位置包被有上述所述抗體A24或A32,質(zhì)控帶位置包被抗 His標簽抗體或Protein L。
[0035] 所述反應(yīng)膜優(yōu)選硝酸纖維素膜。所述抗化S標簽抗體優(yōu)選鼠抗化S抗體。
[0036] 本發(fā)明制備了多種抗體，并進行配對篩選，獲得靈敏度及特異性均能滿足需求的 抗體組合（A24及A32);同時其方便大量生產(chǎn)，可滿足日后大規(guī)模臨床應(yīng)用的需求。對上述 抗體組合進行檢測體系的調(diào)試優(yōu)化工作，獲得操作簡便，靈敏度，特異性及相關(guān)檢測性能可 滿足臨床樣本檢測的人組織激膚釋放酶1的酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒、人組織激膚釋放酶 1的膠體金免疫層析定量檢測卡及人組織激膚釋放酶1的時間分辨免疫巧光層析定量檢測 卡。
【附圖說明】
[0037] 圖1.抗體重鏈及輕鏈可變區(qū)基因電泳圖。Lane 1為標準DNA，Lane 2為抗體A24 重鏈可變區(qū)DNA，Lane 3為抗體A24輕鏈可變區(qū)DNA，Lane 4為抗體A32重鏈可變區(qū)DNA， Lane 5為抗體A32輕鏈可變區(qū)DNA。
[0038] 圖2.單鏈抗體結(jié)構(gòu)示意圖。Vh表示重鏈可變區(qū)序列，V L表示輕鏈可變區(qū)序列，His 標簽為六個組氨酸。
[0039] 圖3.單鏈抗體表達PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖（a)為A24基因 PCR產(chǎn)物； 圖化）為A32基因 PCR產(chǎn)物。
[0040] 圖4.重組畢赤酵母菌株誘導表達上清培養(yǎng)液鑒定圖。圖4(a)為抗體A24重組畢 赤酵母菌株誘導表達上清培養(yǎng)液鑒定圖；圖4(b)為抗體A32重組畢赤酵母菌株誘導表達上 清培養(yǎng)液鑒定圖。上述左圖為SDS-PAGE電泳鑒定圖、右圖為Western blot鑒定圖。
[0041] 圖5.單鏈抗體純化效果圖（SDS-PAGE)。圖（a)為抗體A24,圖化）為抗體A32。
[0042] 圖6.抗體A24及A32的Western Blot鑒定圖。泳道1為尤瑞克林扣K);泳道2 為酵母表達MQ ;泳道3為大腸桿菌表達MQ ;泳道4為C冊表達MQ。圖（a)為A32抗體 Western Blot 結(jié)果；圖（b)為 A24 抗體 Western Blot 結(jié)果。
[00創(chuàng)圖7.本發(fā)明酶聯(lián)免疫檢測試劑盒標準曲線。其中橫坐標為蛋白濃度（ng/mL);縱 坐標為檢測0D450 ;r表示檢測相關(guān)系數(shù)，為0. 99980322。
[0044] 圖8.本發(fā)明酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測特異性。橫坐標為檢測物濃度（ng/mL);縱 坐標為檢測OD值。UK表示尤瑞克林，是從人尿液中提取的人組織激膚釋放酶1 ;KLK2表示 人組織激膚釋放酶2 ;KLK3表示人組織激膚釋放酶3。
[0045] 圖9.本發(fā)明膠體金免疫層析定量檢測卡及時間分辨免疫巧光層析定量檢測卡結(jié) 構(gòu)示意圖。1為樣品墊、2為反應(yīng)膜、3為吸收墊、4為質(zhì)控線（C線）、5為檢測線燈線）、6 為金標墊或巧光結(jié)合墊、7為PVC片材。
[0046] 圖10.本發(fā)明膠體金免疫層析定量檢測卡標準曲線。其中橫坐標為蛋白濃度（ng/ 血）；縱坐標為T/C值；r2為0. 992。
[0047] 圖11.本發(fā)明時間分辨免疫巧光層析定量檢測卡標準曲線。其中橫坐標為蛋白濃 度（ng/mL);縱坐標為檢測值；r2為0. 9952。
[0048] 圖12.時間分辨免疫巧光層析定量檢測與酶聯(lián)免疫檢測結(jié)果相關(guān)性
【具體實施方式】 陽049] 定義
[0050] "抗體"又稱免疫球蛋白，是一類由B淋己細胞分泌的大型Y形蛋白質(zhì)，能夠通過 Y形的其中兩個分叉頂端的互補位點（抗原結(jié)結(jié)合位）特異性結(jié)合祀抗原的免疫球蛋白分 子，所述祀抗原如蛋白質(zhì)、糖、多核巧酸、脂、多膚、小分子化合物等。
[0051] "單鏈抗體"（scFv)指的是抗體的重鏈可變區(qū)（Vh)和輕鏈可變區(qū)（\)通過15~ 20個氨基酸短膚（linker)連接形成的單一鏈融合蛋白，用于連接的linker通常富含甘氨 酸和絲氨酸，W利于單鏈抗體的穩(wěn)定性與柔初性。連接方式可將\的N端連接至V H的C末 端，或者相反。盡管去除了恒定區(qū)并引入linker,單鏈抗體依然保留了抗體對抗原的特異 性，且其具有分子量小、穿透力強和抗原性弱等特點。
[0052] 互補決定區(qū)（complementarit^determining region, CDR)，也叫做高變區(qū)。成型 于抗體單體氨基酸的末端，是祀抗原與抗體結(jié)合的最關(guān)鍵區(qū)域，在免疫網(wǎng)絡(luò)理論中，每個抗 體的互補決定區(qū)又被稱為獨特型或者基因型。
[0053] W下實施例中所用標準品均為C冊系統(tǒng)表達重組MQ (Img/mU制備方法見專利 201310746269. X)
[0054] 實施例1.抗人組織激膚釋放酶1雜交瘤細胞株的制備 陽〇5引 1.動物免疫 W56] W重組人組織激膚釋放酶1(中國倉鼠卵巢細胞表達，制備方法見專利 201310746269.訝按照一般免疫程序免疫BALB/c雌性小鼠（購自常州卡文斯實驗動物有限 公司）。具體免疫情況參見《抗體制備與使用實驗指南》。采用間接化ISA法跟蹤免疫小鼠 血清滴度，選取血清效價最高的免疫小鼠，將小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞進行融合實驗。 [0057] 2.細胞融合 陽05引 （1).脾臟細胞的制備
[0059] 將免疫小鼠，摘眼球取血，經(jīng)斷頸椎處死后置于75% (v/v)的酒精中浸泡10分鐘， 于無菌操作臺中取出其脾臟，置于細胞篩網(wǎng)中，充分研磨細胞，過篩網(wǎng)，用無菌1640培養(yǎng)基 (購自Gibco公司）離屯、洗涂數(shù)次后，重懸細胞W制成單細胞懸液，并計數(shù)，備用。
[0060] (2).飼養(yǎng)細胞的制備
[0061] 取8~10周齡的雌性BALB/c小鼠一只，摘眼球獲取陰性血清，經(jīng)斷頸椎處死后置 75% (v/v)酒精中浸泡10分鐘；無菌掲開腹部皮膚，暴露腹膜，用注射器將約IOmL 1640HT 培養(yǎng)基（購自SIGMA公司）注入小鼠腹腔，輕輕按摩腹部并吹打數(shù)次。吸取含有巨隧細胞 的培養(yǎng)基注入20% 1640HAT培養(yǎng)基中備用； 陽06引取2~3周齡的雌性BALB/c小鼠一只，經(jīng)斷頸椎處死后置于75 % (v/v)酒精中浸 泡10分鐘；無菌取胸腺于細胞篩網(wǎng)中，研磨，過篩網(wǎng)，獲得胸腺細胞置于上述含有巨隧細胞 的20% 1640HAT培養(yǎng)基中，備用。 陽〇6引 （3).細胞融合
[0064] 選擇處于對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細胞株SP2/0,收集并計數(shù)。取約IO8個上述脾 細胞與2 X IO7個上述SP2/0細胞株加入融合管中混合，100化pm離屯、10分鐘后棄上清（盡 量棄凈），將融合管置手掌上來回輕輕摩擦W使沉淀松散。60秒內(nèi)先慢后快地加入ImL預熱 的陽G1450(聚乙二醇1450,購自SIGMA公司），加入1640HT培養(yǎng)基30血終止，100化pm離 屯、10分鐘，去上清，輕輕摩擦使沉淀松散，加入步驟2所獲得的20%的1640HAT培養(yǎng)基中。 陽0化]將上述HAT培養(yǎng)基充分混勻后，W 200 y L/孔分裝至96孔細胞培養(yǎng)板中，置37°C， 5% C02的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一周后用10% 1640HT培養(yǎng)基替換20% 1640HAT培養(yǎng)基，3 天后取上清進行檢測。
[0066] 3.抗人組織激膚釋放酶1特異性雜交瘤細胞株篩選
[0067] (1).檢測板的準備：用CB包被液稀釋尤瑞克林0JK，購買于廣東天普生化醫(yī)藥公 司）至1 y g/mU包被96孔化ISA酶標板，100 y L/孔，2~8°C包被過夜，洗涂一次拍干；含 2%酪蛋白的PBST緩沖液封閉（200uL/孔），37°C封閉2小時；拍干，備用。 W側(cè) 似.陽性克隆的篩選：將待檢細胞培養(yǎng)上清lOOiiL/孔加入上述檢測板中，于 37°C作用30分鐘后洗涂并拍干，加入100 y L/孔的HRP標記的羊抗鼠 IgG,于37°C作用 30分鐘后洗涂并拍干，加入100 y L/孔的TMB顯色液，于37°C避光顯色15分鐘，每孔加入 50 y L的2M H2SO4終止反應(yīng)，并于0D450處讀取數(shù)值。陽性孔確定原則：0D450值/陰性對 照值>2.1。選取陽性克隆株進行細胞克隆化篩選。經(jīng)過=至四輪的克隆化篩選后，單克 隆細胞株陽性率100%即確定為穩(wěn)定細胞株，對細胞株進行定株。雜交瘤細胞株C24及C32 均具有較高的效價，遂后續(xù)進一步對上述雜交瘤細胞株進行抗體可變區(qū)序列測序分析。
[0069] 實施例2.雜交瘤細胞株抗體可變區(qū)序列的測定
[0070] 對上述雜交瘤細胞株C24及C32抗體可變區(qū)序列進行測定。
[0071] a. RNA的提?。簠⒄占毎俁NA抽提試劑盒（購自Roche公司）說明書對上述雜 交瘤細胞株C24及C32進行總RNA提取并立即進行反轉(zhuǎn)錄；
[0072] b. RNA 反轉(zhuǎn)錄成為 DNA :參照 Hiermo Scientific Reverted First strand cDNA Synthesis Kit (購自化ermo公司）對上一步驟中所提取的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，制得cDNA， 凍存于-20°C備用； 陽07引 C.可變區(qū)序列的PCR擴增及回收：W上一步驟中所得CDNA為模板，W鼠 IgG亞型 單克隆抗體可變區(qū)序列通用引物為引物，對重鏈及輕鏈的可變區(qū)序列進行PCR擴增，將PCR 產(chǎn)物經(jīng)DNA膠回收試劑盒（購自TIANGEN公司）進行回收，見附圖1 ;
[0074] d.可變區(qū)序列的克隆和序列測定：按照克隆載體PMD18-T kit(購自Takara公 司）說明書，將重鏈和輕鏈可變區(qū)基因分別與PMD18-T載體進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌畑5a， 挑取陽性克隆，交由Invitrogen?公司進行測序。
[0075] 測序得到雜交瘤細胞株C24的抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示、 輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO :8所示。Vbase2數(shù)據(jù)庫分析上述序列，其重鏈可變區(qū) 的各互補決定區(qū)的氨基酸序列分別是：如序列SEQ ID NO :1所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO :2所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO :3所示的HCDR3 ;其輕鏈可變區(qū)的各互補決定 區(qū)的氨基酸序列是：如序列SEQ ID NO :4所示的LCDRl、如序列SEQ ID NO :5所示的LCDR2 和/或如序列SEQ ID NO :6所示的LCDR3。
[0076] 測序得到雜交瘤細胞株C32的抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示、 輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO :16所示。Vbase2數(shù)據(jù)庫分析上述序列，其重鏈可變 區(qū)的各互補決定區(qū)的氨基酸序列分別是：如序列SEQ ID NO :9所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO :10所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO :11所示的HCDR3 ;其輕鏈可變區(qū)的各互補決 定區(qū)的氨基酸序列是：如序列SEQ ID NO : 12所示的LCDRl、如序列SEQ ID NO : 13所示的 LCDR2和/或如序列沈Q ID NO :14所示的LCDR3。
[0077] 實施例3.單鏈抗體的重組表達及純化
[0078] 根據(jù)實施例2中測序結(jié)果，分別將雜交瘤細胞株C24及C32的抗體重鏈及輕鏈可 變區(qū)之間加入連接膚（GGGG巧3,引入六個組氨酸，并將其全基因按照畢赤酵母表達系統(tǒng)的 偏愛性進行密碼子優(yōu)化的方法，進行單鏈抗體的重組表達。所表達得到的抗體分別命名為 抗體A24和抗體A32,其結(jié)構(gòu)組成如附圖2所示。上述單鏈抗體的重組表達具有如下： 陽0巧]1.融合蛋白基因的表達質(zhì)粒構(gòu)建
[0080] 密碼子優(yōu)化后的抗體A24的基因序列如SEQ ID NO: 19所示、氨基酸序列如SEQ ID N0:17所示；密碼子優(yōu)化后的抗體A32的核巧酸序列如SEQ ID N0:20所示、氨基酸 序列如SEQ ID N0:18所示。將優(yōu)化后的抗體A24及A32全基因合成的片段上游引入 pPICZ a A載體中化Ol序列后DNA序列，下游引入甜al酶切位點，構(gòu)建到PMD19-T Simple Vector質(zhì)粒（購自Invitrogen公司）中，得到一種長期保存質(zhì)粒，質(zhì)粒記為pMD19-A24、 PMD19-A32。進行PCR擴增，其中上游引物Pl為CGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC GAC ;下游引物 P2為：AGCGGATAACAATTTCACACAGGA。常規(guī)PCR程序后，瓊脂糖凝膠電泳分析（附圖3)，顯 示兩種產(chǎn)物大小與預期大?。?9化p、8(K)bp) -致。將PCR獲得基因產(chǎn)物回收純化后，采 用）(h〇U#R0146S，購自化W ^igland Biol油S 公司）和甜aU#R0145V,購自化W ^igland Biol油S公司）雙酶切，用T4連接酶連接到pPICZaA(V19520,購自Invitrogen)質(zhì)粒中， 轉(zhuǎn)化到D冊a感受態(tài)細胞中，在含有Zeocin巧250-01，購自Invitrogen公司）的LB平板中 37°C培養(yǎng)過夜。第二天篩選陽性克隆菌測序，比對，與預期序列完全一致，即得到抗體A24 及A32的表達質(zhì)粒，分別記為pPICZ a -A24、pPICZ a -A24。
[0081] 2.融合蛋白基因在畢赤酵母宿主工程菌株的構(gòu)建、篩選及表達
[0082] 畢赤酵母感受態(tài)細胞、YPDS固體培養(yǎng)基、BMGY培養(yǎng)基、BMMY培養(yǎng)基：均購自 Invitrogen 公司。
[0083] 將pPICZ a -A24及pPICZ a -A32質(zhì)粒，用SacI限制性內(nèi)切酶酶切線性化。乙醇沉 淀后將線性化載體，分別電轉(zhuǎn)化進入到X-33感受態(tài)酵母細胞，分別涂布到含有Zeocin的 YPDS固體培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)3-5天，就有陽性克隆產(chǎn)生。
[0084] 挑取上述獲得的單克隆于5mL BMGY培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)至ODe。。= 2. 0~6. 0時， 取ImL保存菌種，并將剩余菌液重懸后轉(zhuǎn)移到BMMY中小量誘導表達，每隔24h補加甲醇至 終濃度為1 % (v/v)。一周后，離屯、收集菌液上清，通過SDS-PAGE凝膠電泳和蛋白免疫印跡 分析（Western blot)，觀察目標蛋白表達情況（附圖4) oWestern blot中一抗為抗HlS-hg 抗體化S-化g(2A8)Mouse mAb，M20001，購于艾比瑪特生物醫(yī)藥（上海）有限公司）。
[00化]將上述獲得的A24及A32重組融合蛋白基因工程菌株分別接種于BMGY培養(yǎng)基中， 30°C，220巧m培養(yǎng)至菌體密度到ODe。。= 2. 0~6. 0,每隔24小時補加甲醇至終濃度為1. 0% (v/v)。一周后，收集發(fā)酵培養(yǎng)液。
[0086] 3.融合蛋白純化
[0087] 采用組氨酸標簽親和柱純化抗體A24及抗體A32融合蛋白，預裝柱子選擇為 HisTrap HP，具體步驟如下：
[0088] (1)發(fā)酵液的除雜預處理：將上述表達得到抗體A24及A32融合蛋白發(fā)酵液上 清，離屯、收集上清，并加入結(jié)合緩沖液，使得上清終濃度為SOOmM化Cl, 20mM NaHzPCV IOmM Imidazole，調(diào)抑7. 5,0. 45 Ji m 濾膜過濾。
[0089] (2)HisTrap HP親和柱純化：運用全自動智能蛋白純化系統(tǒng)（AKTA avantl50,購自 GE healcare公司）對預處理獲得的抗體A24及抗體A32融合蛋白發(fā)酵液進行親和純化， 柱子為Hishap HP(17-5248-02,購自GE healcare公司）。結(jié)合緩沖液為300mM化Cl, 20mM 化HzPCVlOmM Imidazole,抑7. 5,洗脫緩沖液為 SOOmM NaClJOmM 化HzPCVSOOmM Imidazole, pH7. 5。洗脫時進行線性洗脫，并收集各個洗脫峰。通過SDS-PAGE電泳鑒定純 度，由附圖5可知，兩種純化后的蛋白純度均達到95% W上；合并符合要求的收集管，更換 緩沖液為PBS溶液并超濾濃縮（Img/ml)，過濾除菌于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0090] 本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，重組蛋白可W不帶標簽，也可帶其他標簽，也可加入其他形 式的連接膚。無論是否帶標簽或者帶不同形式的標簽都可采用Capto L純化。
[0091] 實施例4.抗體的性能評價
[0092] 1.抗體 A24 及 A32 的 Western blot 鑒定
[0093] a.聚丙締酷胺凝膠電泳：配置12%分離膠、5%濃縮膠，分別上樣標準蛋白質(zhì)、尤 瑞克林扣K)、畢赤酵母表達MQ、大腸桿菌表達hKl W及CHO系統(tǒng)表達MQ，恒壓下電泳1小 時；
[0094] b.轉(zhuǎn)膜：恒流（35mA/膜）條件下轉(zhuǎn)膜1小時，將兩塊聚丙締酷胺凝膠上的蛋白質(zhì) 分別轉(zhuǎn)移至兩張硝酸纖維素膜上?？捡R斯亮藍G250對完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進行染色， 觀察蛋白的殘留情況； 陽0河 C.封閉：含5%脫脂奶的TBST緩沖液封閉（封閉液），4°C過夜；封閉后洗涂液 燈BST，詳見TaKaRa公司TBST buffer)洗涂一次，10分鐘； W96] d.抗原抗體反應(yīng)：封閉液稀釋（按1:400體積比）辣根過氧化物酶標記 A24(A24-HRP，lmg/mU本公司采用經(jīng)典過艦酸鋼法標記，下同）及辣根過氧化物酶標記 A32 (A32-HRP，Img/mU本公司采用經(jīng)典過艦酸鋼法標記，下同），分別加入上述兩張硝酸纖 維素膜中，室溫反應(yīng)1小時；TBST洗涂5次，每次10分鐘；
[0097] e.顯色及拍照：吸干硝酸纖維素膜上殘留液體，每張硝酸纖維素膜分別加入2血 穩(wěn)定型過氧化物酶溶液（ImL)與魯米諾/增強劑溶液（ImL)的混合液（購買于化ermo公 司），均勻潤濕硝酸纖維素膜的表面，室溫避光反應(yīng)一分鐘后于凝膠成像系統(tǒng)（購買于GE公 司）拍照，留取結(jié)果。
[0098] 實驗結(jié)果（附圖6)表明，本發(fā)明兩種抗體均可與四種來源的MQ反應(yīng)，證明了本 發(fā)明兩種抗體的反應(yīng)性，且證明其與天然MQ均有較好的反應(yīng)。另外，實驗結(jié)果可見，四種 來源MQ的分子量均與理論值相符：UK為天然此1，糖基化程度最高，故其分子量最大；大 腸桿菌表達hKl糖基化程度最低，故分子量最?。籆HO系統(tǒng)表達hKl糖基化程度稍低于天然 蛋白但高于酵母表達MQ，故其分子量介于UK及酵母表達MQ之間。
[0099] 2.抗體A24及A32在ELISA檢測平臺的性能評價
[0100] 將上述制備例中抗體進行配對組合，分別作為包被抗體或標記抗體進行配對檢測 標準品，檢測步驟如下： 陽W] 1)采用20mM PH7. 4的PB緩沖液將YO (非相關(guān)單鏈抗體，作為陰性對照，制備方法 參加
【申請人】在先申請：201410020156. 6)、A24或A32 (作為包被抗體）分別稀釋至8ug/mL， 分裝至酶標板中（lOOuL/孔），4°C，過夜（16小時）；
[0102] 2)PBST(含 0. 05% Tween-20 的 20mM PB7. 4,下同）洗涂一次（200uL/ 孔）后拍 干； 陽1〇引如封閉液（含質(zhì)量體積比為2% BSA的PBST)封閉（200uL/孔），37°C，2小時；棄 去封閉液后拍干；
[0104] 4)樣本稀釋液稀釋標準品，至濃度（ng/mL)為200、100及0。分別將上述濃度溶 液加入至步驟3)獲得的包被有A24及A32的酶標板中（lOOuL/孔），37°C反應(yīng)1小時；PBST 洗涂5次（200uL/孔）后拍干； 陽105] 5)按照1:2000體積比稀釋HRP標記A24 (A24-HRP)或A32 (A32-HRP)(作為標記抗 體）；向步驟4)所獲酶標板中分別加入稀釋的A32-HRP或A24-HRP，37°C反應(yīng)30分鐘；PBST 洗涂5次后拍干； 陽106] 6)加入TMB顯色液（購買于湖州英創(chuàng)公司），IOOuL/孔，37°C反應(yīng)15分鐘； 陽1〇7] 7)加入2M H2SO4終止液，50uL/孔，立即于酶標儀（購買于Thermo公司）讀取 孤450。 陽108] 結(jié)果如下表： 陽 109]
[0110] 由上述結(jié)果可知，A32、A24組成的雙抗體夾屯、檢測系統(tǒng)可應(yīng)用于酶聯(lián)免疫檢測平 臺，且A24 (包被）-A32 (標記），A32 (包被）-A24 (標記）兩種配對均有較好的檢測效果。 與非相關(guān)抗體無非特異性反應(yīng)。 陽111] 3.抗體A24及A32在膠體金檢測平臺的評價
[0112] 用樣本稀釋液稀釋標準品至濃度為20化g/ml，10化g/ml，將運兩個濃度和 0. 025mol/L pH7. 5的PBS分別添加50uL到膠體金檢測卡中（A24包被-A32標記或A32包 被-A24標記，具體制備參見實施例6)，IO-ISmin內(nèi)將檢測卡放在讀數(shù)儀上進行檢測。檢測 結(jié)果如下： 陽11引
[0114] 上述結(jié)果可見，A32、A24組成的雙抗體夾屯、檢測系統(tǒng)可應(yīng)用于膠體金檢測平臺，且 A24 (包被）-A32 (標記），A32 (包被）-A24 (標記）兩種配對均有較好的檢測效果。
[0115] 4.抗體A24及A32在時間分辨巧光檢測平臺的評價
[0116] 用0. 025mol/L pH7. 5的PBS將A24或A32稀釋至Img/ml，劃線于硝酸纖維素膜 上；用0. 05mol/L P冊.0的棚酸緩沖液將時間分辨巧光微球標記的A32或A24稀釋20倍， 噴點于結(jié)合墊上；按附圖9所示貼膜、切條、裝卡（具體制備參見實施例7)。將檢測卡分別 檢測濃度含量為200、l(K)ng/ml的標準品和0. 025mol/L pH7. 5的PBS，檢測結(jié)果如下： 陽117]
[0118] 由上述結(jié)果可知，A32、A24組成的雙抗體夾屯、檢測系統(tǒng)可應(yīng)用于時間分辨巧光檢 測平臺，且A24 (包被）-A32 (標記），A32 (包被）-A24 (標記）兩種配對均有較好的檢測效 果。
[0119] 實施例5.抗體A24及A32在酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒中的應(yīng)用
[0120] 本檢測方法采用雙抗體夾屯、法的原理。
[0121] 1.材料：
[0122] 包被緩沖液：0. 02M PH7. 4的PB緩沖液；封閉液：含2% BSA(質(zhì)量體積比，下同） 的PBST緩沖液；洗涂液：PBST緩沖液；樣本稀釋液：含1% BSA、0. 5%酪蛋白、5%山羊血 清、0. 02% Procline 300及0. 05% Tween-20的憐酸鹽緩沖液（PH7. 4);標準品：C冊系統(tǒng) 表達重組hKl (Img/mL，制備方法見專利201310746269. X);顯色液：TMB (購買于湖州英創(chuàng)公 司）；終止液：2M H2SO4。 陽123] 2.儀器：
[0124] 酶標儀（購買于化ermo公司），通用型微生物培養(yǎng)箱（購買于化ermo公司），全 自動洗板機（購買于深圳匯松公司） 陽125] 3.方法： 陽1%] (1)檢測板的制備：包被緩沖液將抗體A24稀釋至8ug/mL，IOOuL/孔加入至酶標 板中，4°C放置過夜（16小時）；PBST洗涂一次后拍干；200uL/孔封閉液封閉，37°C放置2小 時后拍干，抽干過夜（16小時），侶錐袋真空包裝，4°C保存?zhèn)溆茫?陽127] (2)樣本稀釋液的制備：含1% BSA、0. 5%酪蛋白、5%山羊血清、0. 02% Procline 300及0. 05% Tween-20的憐酸鹽緩沖液（20mM，PH7. 4)，按照上述成分比例配置樣本稀釋 液，于4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0128] (3)標準品的制備：將IOuL標準品加入至19. 99血樣本稀釋液中，充分混勻后于 4 °C保存?zhèn)溆茫?br>[0129] (4)檢測液的制備：將辣根過氧化物酶（HR巧偶聯(lián)至抗體A32 (A32-HRP，Img/ml); 將加 L A32-HRP加入至9. 995mL的樣本稀釋液中，充分混勻后于4°C保存?zhèn)溆?
[0130] 4.人激膚釋放酶1酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的使用方法 陽131] (1)于4°C取出真空包裝的檢測酶標板及相關(guān)試劑于室溫平衡后備用；
[0132] (2)標準品的稀釋：將IOuL標準品加入至490uL樣本稀釋液中，充分混勻后即得 IOng/血標準品溶液；將IOng/血標準品溶液倍比稀釋，分別獲得終濃度（ng/mL)為5、2. 5、 1. 25、0. 625、0. 3125、0. 15625及0. 078125的標準品溶液；W樣本稀釋液為陰性對照，即 On邑/mL ; 陽133] (3)酶標板中分別加入50uL/孔的樣本稀釋液；再向酶標板中加入標準品、陰性對 照W及待檢樣本巧Oul/孔）；37°C放置60分鐘；PBST洗涂5次后拍干； 陽134] (4)檢測孔中加入檢測液，IOOuL/孔，37°C放置30分鐘；PBST洗涂5次后拍干； 陽13引 妨檢測孔中加入顯色液，IOOuL/孔，37°C放置15分鐘；
[0136] (6)檢測孔中加入終止液，50uL/孔，立即于酶標儀讀取0D450。
[0137] 按照標準品各濃度對應(yīng)的0D450讀值，采用化rveExpert 1. 3軟件W濃度為橫坐 標，OD值為縱坐標進行標準曲線的繪制，獲得標準曲線方程；將檢測樣本的OD值代入標準 曲線方程后計算出待檢樣本的濃度（ng/mL)。 陽13引 5.檢測性能評價：
[0139] 根據(jù)上述檢測條件進行本發(fā)明所述檢測方法的性能評價。
[0140] (1)添加回收率： 陽141] 回收率是驗證檢測準確性的指標，遂本發(fā)明對基于A24及A32的檢測試劑盒進行 添加回收率的驗證。
[0142] 將20份血漿混合后獲得混合血漿，采用本發(fā)明的方法測量混合血漿B中的MQ含 量為Co;將濃度分別為5ng/mL、2. 5ng/mL、1. 25ng/mL W及0. 625ng/mL的標準品（A液）加 入到混合血漿B中，所加入A液與血漿B之間的體積比為1:9,根據(jù)公式（1)計算出各個添 加量的回收率。 陽 14引
-......................................................(!) 陽144] 式中：R為回收率； 陽145] V為加入A液的體積； 陽146] V。為混合血漿樣本B的體積； 陽147] C為混合血漿樣本B加入A液后的檢測濃度； 陽148] C。為血漿樣本B的檢測濃度； 陽149] Cs為A液的濃度。
[0150] 本發(fā)明檢測標準曲線（附圖7)可見，該檢測具有良好的線性關(guān)系（r = 0. 99)且 具有高靈敏度（156pg/mL)及陰性本底值（OD = 0. 0525)。根據(jù)上述添加回收率計算方法， 計算結(jié)果見下表：
[0151]
陽152] 表中可見，上述四個濃度添加回收率平均值為101. 17%，各濃度添加回收率與回 收率均值相差小于等于8. 29%，證明本檢測方法準確性高。 陽153] 似特異性：
[0154] 經(jīng)蛋白序列比對可見，人組織激膚釋放酶1與人組織激膚釋放酶家族中的人組織 激膚釋放酶2化LK2)及人組織激膚釋放酶3化LK3)的同源性分別達到66%及60%，遂本實 驗主要考察本發(fā)明所建立的檢測方法對KLK2及KLK3的檢測特異性。檢測方法如上所述， 分別加入樣本稀釋液梯度稀釋后的尤瑞克林扣K)，KLK2 (購買于R&D公司）及KLK3 (購買 于R&D公司），最終檢測該檢測方法的特異性。檢測結(jié)果（附圖8)可見，本發(fā)明所述的人組 織激膚釋放酶1酶聯(lián)免疫定量檢測法特異性好。
[0155] 做重復性
[0156] 將S份具有代表性的血漿樣本分別重復檢測10次，計算10次測量結(jié)果的平均值 M和標準差SD，根據(jù)公式CV = SD/MX100%得出變異系數(shù)CV，結(jié)果如下： 陽 157]
陽15引上述結(jié)果可見，S份血漿檢測CV<10%，本發(fā)明ELISA檢測試劑盒具有較好的重復 性。
[0159] 6.本發(fā)明嘗試多種試劑盒制備方法，下表展示幾種不同制備方式（表中未列出的 步驟、參數(shù)等同本實施例所述）及相應(yīng)試劑盒的檢測性能。
[0160]
陽161] 實施例6.抗人組織激膚釋放酶I的膠體金免疫檢測卡的制備
[0162] 1.膠體金的標記
[0163] 抗體A32的膠體金標記：用K2CO3調(diào)節(jié)膠體金抑值（每1ml膠體金中加入加 L 0. 2M K2CO3)，向膠體金溶液中緩慢加入W 0. 2M的PBS稀釋的抗體A32 (每1ml膠體金中加 入30ug抗體A32)，低速攬拌30分鐘；加入封閉液（1% BSA)至其終濃度為10% (質(zhì)量百 分比），攬拌20分鐘；靜置30min后1200化pm離屯、30min ;去上清用金標抗體復溶液0.0 lM PB PH7. 4+1% BSA+0. 025% Tween 20巧％薦糖）復溶即得膠體金標記的A32抗體。
[0164] 2.金標墊及反應(yīng)膜制備
[01化]將A32金標抗體稀釋好后，噴涂在金標墊6上，干燥備用；將抗體A24和抗化S標 簽抗體分別用包被抗體稀釋液（3%甲醇巧5mM PBS緩沖液（pH7. 5))稀釋好后，分別包被在 反應(yīng)膜2 (硝酸纖維素膜）的T線5, C線4位置，干燥后備用。
[0166] 3.貼膜、切膜、組裝 陽167] 將樣品墊1、金標墊6、包被有抗體的硝酸纖維素膜2、吸水墊3從左至右依次設(shè)置 (如圖9所示），且兩兩之間應(yīng)少許接觸，所述包被有抗體的硝酸纖維素膜的T線5在左、C 線4在右，并根據(jù)外殼大小進行切割，裝入外殼，完成檢測卡制備。 陽1側(cè) 4.試劑盒組裝 陽169] 將組裝好的檢測卡，干燥劑，滴管裝入侶錐袋中，熱封機封口，貼標簽。
[0170] 5.抗人組織激膚釋放酶1的膠體金免疫檢測卡的使用方法 陽17U 1)樣本稀釋液（IOmM PH7. 4的PB緩沖液）恢復至室溫，震蕩混勻備用； 陽172] 2)檢測樣本稀釋：在潔凈的離屯、管加入1血樣本稀釋液，再精確吸取IOii L血清/ 血漿樣本，加入到離屯、管中，振蕩充分混勻。 陽173] 3)加樣及判讀：用移液槍吸取50 iiL稀釋后的樣本慢慢加入加樣孔中，開始計時， 10~15分鐘內(nèi)將檢測卡放置在讀數(shù)儀上進行檢測，儀器將對檢測卡進行掃描，并將結(jié)果顯 示在讀數(shù)儀的屏幕上。超過15min鐘判定，結(jié)果無效。
[0174] 6.抗人組織激膚釋放酶1的膠體金免疫檢測卡檢測效果評估 陽175] 1)線性范圍檢測 陽176] 測定不同濃度的標準品（0. 125,0. 25,0. 5,1，2,4,8,16ng/ml)，繪制標準曲線，線 性檢測范圍，結(jié)果如附圖10所示。檢測卡靈敏度為0. 125ng/ml。 陽177] 2)重復性檢測
[0178] 同一批次檢測卡對lng/ml、4ng/ml樣本進行重復檢測10次，計算變異系數(shù)CV， 陽179] CV =標準差SD/平均數(shù)MX 100% 陽 180]
陽181] 3)準確度檢測（添加回收率） 陽182] 用于評估該檢測試劑盒準確測定加入純分析物的能力。將混合血清分為體積相同 的3份，在其中2份中加入標準品，制成5ng/ml，1. 25ng/ml濃度的回收樣本，在另一份樣本 中加入同樣量的無被測物的PH7. 4的PB緩沖液，制成基礎(chǔ)樣本。 陽 183]
[0184] 7.除上述最優(yōu)制備方式外，本發(fā)明還嘗試了多種制備方案，例如下表的4種制備 例： 陽化5]
陽187] 實施例7.人組織激膚釋放酶1的時間分辨巧光免疫檢測卡的制備
[0188] 本檢測方法采用雙抗體夾屯、免疫層析法的原理。
[0189] 1、溶液配制 陽 19〇] 0. 05mol/L P冊.0 的棚酸緩沖液制備：取 0.1mol/L 的 HsBCyOml，用 0. 025mol/L 的 胞284〇7 ? 10&0調(diào)節(jié)抑至8.0,并定容至100ml，置于4。(：備用，有效期3個月。 陽1W] 1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽巧DC，購自SIGMA公司）溶液制備： 1. 5姐DC加入100mL去離子水，配成水溶液置于4°C備用，有效期3個月。 陽192] 封閉液的制備：含10% BSA(所述百分比均為質(zhì)量體積比），0. 05mol/L P冊.0的 棚酸緩沖液，用0. 22um濾膜過濾，置于4°C備用，有效期7天。 陽193] 巧光抗體稀釋液制備：含l%BSA，10%薦糖，0.025%吐溫-20,0.05mol/Lp冊.0 的棚酸緩沖液，用0. 22um膜過濾，置于4°C備用，有效期7天。
[0194] 包被抗體稀釋液制備：含1%薦糖，3%甲醇0. 025mol/L pH7. 5的PBS，用0. 22U膜 過濾，置于4°C備用，有效期7天。 陽1巧]樣本稀釋液：含0. 1 % BSA，0. 025 %吐溫-20,0.0 l %安替比林，0. 02 % proclin300,0. 05mol/L P冊.0的棚酸緩沖液，10-30°C保存有效期1年。 陽196] 2、人組織激膚釋放酶1巧光檢測卡制備 陽197] 1)時間分辨巧光微球標記
[0198] A32抗體標記方法如下（W 500uL反應(yīng)體系為例）：加400uL棚酸緩沖溶液于2ml 離屯、管中，加入IOOuL濃度1 %粒徑200皿的空載巧光微球（購自Thermo公司），縱滿振蕩 混勻。再加入IOuLEDC溶液，室溫振蕩15min。14000巧m 10°C離屯、lOmin，去上清，沉淀用 0. 5ml棚酸緩沖液溶解，超聲分散，功率100W，時間Imin (超聲3s間隔3s)。 陽199] 活化后的微球中加入濃度Img/ml的A32抗體50uL，250r/min20°C恒溫震蕩反應(yīng) 2h;加入55uL封閉液，恒溫震蕩反應(yīng)地。14000巧m 10°C離屯、15min，洗涂2次，去上清，沉 淀用0. 5ml棚酸緩沖液溶解，最后一次離屯、后沉淀用巧光抗體稀釋液溶解并超聲分散，置 于4°C恒溫保存。 陽200] 2)巧光結(jié)合墊的噴點 陽201] A32抗體巧光結(jié)合墊噴點方法如下：用巧光抗體稀釋液將上述制備的A32巧光抗 體稀釋20倍，噴點于整條結(jié)合墊上。 陽202] 3)硝酸纖維素膜的包被 陽203] 硝酸纖維素膜包被方法如下：取0. 5ml濃度4mg/ml的A24抗體，加到5ml刻度離 屯、管中，加包被抗體稀釋液至1ml，包被于硝酸纖維素膜2的T線5位置。取0. 5ml濃度為 4mg/ml抗HIS抗體，加到離屯、管中，加包被抗體稀釋液至1ml，包被于硝酸纖維素膜2的C 線4位置。
[0204] 4)貼膜、切條、裝卡 陽205] 樣品墊1、巧光結(jié)合墊6、包被有A24抗體的硝酸纖維素膜（反應(yīng)膜）2、將吸水墊3 從左至右依次設(shè)置，且兩兩之間少許接觸，所述硝酸纖維素膜的T線5在左、C線4在右（如 附圖9所示），并根據(jù)卡殼大小進行切割，裝入卡殼，完成檢測卡制備。
[0206] W試劑盒組裝 陽207] 取侶錐袋和干燥劑；打開熱封機，預熱；將檢測卡、干燥劑裝入侶錐袋中；用熱封 機封好侶錐袋；貼上標簽。 陽20引同時，
【申請人】也采用A24抗體做巧光標記、采用A32抗體包被在硝酸纖維素膜（反 應(yīng)膜）2T線處，其余步驟、參數(shù)不變，進行巧光檢測卡制備。 陽209] 3、人組織激膚釋放酶1巧光檢測卡的使用方法
[0210] 1)稀釋待測樣本：在潔凈的離屯、管加入1血樣本稀釋液，再精確吸取IOy L血清/ 血漿樣本，加入到離屯、管中，振蕩充分混勻。 陽211] 2)加樣及判讀：用移液槍吸取50 iiL稀釋后的樣本慢慢加入加樣孔中，開始計時， 10~15分鐘內(nèi)用巧光免疫層析儀定量判定結(jié)果。超過15分鐘判定，結(jié)果無效。
[0212] 4、人組織激膚釋放酶1巧光檢測卡檢測效果評估 陽21引 1)精密性：將A32 (包被）-A24 (標記）檢測卡檢測0. 25、l、4ng/ml的標準品各25 次重復測定，剔除離群值后計算檢測卡精密度。實驗結(jié)果顯示S個濃度檢測結(jié)果變異系數(shù) CV<15%。
陽214] 陽215] 將八24(包| :表， 陽216] 陽217] 2)檢測線性：將A32 (包被）-A24 (標記）檢測卡檢測不同濃度的標準品：0. 0625、 0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、3211邑/1111，標準曲線及線性關(guān)系（如附圖11)。檢測卡檢測靈 敏度為 〇.〇625ng/ml。
[0218] A24(包被）-A32(標記）檢測卡靈敏度為0. 0625ng/ml。
[0219] 3)準確度一回收率：將A32(包被）-A24(標記）檢測卡檢測添加量分別為1、5、 20ng/ml的標準品，檢測結(jié)果如下表。
陽220] 陽221] 將A24(包被 ：表， 陽。2] 陽223] 5、準確度方法學比對： 陽224] 上述結(jié)果顯示A32 (包被）-A24 (標記）的檢測卡性能較優(yōu)，因此將其作方法學比 對驗證。選擇20份臨床病人標本，按1到20的順序編號，用ELISA(實施例5制備）和巧 光檢測法同時進行實驗，按照1，2, 3...... 18,19, 20, 20,19,18...... 3, 2,1的樣本順序進 行測定。ELISA和巧光檢測法檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)r2= 0. 98,說明巧光檢測法與化ISA檢 測結(jié)果有較好的相關(guān)性（如附圖12)。 陽225] 6、配方的對比： 陽226] 除上述最優(yōu)制備例1夕F，
【申請人】還嘗試多種制備方案，例如下面5組檢測卡制備及 應(yīng)用結(jié)果如下表： 陽227]
[0228] 在此說明書中，本發(fā)明已參照其特定的實施例作了描述。但是，很顯然仍可W作出 各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，說明書和附圖應(yīng)被認為是說明性的 而非限制性的。
【主權(quán)項】
1. 人組織激肽釋放酶1的膠體金免疫層析定量檢測卡，包括樣品吸收墊、金標墊、反應(yīng) 膜和吸水墊；所述金標墊噴涂有膠體金顆粒標記的抗體A32或A24,所述反應(yīng)膜上有檢測帶 和質(zhì)控帶，檢測帶位置包被有抗體A24或A32 ; 所述抗體A24是抗人組織激肽釋放酶1抗體，包括： 重鏈可變區(qū)，其氨基酸序列含有以下的互補決定區(qū)：如序列SEQ ID N0:1所示的 HCDR1、如序列SEQ ID NO :2所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO :3所示的HCDR3 ; 以及其輕鏈可變區(qū)，其氨基酸序列含有以下的互補決定區(qū)：如序列SEQ ID NO :4所示 的LCDR1、如序列SEQ ID NO :5所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID NO :6所示的LCDR3 ; 所述抗體A32是抗人組織激肽釋放酶1抗體，包括： 重鏈可變區(qū)，其氨基酸序列含有以下的互補決定區(qū)：如序列SEQ ID N0:9所示的 HCDR1、如序列SEQ ID NO :10所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO :11所示的HCDR3 ; 以及其輕鏈可變區(qū)，其氨基酸序列含有以下的互補決定區(qū)：如序列SEQ ID NO :12所示 的LCDR1、如序列SEQ ID NO :13所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID NO :14所示的LCDR3。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人組織激肽釋放酶1的膠體金免疫層析定量檢測卡，其特征 在于所述抗體A24重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序 列如SEQ ID NO:8所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人組織激肽釋放酶1的膠體金免疫層析定量檢測卡，其特 征是所述抗體A24為單鏈抗體，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 17所示。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗人組織激肽釋放酶1的膠體金免疫層析定量檢測卡，其特 征是所述抗體A24中不含由六個組氨酸構(gòu)成的HIS標簽。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人組織激肽釋放酶1的膠體金免疫層析定量檢測卡，其特 征是所述抗體A32重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序 列如SEQ ID NO: 16所示。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人組織激肽釋放酶1的膠體金免疫層析定量檢測卡，其特 征是所述抗體A32為單鏈抗體，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 18所示。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗人組織激肽釋放酶1的膠體金免疫層析定量檢測卡，其特 征是所述抗體A32中不含由六個組氨酸構(gòu)成的HIS標簽。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗人組織激肽釋放酶1的膠體金免疫層析定量檢測卡，其特 征是膠體金顆粒標記的抗體的標記方法是：調(diào)節(jié)膠體金pH值，向膠體金溶液中加入以0. 2M 的PBS稀釋的抗體，低速攪拌30分鐘；加入封閉液BSA至其終濃度為10%，攪拌20分鐘；靜 置30min后12000rpm離心30min ;去上清用金標抗體復溶液復溶即得膠體金標記的抗體， 所述復溶液含？取.40.01]?的？8緩沖液、1%834、0.025%1￥661120和5%蔗糖。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗人組織激肽釋放酶1的膠體金免疫層析定量檢測卡，其特 征是所述定量檢測卡帶有樣本稀釋液，所述樣本稀釋液是10mM PH7. 4的PB緩沖液。
【文檔編號】C07K16/40GK105988004SQ201510050984
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年1月30日
【發(fā)明人】馬永, 丁娜, 周恩昆, 張彥玉, 時振華, 徐春林, 陳飛, 陳一飛
【申請人】江蘇眾紅生物工程創(chuàng)藥研究院有限公司, 常州京森生物醫(yī)藥研究所有限公司