一種基于上轉(zhuǎn)換熒光納米粒子快速檢測農(nóng)藥殘留的免疫層析試紙及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于上轉(zhuǎn)換熒光納米粒子快速檢測農(nóng)藥殘留的免疫層析試紙及其制備方法，屬于化學(xué)鑒定技術(shù)領(lǐng)域領(lǐng)域。本發(fā)明的農(nóng)藥試紙包含試紙板、樣品滴加單元、檢測單元以及樣品回收單元；樣品滴加單元、檢測單元以及樣品回收單元均連接于所述試紙板上；所述檢測單元位于所述試紙板的中間；所述檢測單元包含抗原包被液以及封閉液。本發(fā)明的有益效果為：試紙具有“快速、簡便、特異、敏感、低成本”的特點(diǎn)，特別是其“快速、簡便”的特點(diǎn)，特別適合于廣大基層單位、野外作業(yè)人員以及大批量時(shí)間緊的檢測和大面積普查等，顯示巨大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景，被認(rèn)為是食品安全檢測最有前途的新技術(shù)之一，已成為食品安全檢測的主要發(fā)展趨勢。
【專利說明】
一種基于上轉(zhuǎn)換熒光納米粒子快速檢測農(nóng)藥殘留的免疫層析 試紙及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及化學(xué)鑒定技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種基于上轉(zhuǎn)換熒光納米粒子快速檢測農(nóng) 藥殘留的免疫層析試紙及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在20世紀(jì)80年代初，在西方發(fā)達(dá)國家興起了一種快速檢測的技術(shù)，其原理是通過 膠體金結(jié)合墊、納米材料結(jié)合墊、量子點(diǎn)結(jié)合墊、熒光素結(jié)合墊等的毛細(xì)管作用，用與結(jié)合 墊相對(duì)應(yīng)的材料進(jìn)行標(biāo)記，經(jīng)過硝酸纖維素膜作用，抗體和抗原在此特異性結(jié)合，將此技術(shù) 稱為免疫層析試紙檢測技術(shù)。用于標(biāo)記的這些物質(zhì)都具有肉眼可見或在紫外光激發(fā)下看出 抗體與抗原特異性結(jié)合的顏色或熒光顯現(xiàn)。免疫層析試紙條因其快速、簡便及操作簡單等 特點(diǎn)，其使用領(lǐng)域也越來越廣，且得到了很好的發(fā)展。用于試紙條標(biāo)記的材料也越來越多。
[0003] 免疫層析試紙主要組成部分為樣品墊、標(biāo)記物結(jié)合墊、硝酸纖維素 (Nitrocellulose，NC)膜、T線（檢測線）、C線（質(zhì)控線）、吸水墊、聚氯乙稀 (Polyvinlchloride，PVC)底板。如膠體金試紙，由于膠體金的特點(diǎn)，試紙制備原理分為競爭 法和夾心法。競爭法：當(dāng)聯(lián)有待測抗原的樣品滴加到樣品墊上時(shí)，通過毛細(xì)管作用，樣品向 前移動(dòng)，到膠體金結(jié)合墊上時(shí)，樣品中的抗原會(huì)與抗體特異性結(jié)合。到達(dá)T線時(shí)，T線上的抗 體會(huì)與樣品中剩余的抗體特異性結(jié)合，變紅。樣品再繼續(xù)移動(dòng)，到達(dá)C線時(shí)，再次與C線上的 抗體反應(yīng)，變紅。當(dāng)試紙條上出現(xiàn)兩條紅線時(shí)，說明樣品中的抗原含量低于檢測線，呈陰性。 反之，當(dāng)樣品中的抗原含量高于檢測限時(shí)，在膠體金結(jié)合墊上抗原大部分與抗體特異性結(jié) 合，T線未出現(xiàn)紅色，而C線出線紅色，則為陽性。無論樣品中的待測抗原高于還是低于檢測 線，C線都應(yīng)出現(xiàn)，否則試紙條無效。與之實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反，出現(xiàn)兩條紅線為陽性，一條紅線為 陰性的方法為夾心法。
[0004] 農(nóng)藥殘留問題是隨著農(nóng)藥大量生產(chǎn)和廣泛使用而產(chǎn)生的。到目前為止，世界上化 學(xué)農(nóng)藥年產(chǎn)量近200萬噸，約有1000多種人工合成化合物被用作殺蟲劑、殺菌劑、殺藻劑、除 蟲劑、落葉劑等類農(nóng)藥。農(nóng)藥尤其是有機(jī)農(nóng)藥大量施用，造成嚴(yán)重的農(nóng)藥污染問題，成為對(duì) 人體健康的嚴(yán)重威脅。
[0005] 免疫試紙技術(shù)在醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)診斷，農(nóng)業(yè)，生物福利，食品安全，環(huán)境安全，工業(yè)檢測， 甚至新出現(xiàn)的分子診斷及納米治療領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用，具有非常廣泛的應(yīng)用前景。在食 品安全檢測領(lǐng)域里，主要涉及到獸藥、農(nóng)藥殘留，違禁添加物、生物毒素、重金屬、環(huán)境毒素 等，基本上大多數(shù)的食品安全檢測涉及的都可以應(yīng)用到。技術(shù)上來說，免疫試紙檢測技術(shù)具 有"快速、簡便、特異、敏感、低成本"的特點(diǎn)，特別是其"快速、簡便"的特點(diǎn)，適用于現(xiàn)場巨量 樣品檢測，有著巨大的應(yīng)用前景，被認(rèn)為是食品安全檢測最有前途的新技術(shù)之一，已成為食 品安全檢測的主要發(fā)展趨勢。
[0006] 目前農(nóng)藥殘留分析主要采用儀器分析和免疫分析方法。我們國家用的最多的，按 照試驗(yàn)數(shù)來算的話，就是試紙。其他的技術(shù)當(dāng)然都在用，但是試驗(yàn)的絕對(duì)數(shù)都沒有試紙多， 氣-質(zhì)色譜、液-質(zhì)色譜難以應(yīng)付巨量的樣品。其中儀器分析法具有靈敏度、準(zhǔn)確度高和精密 度好等優(yōu)點(diǎn)，但存在樣品前處理繁瑣、試劑用量大、費(fèi)時(shí)、分析成本高，需昂貴的儀器設(shè)備等 缺點(diǎn)，不適合現(xiàn)場快速檢測。納米生物技術(shù)是納米技術(shù)與生物技術(shù)交叉滲透形成的新技術(shù)， 利用納米生物技術(shù)對(duì)細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)分析和檢測、疾病早期診斷、生物分子的示蹤標(biāo)記等研 究一直是國內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。為了能實(shí)現(xiàn)食品及環(huán)境中農(nóng)藥殘留的快速檢測，科 學(xué)工作者開始關(guān)注上轉(zhuǎn)換(將長波長光轉(zhuǎn)換為短波長光發(fā)射的過程)納米熒光材料。上轉(zhuǎn)換 納米熒光材料是一類用980nm紅外光做激發(fā)光源的材料，用此激發(fā)光做激發(fā)源的材料光穿 透度較深，在生物組織內(nèi)不會(huì)發(fā)光，故不產(chǎn)生背景熒光，對(duì)生物組織的損傷幾乎為零。合成 該類材料的物質(zhì)毒性較小，且具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，發(fā)光強(qiáng)度較好，它的吸收和發(fā)射帶 窄，從而降低檢測背景，提高信噪比，這些特征導(dǎo)致上轉(zhuǎn)換納米熒光材料擁有非常好的生物 應(yīng)用前景。建立起基于上轉(zhuǎn)換納米材料快檢農(nóng)藥多（單)殘留的方法無疑是非常重要的，到 目前為止，上轉(zhuǎn)換納米熒光材料已在細(xì)胞標(biāo)記、生物大分子檢測、小動(dòng)物成像、光動(dòng)力學(xué)療 法及藥物輸送等方面得到了應(yīng)用。但將上轉(zhuǎn)換納米熒光材料用作標(biāo)記物，與免疫層析技術(shù) 相結(jié)合進(jìn)行小分子農(nóng)藥殘留的分析還未見報(bào)道。利用上轉(zhuǎn)換納米材料快速檢測農(nóng)藥多(單） 殘留的分析方法，對(duì)發(fā)展快檢農(nóng)藥多殘留檢測技術(shù)具有重要的理論研究和實(shí)際應(yīng)用意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，制作出納米級(jí)上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料。本發(fā)明 提供快速檢測農(nóng)藥殘留的免疫層析試紙，所述試紙包含:試紙板、樣品滴加單元、檢測單元 以及樣品回收單元;樣品滴加單元、檢測單元以及樣品回收單元依次相連且均連接于所述 試紙板上;所述樣品滴加單元與樣品回收單元位于所述試紙板的兩端，所述檢測單元位于 所述試紙板的中間;所述檢測單元包含納米粒子標(biāo)記結(jié)合墊、檢測線和質(zhì)控線;所述檢測線 位于所述納米粒子標(biāo)記結(jié)合墊和所述質(zhì)控線之間；所述納米粒子標(biāo)記結(jié)合墊包含抗原包被 液以及上轉(zhuǎn)換焚光納米粒子標(biāo)記抗體試樣;所述上轉(zhuǎn)換焚光納米粒子標(biāo)記抗體試樣為β-NaYF4: Yb3+/Er3+標(biāo)記 2，4-D-IgG 的 PBS 溶液。
[0008] 優(yōu)選地，所述檢測線以及質(zhì)控線均位于層析膜上，納米粒子標(biāo)記結(jié)合墊與所述層 析膜相連;所述層析膜為NC硝酸纖維素膜。
[0009] 優(yōu)選地，所述納米粒子標(biāo)記抗體試樣中i3-NaYF4: Yb3+/Er3+標(biāo)記2，4-D-IgG的含量為 0.00666-0.132yg/mL〇
[0010] 優(yōu)選地，所述檢測線上的標(biāo)記物為2，4-D-0VA，所述質(zhì)控線的標(biāo)記物為羊抗兔二 抗。
[0011] 本發(fā)明還保護(hù)檢測農(nóng)藥殘留試紙的制備方法，包含下列步驟:S1.制備水溶性稀土 上轉(zhuǎn)換納米材料;S2.制備農(nóng)藥多克隆抗體以及檢測所述農(nóng)藥多克隆抗體的效價(jià);S3.利用 所述步驟S1制備的產(chǎn)物標(biāo)記所述農(nóng)藥多克隆抗體;S4.利用所述步驟S3產(chǎn)物制備檢測農(nóng)藥 殘留試紙。
[0012]優(yōu)選地，所述步驟S1包含：
[0013] S1.1將稀土氯化物、油酸以及十八烯置于燒瓶中攪拌抽真空30min，后停止攪拌加 執(zhí). ，
[0014] S1.2將NaOH、NH4HF2以及甲醇置于燒杯中放入攪拌子，封上封口膜，于磁力攪拌器 上常溫?cái)嚢瑁?br>[0015] S1.3將所述步驟SI. 1產(chǎn)物加熱到150°C，保溫15~20min即可，隨即關(guān)閉攪拌，關(guān)閉 加熱，使之降低至室溫；
[0016] S1.4盡量少進(jìn)空氣的情況下滴加S1.2溶液，反應(yīng)完全后通入N2,將滴加過程中進(jìn) 入的空氣排盡；
[0017] S1.5 將體系加熱至75-85。(：，保溫1.511;
[0018] S1.6在0.5h內(nèi)將所述步驟S1.5的產(chǎn)物升溫至310°C，N2保護(hù)下保溫2h，隨即在N 2保 護(hù)及攪拌下冷卻至室溫；
[0019] S1.7洗滌產(chǎn)物；
[0020] S1.8利用所述步驟S1.7產(chǎn)物制備水溶性0-NaYF4:Yb3+，Er 3+納米粒子。
[0021 ]優(yōu)選地，所述步驟S1.8包含:SI. 8.1將所述步驟S1.7的產(chǎn)物、環(huán)己烷、叔丁醇、去離 子水以及K<03溶液室溫下混合攪拌；S1.8.2將KMn〇4和NaI〇4水溶液緩慢滴入所述步驟 SI. 8.1的產(chǎn)物，40°C下反應(yīng)48h，用95 %乙醇洗滌離心得初產(chǎn)物；S1.8.3初產(chǎn)物溶于HC1中， 常溫下攪拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后離心洗滌離心得到產(chǎn)物。
[0022] 優(yōu)選地，所述步驟S3包含：S3.1分別配置pH=5以及pH = 7.4的磷酸緩沖鹽溶液； S3.2制備水溶性 0-NaYF4: Yb，Er 標(biāo)記 2，4-D-I gG。
[0023] 優(yōu)選地，所述步驟S3.2為:S3.2.1取經(jīng)KMn〇4_NaI〇4氧化溶于水的P_NaYF4: Yb，Er制 成溶液A，向所述溶液A中加入所述步驟S3.1制備的pH=5的roS緩沖液后，加入EDC與Sulfo-NHS，常溫?cái)嚢?S3.2.2向所述步驟S3.2.1的產(chǎn)物中加入2，4-D-IgG，常溫反應(yīng)2h，離心出產(chǎn) 物;將所述產(chǎn)物用PBS洗2遍后定容于所述步驟S3.1制備的pH=7.4的PBS緩沖液中。
[0024] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:上轉(zhuǎn)換納米熒光材料具有有機(jī)染料和量子點(diǎn)材料無 法比擬的優(yōu)勢，如毒性小、化學(xué)穩(wěn)定性高、發(fā)光強(qiáng)度高、光穩(wěn)定性好、吸收和發(fā)射帶窄和熒光 壽命長等;此外980nm紅外激光作激發(fā)源也有許多優(yōu)勢，例如較深的光穿透深度、對(duì)生物組 織幾乎無損傷、生物組織不會(huì)發(fā)光(無背景熒光），從而降低檢測背景，提高信噪比，這些特 征導(dǎo)致上轉(zhuǎn)換納米熒光材料擁有非常好的生物應(yīng)用前景。建立起基于上轉(zhuǎn)換納米材料快檢 農(nóng)藥多殘留的方法無疑是非常重要的，利用上轉(zhuǎn)換納米材料快速檢測農(nóng)藥多(單)殘留的分 析方法，對(duì)發(fā)展快檢農(nóng)藥多殘留檢測技術(shù)具有重要的理論研究和實(shí)際應(yīng)用意義。免疫試紙 技術(shù)在醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)診斷，農(nóng)業(yè)，生物福利，食品安全，環(huán)境安全，工業(yè)檢測，甚至新出現(xiàn)的分子 診斷及納米治療領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用，具有非常廣泛的應(yīng)用前景。在食品安全檢測領(lǐng)域里， 主要涉及到獸藥、農(nóng)藥殘留，違禁添加物、生物毒素、重金屬、環(huán)境毒素等，基本上大多數(shù)的 食品安全檢測涉及的都可以應(yīng)用到。技術(shù)上來說，免疫試紙檢測技術(shù)具有"快速、簡便、特 異、敏感、低成本"的特點(diǎn)，特別是其"快速、簡便"的特點(diǎn)，特別適合于廣大基層單位、野外作 業(yè)人員以及大批量時(shí)間緊的檢測和大面積普查等，顯示巨大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景，被認(rèn) 為是食品安全檢測最有前途的新技術(shù)之一，已成為食品安全檢測的主要發(fā)展趨勢。
【附圖說明】
[0025]圖1為合成f3_NaYF4:Yb3+，Er3+納米粒子的掃描電鏡圖；
[0026] 圖2為0-NaYF4:Yb3+，Er3+納米粒子的透射電鏡圖；
[0027] 圖3為水溶性β-NaYF4:Yb3+，Er3+上轉(zhuǎn)換納米粒子的TEM圖；
[0028] 圖4為水溶性0-NaYF4:Yb3+，Er3+上轉(zhuǎn)換納米粒子標(biāo)記2,4-D-IgG后的TEM圖；
[0029]圖5為在595nm吸收波長下，BSA的濃度與吸光度的關(guān)系曲線；
[0030]圖6為檢測農(nóng)藥單殘留的免疫層析試紙結(jié)構(gòu)圖；
[0031]圖7為不同濃度試樣篩選結(jié)果判據(jù)圖，A-E為不同濃度的標(biāo)記上轉(zhuǎn)換納米粒子的抗 體試樣；
[0032]圖8為試紙的靈敏度示意圖，A:陰性B:陽性T:檢測線C:質(zhì)控線；
[0033] 圖9確定試紙條檢測2,4-D農(nóng)殘靈敏度結(jié)果圖；
[0034] 圖10確定試紙條檢測2,4-D農(nóng)殘靈敏度結(jié)果圖；
[0035]圖11為2,4-D標(biāo)準(zhǔn)樣的液相色譜圖；
[0036]圖12為樣品梨中的2,4-D含量；
[0037]圖13為樣品蘋果中的2,4-D含量；
[0038]圖14為樣品黃瓜中的2,4-D含量；
[0039]圖15為樣品西紅柿中的2,4_D含量；
[0040] 圖16為樣品大米中的2,4-D含量；
[0041] 圖17為樣品小米中的2,4-D含量；
[0042] 圖18為試紙條驗(yàn)證結(jié)果圖，a:梨，b:蘋果，c:黃瓜，d:西紅柿，e:大米，f:小米。
[0043]附圖標(biāo)記：
[0044] 1-試紙板、2-樣品滴加單元、3-納米粒子標(biāo)記結(jié)合墊、4-檢測線、
[0045] 5-質(zhì)控線、6-樣品回收單元、7-層析膜、A-樣品流動(dòng)方向。
【具體實(shí)施方式】
[0046] 近年來因?yàn)橄⊥辽限D(zhuǎn)換納米材料的光學(xué)性質(zhì)，使其在生物領(lǐng)域的應(yīng)用有著大量可 待開發(fā)的潛能。0-NaYF4: Yb3+，Er3+(Tm3+)是目前為止發(fā)現(xiàn)的上轉(zhuǎn)換效率最高的材料，故其在 生物檢測與標(biāo)記方面獲得廣泛關(guān)注。但是，因制備得到的稀土上轉(zhuǎn)換納米材料是油溶性材 料，需利用KMn〇4/NaI〇4將油溶性納米粒子轉(zhuǎn)變成水溶性納米粒子。本文利用高溫?zé)岱纸夥?制備了油酸包覆的f3-NaYF4: Yb3+，Er3+納米粒子。
[0047] 1、稀土上轉(zhuǎn)換納米材料的制備
[0048] (1)實(shí)驗(yàn)儀器與實(shí)驗(yàn)試劑
[0049] 表1實(shí)驗(yàn)儀器一覽表
[0051 ] 表2化學(xué)試劑一覽表
[0054] (2)制備稀土氯化物
[0055] 將稀土氧化物10g倒入新燒杯中，加入5ml蒸餾水，加入濃度37%的HC1 50-60ml， 攪拌，若太濃稠則繼續(xù)加入HC1。
[0056]微溶后，置于鋪有石棉網(wǎng)的電爐上加熱至沸騰，若一直未澄清，則再加入20-30ml HC1，沸騰至剩余溶液為原來一半后仍未澄清，則繼續(xù)加入濃度為37 %的HC1，直至澄清。 [0057]澄清后的溶液沸騰蒸干至溶液開始出現(xiàn)大氣泡時(shí)，加入蒸餾水80ml，沖洗杯壁及 玻璃棒。反復(fù)重結(jié)晶四次左右最后一次蒸干后快速攪拌成結(jié)晶狀，裝管。
[0058] (3)高溫?zé)岱纸夥ㄖ苽溆腿苄詉3_NaYF4: Yb3+，Er3+上轉(zhuǎn)換熒光納米粒子
[0059]①將稀土氯化物（2mmol)[YCl3 · 6H20(78%)、YbCl3.6H20(20%)、ErCl3.6H20 (2 % ) ]、90 %油酸（12ml)、90 %十八烯（30ml)置于三口燒瓶中，放入攪拌子，抽真空，30min 后加熱。抽真空時(shí)放在熱電偶上，只攪拌不加熱。
[0060] ②將Na0H(5mmol)、NH4HF2(5mmol)、無水甲醇（10ml)置于小燒杯中，放入攪拌子，封 上封口膜，置于磁力攪拌器上常溫?cái)嚢琛?br>[0061 ]③步驟①中抽真空完畢，在15min內(nèi)將三口燒瓶中溶液加熱到150 °C，保溫15~ 20min即可，隨即關(guān)閉攪拌，關(guān)閉加熱，使之降低至室溫。
[0062]④盡量少進(jìn)空氣的情況下加入步驟2中的溶液，緩慢逐滴滴加，使之充分反應(yīng)。滴 加結(jié)束后開始通入N2，通入30min左右，將滴加過程中進(jìn)入的空氣排盡。
[0063]⑤排盡空氣后將體系加熱至80°C(15-20min左右升至80°C)，溫度變化范圍在5°C 以內(nèi)，不能低于80°C，保溫1.5h。
[0064] ⑥保溫1.5h后，在0.5h內(nèi)將溶液升溫至310°C，充分反應(yīng)，N2保護(hù)下保溫2h。隨即在 N2保護(hù)及攪拌下冷卻至室溫。
[0065] ⑦洗滌產(chǎn)物:將離心機(jī)調(diào)至9000r/min，時(shí)間設(shè)定為lOmin，用無水乙醇將產(chǎn)物洗滌 一遍;環(huán)己烷:無水乙醇以1:3比例混合將產(chǎn)物洗滌兩遍;無水乙醇將產(chǎn)物洗滌兩遍;95 %乙 醇將產(chǎn)物洗滌兩遍。將離心管放入干燥箱干燥產(chǎn)物。
[0066] (4)水溶性0_NaYF4: Yb3+，Er3+納米粒子的制備
[0067] 將上述制備好的0-似丫?4:￥133+31'3+(5〇11^)、環(huán)己燒（5〇1111)、叔丁醇（351111)、去離子 水（51111)以及5￥七％1( 20)3溶液（2.51111)室溫下混合攪拌2〇1^11。將1〇1111含2.85111111〇1疆11〇4和 0.0525mmol NaI〇4水溶液緩慢滴入。40°C下反應(yīng)48h，用95%乙醇洗滌離心（9000r/min)產(chǎn) 物得初產(chǎn)物。初產(chǎn)物溶于12.5ml pH為4-5的HC1，常溫下攪拌反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束9000r/ min離心，最后用95%乙醇洗滌離心得到產(chǎn)物。將產(chǎn)物分散于15ml去離子水中待用。
[0068] (5 )0-NaYF4: Yb3+，Er3+納米粒子的表征
[0069] a)SEM 分析
[0070]從圖1的SEM照片可看到高溫?zé)峤夥ê铣傻膇3_NaYF4: Yb3+，Er3+上轉(zhuǎn)換納米粒子，其 形貌為實(shí)心的納米球，顆粒大小均勾，粒徑為30nm左右，從SEM圖片也可觀察到產(chǎn)物物相純 凈。
[0071] b)TEM 分析
[0072]從圖2的TEM照片可看到高溫?zé)峤夥ê铣傻膇3-NaYF4:Yb3+，Er3+納米粒子，其形貌為 實(shí)心的納米球，顆粒大小均勾，粒徑為30nm左右，從TEM圖片也可觀察到產(chǎn)物物相純凈。 [0073] 從圖3可看出，氧化后的i3_NaYF4:Yb，Er納米粒子的形貌和粒徑尺寸均未發(fā)生改 變，仍為粒徑在30nm左右的球狀粒子。
[0074] 2、農(nóng)藥多克隆抗體的制備及效價(jià)
[0075] (1) 2，4-D農(nóng)藥多克隆抗體(IgG)的制備及效價(jià)
[0076]將一定量免疫抗原（2，4-D-BSA)的生理鹽水溶液與等量的弗氏完全佐劑混合，充 分乳化，免疫2只新西蘭白兔(2-2.5kg)，皮下免疫400yg/次，2-3周免疫一次，免疫4次。在每 次加強(qiáng)免疫后第10天于耳靜脈采血，離心獲得血清，以ELISA方法測定血清效價(jià)，直至效價(jià) 大于1:50,000進(jìn)行最終采血制備抗血清，使用Protein A親和純化的方法獲得高效價(jià)多克 隆抗體(IgG)。
[0077] 表3抗體間接Elisa結(jié)果
[0079] (2)水溶性0-NaYF4:Yb3+，Er3+納米粒子標(biāo)記農(nóng)藥多克隆抗體(2,4-D-IgG)
[0080] a)水溶性 0-NaYF4: Yb，Er 標(biāo)記 2，4-D-IgG
[0081 ] i ·磷酸緩沖鹽溶液(PBS)的配制(0 · 01M)
[0082] 將似<：1(0.88)、1((：1(0.0028)、似2耶04(0.1448)、1〇12?04(0.0248)用水定容至 100ml，即可得到pH=7 · 4的PBS溶液。
[0083] 配制pH=5的PBS溶液，用30 % HC1將上述溶液pH調(diào)至5 · 0即可。
[0084] i i ·水溶性0-NaYF4: Yb3+，Er3+標(biāo)記2，4-D-IgG的方法
[0085] 取經(jīng)KMn〇4_NaI〇4氧化溶于15ml水的0-他￥?4:￥133+34 +，向上述溶液中加入1511^ 卩85(卩!1=5)緩沖液后，加入0.011528(0.000384\301111#0(：與0.032578 5111化-顯5 (0 · 00108565 X 30ml)，常溫?cái)嚢?0min，活化羧基。加入50yL(C= 260mg/ml) IgG，常溫反應(yīng) 2Κ9000γρπι離心出產(chǎn)物，產(chǎn)物用PBS(pH=7.4)洗2遍后定容于15ml PBS(pH=7.4)中。
[0086] 從圖4可看出，0-似￥?4^3+也3+偶聯(lián)2,4-〇-186后，與偶聯(lián)前的氧化產(chǎn)物相比（見 圖4)，因此其形貌發(fā)生了變化，納米粒子的表面覆蓋了一層物質(zhì)，粒徑約為50nm左右。
[0087] b)考馬斯亮藍(lán)法定量分析蛋白的含量
[0088] ①配制布拉德福德試劑:取考馬斯亮藍(lán)G-250 50mg置于200ml燒杯中，加入25ml的 95%乙醇使其溶解，隨后加入60ml 85% (w/v)的磷酸，轉(zhuǎn)移至500ml容量瓶，用去離子水稀 釋至500ml。溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0089] ②配置 BSA 濃度分別為0，0 · 02，0 · 04,0 · 06，0 · 08 和0 · 10mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液各 1 · OOmL。
[0090] ③?、谥械呐渲煤玫腂SA溶液中分別放入指定試管中，根據(jù)順序分別加入5.OOmL 的布拉德福德試劑，搖晃均勻，反應(yīng)2min后，用作待測液。設(shè)定紫外分光光度計(jì)的吸收波長 在595nm，用待測液進(jìn)行吸光度測定。
[0091] 根據(jù)順序的得到的測定結(jié)果如下:0，0.164，0.349，0.508，0.648，0.813。由濃度及 吸光度作圖可知二者有如下的線性關(guān)系。見圖5,回歸方程為：Y = 8.108X+0.0089(R2 = 0.998)
[0092] X為BSA濃度，Y為吸光度。經(jīng)測定，樣品0-似￥?4:￥133+此3+標(biāo)記2,4-〇-186的吸光度 為〇. 195，根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出i3-NaYF4: Yb，Er標(biāo)記2，4-D-IgG表面的2，4-D-IgG偶聯(lián) 率為2 · 67% (含2，4-D-IgG 23 · lyg/mL)。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步表明，2，4-D-IgG已被f3-NaYF4: Yb， Er納米粒子成功標(biāo)記。
[0093] 3、農(nóng)藥單殘留檢測免疫層析試紙的制備
[0094] 表4化學(xué)材料一覽表
[0096] 表5實(shí)驗(yàn)儀器一覽表
[0098] (1)免疫層析試紙條的組裝
[0099] 農(nóng)藥單殘留檢測免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)如圖6所示。試紙條包含試紙板1、樣品滴 加單元2、檢測單元以及樣品回收單元6。
[0100] 樣品滴加單元2、檢測單元以及樣品回收單元6依次相連且均連接于所述試紙板1 上;所述試紙板1為PVC膠板。所述樣品滴加單元2與樣品回收單元6位于所述試紙板1的兩 端，所述檢測單元位于所述試紙板1的中間。
[0101 ]所述檢測單元包含納米粒子標(biāo)記結(jié)合墊3、檢測線4和質(zhì)控線5;所述納米粒子標(biāo)記 結(jié)合墊3包含抗原包被液以及上轉(zhuǎn)換焚光納米粒子標(biāo)記抗體試樣;所述上轉(zhuǎn)換焚光納米粒 子標(biāo)記抗體試樣為0-NaYF4: Yb3+/Er3+標(biāo)記2，4-D-IgG的roS溶液。所述抗原包被液以及所述 上轉(zhuǎn)換焚光納米粒子標(biāo)記抗體試樣可由前述制備方法制得。
[0102] 檢測線4以及質(zhì)控線5均位于層析膜7上。納米粒子標(biāo)記結(jié)合墊3與層析膜7相連，層 析膜7為NC硝酸纖維素膜。
[0103] (i)利用水溶性綠色0-NaYF4: Yb3+，Er3+納米粒子標(biāo)記2，4-D-IgG檢測2，4-D免疫層 析試紙的制備方法
[0104] a)抗原包被液的選擇
[0105] 用于農(nóng)藥試紙檢測線(T線）的確定。準(zhǔn)確稱取2,4-D 250mg，加入10mL DMF(N，N-二 甲基甲酰胺）溶解，再向此溶液中依次加入50.OyL 99%三正丁胺和30yL 98%氯丁酸異丁 酯，室溫磁力攪拌過夜；再將此溶液在攪拌狀態(tài)下緩慢滴加到溶有450mg 0VA的 20mL0 · 05mol/L pH9 · 6的碳酸緩沖液中，攪拌反應(yīng)24h;此反應(yīng)液在4°C下對(duì)0 · 01mol/L pH7.4的磷酸緩沖液透析(透析6次，每次6小時(shí)、500ml透析液，透析袋用之前需用沸水煮10 分鐘，透析時(shí)需放入4°C冰箱中），透析液3500rpmn離心10min，上清液冷凍干燥，得合成抗 原。取10mg合成抗原定容于50mL容量瓶，配成0.2mg/mL包被液。
[0106] b)納米粒子標(biāo)記抗體濃度的選擇：
[0107] 備用試紙條的確定。配制不同濃度的標(biāo)記上轉(zhuǎn)換納米粒子的抗體試樣，在980nm光 的激發(fā)下，觀察所劃線的發(fā)光強(qiáng)度選擇最適濃度。
[0108] A: 200yL含 0 · O33Oμg/ml0-NaYF4: Yb3+/Er3+標(biāo)記 2，4-D-IgG 的 PBS 溶液；
[0109] B: 200yL含0 · 1665μg/ml0-NaYF4: Yb3+/Er3+標(biāo)記 2，4-D-IgG 的 PBS 溶液；
[0110] C: 200yL含 0 · 333Oμg/ml0-NaYF4: Yb3+/Er3+標(biāo)記 2，4-D-IgG 的 PBS 溶液；
[0111] D: 200yL含 0 · 4995μg/ml0-NaYF4: Yb3+/Er3+標(biāo)記 2，4-D-IgG 的 PBS 溶液；
[0112] E: 200yL含 0 · 66OOμg/ml0-NaYF4: Yb3+/Er3+標(biāo)記 2，4-D-IgG 的 PBS 溶液。
[0113] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7以及表6所示：
[0114]表6 代表熒光強(qiáng)度）
[0116]如圖7所示，在980nm波長光照射NC膜進(jìn)行結(jié)果判定。由包被液篩選結(jié)果(表6和圖 7)可知，不同濃度的標(biāo)記上轉(zhuǎn)換納米粒子的抗體試樣C: 200yL含0.3330μg/mlf3-NaYF4: Yb3+/ Er3+標(biāo)記IgG的PBS溶液，NC膜上的線熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，其他濃度納米粒子標(biāo)記抗體試樣的試紙 條熒光強(qiáng)度就弱。由上述結(jié)構(gòu)可知，當(dāng)不同濃度的標(biāo)記上轉(zhuǎn)換納米粒子的抗體試樣中含有 C: 200yL含 Ο · 333Oμg/ml0-NaYF4: Yb3+/Er3+標(biāo)記 2，4-D-IgG 的 PBS 溶液時(shí)效果最佳，檢測線（T 線)為2,4-D包被抗原，質(zhì)控線(C線）為羊抗兔二抗，將該試樣滴加在樣品墊上，干燥后可作 為檢測2，4-D含量的備用試紙條。
[0117] (2)水溶性綠色0-NaYF4: Yb3+，Er3+納米粒子標(biāo)記2，4-D-IgG檢測2，4-D免疫層析試 紙的靈敏度確定
[0118] 由（1)中制得的備用試紙條進(jìn)行下一步操作。用免疫層析試紙技術(shù)檢測時(shí)有競爭 法和夾心法兩種方法，因2,4_D屬于小分子化合物，即用競爭法來檢測。由試紙條原理可知， T線上的標(biāo)記物為2,4-D-0VA，C線的標(biāo)記物為羊抗兔二抗，制備得到的含有2,4-D抗原的樣 品滴加到試紙條的樣品墊上，樣品會(huì)隨著試紙條的納米粒子結(jié)合墊、NC膜向前移動(dòng)，如果樣 品中含有的2,4-D低于試紙條的檢測限，在到達(dá)T線時(shí)，會(huì)與線上的2,4-D-0VA反應(yīng)，反應(yīng)后 的T線在980nm光的激發(fā)下可看到一條綠色熒光線。然后樣品繼續(xù)向前移動(dòng)，到達(dá)C線時(shí)，與C 線的標(biāo)記物羊抗兔二抗反應(yīng)，反應(yīng)后的C線在980nm光的激發(fā)下也可看到一條綠色熒光線。 若同時(shí)出現(xiàn)兩條綠色熒光線，則說明樣品呈陰性(如圖8-A)。相反，如果樣品中的2,4-D高于 檢測限濃度時(shí)，樣品到達(dá)納米粒子結(jié)合墊時(shí)大部分會(huì)與抗原先反應(yīng)，剩余的少量部分繼續(xù) 向前移動(dòng)，此時(shí)的抗原較少，不夠與T線上的2,4-D-0VA發(fā)生反應(yīng)，所以在980nm光的激發(fā)下， 不能看見綠色熒光。然后樣品繼續(xù)向前移動(dòng)，到達(dá)C線時(shí)，與C線的標(biāo)記物羊抗兔二抗反應(yīng)， 反應(yīng)后的C線在980nm光的激發(fā)下也可看到一條綠色熒光線。當(dāng)只有一條綠色熒光線時(shí)（如 圖8-B )，樣品呈陽性。若兩條線都不出現(xiàn)，說明試紙條失敗。
[0119] (3)2,4_D農(nóng)藥殘留檢測限的確認(rèn)
[0120] 表7靈敏度的測定(500~lng)
[0122] (備注："+"、分別表示陽性和陰性）
[0123] 表8靈敏度的測定（10~lng)
[0125] (備注："+"、分別表示陽性和陰性）
[0126] 由表7、8和圖9、10可知，試紙條檢測含量在10ng/mL以上的2,4-D標(biāo)準(zhǔn)液時(shí)，結(jié)果都 為陽性。對(duì)此濃度進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在檢測濃度為5ng/mL的2,4-D時(shí)，可觀測到樣本試紙條T 線。因此，試紙條的檢測靈敏度確定為5ng/mL。
[0127] 由上述實(shí)驗(yàn)可得，因?yàn)榇_定了 2,4-D包被OVA的濃度，將檢測線定在5ng/mL。當(dāng)在適 當(dāng)范圍內(nèi)調(diào)節(jié)2,4-D包被0VA的濃度可調(diào)節(jié)試紙條的靈敏度。檢測線可變。
[0128] (4)免疫層析試紙條使用方法
[0129] 將適量樣品提取液滴加到NC膜上，lOmin后，用980nm波長光照射NC膜部位進(jìn)行結(jié) 果判定：
[0130]①如T線和C線出現(xiàn)相同的熒光，則為陰性，即農(nóng)藥含量低于設(shè)計(jì)檢測限量，見圖7-B〇
[0131] ②如T線不產(chǎn)生熒光，C先有熒光，則為陽性，即農(nóng)藥含量高于設(shè)計(jì)檢測限量，見圖 7_A〇
[0132] ③如T線和C先均不產(chǎn)生熒光，說明檢測失敗。
[0133] (5)基于上轉(zhuǎn)換納米粒子免疫層析試紙檢測農(nóng)殘含量與儀器分析法對(duì)比
[0134] 1)液相色譜分析水果、蔬菜及原糧中的2,4_D含量與上轉(zhuǎn)換納米粒子免疫層析試 紙檢測農(nóng)藥含量對(duì)比
[0135] 表9化學(xué)試劑一覽表
[0137] 實(shí)驗(yàn)儀器
[0138] 配備德國Nacalai Tesque公司C0SM0SIL-C18色譜柱的島津高效液相色譜儀、0.45 μπι過濾膜、20yL進(jìn)樣器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀以及粉碎機(jī)。
[0139] 2)樣品前處理
[0140]①稱取梨、蘋果、黃瓜、西紅柿及粉碎后過20目篩的大米及小米試樣各20g，分別添 加2mg的2,4-D標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
[0141] ②分別向以上六種樣品中加入5mL 30%甲醇-PBS溶液，研磨。
[0142] ③將研磨后的產(chǎn)物離心，用30%甲醇-PBS溶液洗滌2-3次，每次用量5mL。
[0143] ④減壓蒸餾濃縮提取液至2.0mL(lmg/mL)。將制備好的六種樣品分別配成250ng/ mL的溶液。
[0144] ⑤過孔徑為0·45μπι的過濾膜待測。
[0145] 4)實(shí)驗(yàn)條件
[0146] ①流動(dòng)相：甲醇-磷酸水溶液=70 % : 30 % (ΡΗ=3.0);
[0147] ②保留時(shí)間：20min;
[0148] ③流速：lmL/min;
[0149] ④檢測波長：278nm;
[0150] ⑤進(jìn)樣量:20yL。
[0151] 5)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
[0152] ①樣品中實(shí)際添加2,4-D質(zhì)量的計(jì)算：
[0154] 其中，Μ-一標(biāo)準(zhǔn)溶液中2，4-D峰面積的平均值;A2-一試樣溶液中2，4_D峰面積的 平均值;mi--標(biāo)樣中2，4-D的質(zhì)量(g);m2--試樣的質(zhì)量(g)。
[0155] 2,4_D標(biāo)準(zhǔn)樣的2,4_D含量見圖11;各個(gè)樣品a:梨，b:蘋果，c:黃瓜，d:西紅柿，e:大 米，f:小米的2,4-D含量見圖12-17以及表10。
[0156] 表10水果、蔬菜及原糧中的2,4_D測量結(jié)果
[0158] (6)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與試紙條結(jié)果對(duì)比
[0159] 采用本發(fā)明制備的試紙條驗(yàn)證結(jié)果如圖18所示(a:梨，b:蘋果，c:黃瓜，d:西紅柿， 6:大米，1；':小米)。
[0160] 由表10及圖18可知，液相色譜檢測時(shí)2,4-D加入量為5ng，試紙條可檢測出樣品呈 陰性，符合檢測結(jié)果。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 檢測農(nóng)藥殘留試紙，其特征在于所述試紙包含:試紙板、樣品滴加單元、檢測單元以 及樣品回收單元； 樣品滴加單元、檢測單元以及樣品回收單元依次相連且均連接于所述試紙板上； 所述樣品滴加單元與樣品回收單元位于所述試紙板的兩端，所述檢測單元位于所述試 紙板的中間； 所述檢測單元包含納米粒子標(biāo)記結(jié)合墊、檢測線和質(zhì)控線;所述檢測線位于所述納米 粒子標(biāo)記結(jié)合墊和所述質(zhì)控線之間;所述納米粒子標(biāo)記結(jié)合墊包含抗原包被液以及上轉(zhuǎn)換 焚光納米粒子標(biāo)記抗體試樣;所述上轉(zhuǎn)換焚光納米粒子標(biāo)記抗體試樣為0-NaYF4: Yb3+/Er3+ 標(biāo)記2，4-D-IgG的PBS溶液。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測農(nóng)藥殘留試紙，其特征在于，所述檢測線以及質(zhì)控線均位 于層析膜上，納米粒子標(biāo)記結(jié)合墊與所述層析膜相連;所述層析膜為NC硝酸纖維素膜。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測農(nóng)藥殘留試紙，其特征在于，所述納米粒子標(biāo)記抗體試樣 中 0-NaYF4: Yb3+/Er3+標(biāo)記 2，4-D-IgG 的含量為0.00666-0.132yg。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測農(nóng)藥殘留試紙，其特征在于，所述檢測線上的標(biāo)記物為2， 4-D-0VA，所述質(zhì)控線的標(biāo)記物為羊抗兔二抗。5. 檢測農(nóng)藥殘留試紙的制備方法，其特征在于，包含下列步驟：51. 制備稀土上轉(zhuǎn)換納米材料；52. 制備農(nóng)藥多克隆抗體以及檢測所述農(nóng)藥多克隆抗體的效價(jià)；53. 利用所述步驟S1制備的產(chǎn)物標(biāo)記所述農(nóng)藥多克隆抗體；54. 利用所述步驟S3產(chǎn)物制備檢測農(nóng)藥殘留試紙。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測農(nóng)藥殘留試紙的制備方法，其特征在于，所述步驟S1包 含： S1.1將稀土氯化物、油酸以及十八烯置于燒瓶中攪拌抽真空30min，后停止攪拌加熱； S1.2將NaOH、NH4HF2以及甲醇置于燒杯中放入攪拌子，封上封口膜，于磁力攪拌器上常 溫?cái)嚢瑁? S1.3將所述步驟S1.1產(chǎn)物加熱到150 °C，保溫15~20miη即可，隨即關(guān)閉攪拌，關(guān)閉加 熱，使之降低至室溫； S1.4盡量少進(jìn)空氣的情況下滴加 S1.2所述溶液，反應(yīng)完全后通入Ν2，將滴加過程中將進(jìn) 入的空氣排盡； 31.5將體系加熱至75-85°(：，保溫1.511; S1.6在0.5h內(nèi)將所述步驟S1.5的產(chǎn)物升溫至310°C，Ν2保護(hù)下保溫2h，隨即在Ν2保護(hù)及 攪拌下冷卻至室溫； S1.7洗滌產(chǎn)物； S1.8利用所述步驟S1.7產(chǎn)物制備水溶性0-NaYF4:Yb，Er納米粒子。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測農(nóng)藥殘留試紙的制備方法，其特征在于，所述步驟S1.8包 含： SI. 8.1將所述步驟S1.7的產(chǎn)物、環(huán)己烷、叔丁醇、去離子水以及K2C〇3溶液室溫下混合攪 拌； S1.8.2將KMn〇4和NaI〇4水溶液緩慢滴入所述步驟SI. 8.1的產(chǎn)物，40°C下反應(yīng)48h，用 95%乙醇洗滌離心得初產(chǎn)物； S1.8.3初產(chǎn)物溶于HC1中，常溫下攪拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后離心洗滌離心得到產(chǎn)物。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測農(nóng)藥殘留試紙的制備方法，其特征在于，所述步驟S3包 含： S3.1分別配置pH=5以及pH=7.4的磷酸緩沖鹽溶液； S3 · 2 制備水溶性 0-NaYF4: Yb，Er 標(biāo)記 2，4-D-IgG。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測農(nóng)藥殘留試紙的制備方法，其特征在于，所述步驟S3.2 為： S3.2.1取經(jīng)KMn〇4_NaI〇4氧化溶于水的FNaYF4: Yb，Er制成溶液A，向所述溶液A中加入 所述步驟S3.1制備的pH=5的PBS緩沖液后，加入EDC與Sulfo-NHS，常溫?cái)嚢瑁? S3.2.2向所述步驟S3.2.1的產(chǎn)物中加入2，4-D-IgG，常溫反應(yīng)2h，離心出產(chǎn)物;將所述 產(chǎn)物用PBS洗2遍后定容于所述步驟S3.1制備的pH=7.4的PBS緩沖液中。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK106018374SQ201610590578
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月26日
【發(fā)明人】華瑞年, 國婷婷, 張偉, 于基成, 那立艷
【申請(qǐng)人】大連民族大學(xué)