一種atp熒光檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及產(chǎn)品檢測技術(shù)領(lǐng)域，提供一種熒光強度強、檢測靈敏、單位時間內(nèi)熒光反應(yīng)速率高、底物循環(huán)利用、熒光信號輸出周期增加的ATP熒光檢測方法，包括以下處理步驟：（1）樣品采集；（2）在反應(yīng)容器中加入螢火蟲熒光素酶及螢火蟲熒光素再生酶熒光素再生酶復(fù)合結(jié)構(gòu)、反應(yīng)底物螢火蟲熒光素、鎂離子、半胱氨酸，通入適量的溶劑，充分混勻溶解，得到反應(yīng)體系混合物溶液；（3）底物混合物溶液充分溶解待測樣品中的ATP，在大氣氧氣條件下，促發(fā)反應(yīng)，產(chǎn)生氧化態(tài)熒光素及光；（4）氧化態(tài)熒光素在螢火蟲熒光素再生酶熒光素再生酶及底物半胱氨酸作用下，被還原為螢火蟲熒光素，促使反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行；（5）采集光信號：將步驟（3）反應(yīng)產(chǎn)生的光進(jìn)行采集。
【專利說明】
一種ATP熒光檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及產(chǎn)品檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種ATP熒光檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]三磷酸腺苷(ATP)存在于從微生物到高等動植物等生物體的細(xì)胞中，主要作用是提供能量，參與體內(nèi)脂肪、蛋白質(zhì)、糖和核酸的代謝，是機體能量的重要來源，在維持生物體的正常機能上有著無可替代的作用。ATP的快速高效測定，對于研究細(xì)胞乃至機體的生理活性和代謝過程、進(jìn)行藥物敏感實驗以及食品衛(wèi)生監(jiān)控都有非常重要的意義。
[0003]食品安全快速檢測，是對食品/飲料進(jìn)行實時采樣，通過檢測樣品ATP含量反映樣品中微生物總數(shù)，進(jìn)而指示食品/飲料的新鮮程度。目前市面上的ATP檢測產(chǎn)品，都是基于螢火蟲熒光蛋白發(fā)光反應(yīng)機理(螢火蟲熒光蛋白酶，催化熒光素與ATP定量反應(yīng))，利用熒光強度反映ATP含量。反應(yīng)式如圖1所示，這種ATP檢測產(chǎn)品存在局限性，主要受螢火蟲熒光蛋白的穩(wěn)定性、熒光素半衰期及熒光強度太弱等因素影響，導(dǎo)致靈敏度不足，且檢測試劑有效工作期太短。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]因此，針對以上內(nèi)容，本發(fā)明提供一種熒光強度強、檢測靈敏、單位時間內(nèi)熒光反應(yīng)速率高、底物循環(huán)利用、熒光信號輸出周期增加的ATP熒光檢測方法。
[0005]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:一種ATP熒光檢測方法，包括以下處理步驟:
(1)樣品米集:米集需要檢測的樣品；
(2)在反應(yīng)容器中加入螢火蟲熒光素酶及螢火蟲熒光素再生酶復(fù)合結(jié)構(gòu)、反應(yīng)底物螢火蟲熒光素、鎂離子、半胱氨酸，通入適量的溶劑，充分混勻溶解，得到反應(yīng)體系混合物溶液；
(3)底物混合物溶液充分溶解步驟(I)采集的需要檢測的樣品中的ATP，在大氣氧氣條件下，促發(fā)反應(yīng)，產(chǎn)生氧化態(tài)熒光素及光；
(4)氧化態(tài)熒光素在螢火蟲熒光素再生酶及底物半胱氨酸作用下，被還原為螢火蟲熒光素，促使反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行；
(5)采集光信號:將步驟(3)反應(yīng)產(chǎn)生的光進(jìn)行采集。
[0006]優(yōu)選的，還包括對步驟(5)采集的光信號進(jìn)行放大處理，接著通過受光二極管的光電信號轉(zhuǎn)化，將熒光信號轉(zhuǎn)化為電信號，再通過檢測儀器自身的電路系統(tǒng)報告信號終端。
[0007]優(yōu)選的，所述螢火蟲熒光素酶及螢火蟲熒光素再生酶復(fù)合結(jié)構(gòu)包括游離態(tài)雙酶以及通過短肽、纖維小體偶聯(lián)的雙酶。
[0008]優(yōu)選的，所述反應(yīng)第五螢火蟲熒光素包括D型螢火蟲熒光素及其衍生物。
[0009]優(yōu)選的，所述半胱氨酸包括D型半胱氨酸及L型半胱胺氨酸。
[0010]優(yōu)選的，所述溶劑包括純凈水、磷酸緩沖溶液、Tris-HCl緩沖溶液。
[0011]優(yōu)選的，所述螢火蟲熒光素、螢火蟲熒光素酶與螢火蟲熒光素再生酶復(fù)合結(jié)構(gòu)、鎂離子、半耽氛酸的反應(yīng)濃度為0.0l-1Om mol/L、0.01-10mg/mL、0.0l-lOOm mol/L、0.0l-1Ommol/L。
[0012]通過采用前述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的ATP熒光檢測方法，包括以下處理步驟:采集需要檢測的物品，在反應(yīng)容器中加入螢火蟲熒光素酶及螢火蟲熒光素再生酶復(fù)合結(jié)構(gòu)、反應(yīng)底物螢火蟲熒光素、鎂離子、半胱氨酸，通入適量的純凈水，充分混勻溶解，得到反應(yīng)體系混合物溶液，反應(yīng)體系混合物溶液充分溶解待測樣品中的ATP，在有氧的大氣環(huán)境中促發(fā)反應(yīng)，產(chǎn)生氧化態(tài)熒光素及光，氧化態(tài)熒光素在螢火蟲熒光素再生酶及底物半胱氨酸作用下，被還原為螢火蟲熒光素，促使反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行;利用螢火蟲熒光素再生酶對底物螢火蟲熒光素再利用，在單位時間內(nèi)提高熒光反應(yīng)速率，增強熒光強度，進(jìn)而增強熒光輸出信號，同時使原本不可再生的底物螢火蟲熒光素循環(huán)利用，增加熒光信號輸出周期;接著對反應(yīng)產(chǎn)生的光進(jìn)行采集;進(jìn)一步的，通過光信號放大處理以及通過受光二極管的光電信號轉(zhuǎn)化，將熒光信號轉(zhuǎn)化為電信號，再通過檢測儀器自身的電路系統(tǒng)報告信號終端，利用物理的光電信號轉(zhuǎn)換對熒光信號進(jìn)行放大處理，提高信號指示精度。采用本發(fā)明的檢測方法，熒光信號延長24?72小時并保持穩(wěn)定的信號強度，熒光信號強度提高了 I?100倍。
【附圖說明】
[0013]圖1為本發(fā)明【背景技術(shù)】的反應(yīng)示意圖；
圖2為本發(fā)明實施例中的反應(yīng)式；
圖3為本發(fā)明實施例中的反應(yīng)模式圖。
【具體實施方式】
[0014]以下將結(jié)合具體實施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方式，借此對本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題，并達(dá)成技術(shù)效果的實現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實施。
[0015]若未特別指明，實施例中所采用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所采用的試劑和產(chǎn)品也均為可商業(yè)獲得的。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標(biāo)明。
[0016]本發(fā)明的實施例為:
參考圖2及圖3，一種ATP熒光檢測方法，包括以下處理步驟:
(1)樣品米集:米集需要檢測的牛肉樣品5g;
(2)在反應(yīng)容器中加入螢火蟲熒光素0.25mMol/L、螢火蟲熒光素酶及螢火蟲熒光素再生酶復(fù)合結(jié)構(gòu)0.2 mg/L、反應(yīng)底物螢火蟲熒光素0.2 mMol/L、鎂離子10 mMol/L、半胱氨酸5mMol/L，通入適量的純凈水、磷酸緩沖溶液、Tris-HCl緩沖溶液，充分混勻溶解，得到底物混合物溶液；
(3)底物混合物溶液充分溶解步驟(I)采集的需要檢測的樣品中的ATP，促發(fā)反應(yīng)，產(chǎn)生氧化態(tài)熒光素及光；
(4)氧化態(tài)熒光素在熒光素再生酶及底物半胱氨酸作用下，被還原為螢火蟲熒光素，促使反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行；
(5)采集光信號:將步驟(3)反應(yīng)產(chǎn)生的光進(jìn)行采集； (6)放大處理，接著通過受光二極管的光電信號轉(zhuǎn)化，將熒光信號轉(zhuǎn)化為電信號，再通過檢測儀器自身的電路系統(tǒng)報告信號終端。
[0017]本發(fā)明的ATP熒光檢測方法，包括以下處理步驟:采集需要檢測的物品，在反應(yīng)容器中加入螢火蟲熒光素酶及螢火蟲熒光素再生酶復(fù)合結(jié)構(gòu)、反應(yīng)底物螢火蟲熒光素、鎂離子、半胱氨酸，通入適量的純凈水，充分混勻溶解，得到反應(yīng)體系混合物溶液，反應(yīng)體系混合物溶液充分溶解待測樣品中的ATP，在有氧的大氣環(huán)境中促發(fā)反應(yīng)，產(chǎn)生氧化態(tài)熒光素及光，氧化態(tài)熒光素在螢火蟲熒光素再生酶及底物半胱氨酸作用下，被還原為螢火蟲熒光素，促使反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行;利用螢火蟲熒光素再生酶對底物螢火蟲熒光素再利用，在單位時間內(nèi)提高熒光反應(yīng)速率，增強熒光強度，進(jìn)而增強熒光輸出信號，同時使原本不可再生的底物螢火蟲熒光素循環(huán)利用，增加熒光信號輸出周期;接著對反應(yīng)產(chǎn)生的光進(jìn)行采集;進(jìn)一步的，通過光信號放大處理以及通過受光二極管的光電信號轉(zhuǎn)化，將熒光信號轉(zhuǎn)化為電信號，再通過檢測儀器自身的電路系統(tǒng)報告信號終端，利用物理的光電信號轉(zhuǎn)換對熒光信號進(jìn)行放大處理，提高信號指示精度。采用本發(fā)明的檢測方法，熒光信號延長24?72小時并保持穩(wěn)定的信號強度，熒光信號強度提高了 I?100倍。
[0018]其中，本發(fā)明的螢火蟲熒光素酶和螢火蟲熒光素再生酶的單體及復(fù)合物結(jié)構(gòu)都是通過微生物發(fā)酵生長合成的，通過基因表達(dá)調(diào)控隨著細(xì)菌生成代謝產(chǎn)生，通過對基因的表達(dá)調(diào)控提高了這兩種酶的單體及其融合表達(dá)復(fù)合結(jié)構(gòu)的蛋白穩(wěn)定性和生物活性，本發(fā)明的螢火蟲熒光素酶和螢火蟲熒光素再生酶已為市場公知的物質(zhì)。
[0019]以上所記載，僅為利用本創(chuàng)作技術(shù)內(nèi)容的實施例，任何熟悉本項技藝者運用本創(chuàng)作所做的修飾、變化，皆屬本創(chuàng)作主張的專利范圍，而不限于實施例所揭示者。
【主權(quán)項】
1.一種ATP熒光檢測方法，其特征在于，包括以下處理步驟: (1)樣品米集:米集需要檢測的樣品； (2)在反應(yīng)容器中加入螢火蟲熒光素酶及螢火蟲熒光素再生酶復(fù)合結(jié)構(gòu)、反應(yīng)底物螢火蟲熒光素、鎂離子、半胱氨酸，通入適量的溶劑，充分混勻溶解，得到反應(yīng)體系混合物溶液； (3)底物混合物溶液充分溶解步驟(I)采集的需要檢測的樣品中的ATP，在大氣氧氣條件下，促發(fā)反應(yīng)，產(chǎn)生氧化態(tài)熒光素及光； (4)氧化態(tài)熒光素在螢火蟲熒光素再生酶及底物半胱氨酸作用下，被還原為螢火蟲熒光素，促使反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行； (5)采集光信號:將步驟(3)反應(yīng)產(chǎn)生的光進(jìn)行采集。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ATP熒光檢測方法，其特征在于:還包括對步驟(5)采集的光信號進(jìn)行放大處理，接著通過受光二極管的光電信號轉(zhuǎn)化，將熒光信號轉(zhuǎn)化為電信號，再通過檢測儀器自身的電路系統(tǒng)報告信號終端。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的ATP熒光檢測方法，其特征在于:所述螢火蟲熒光素酶及螢火蟲熒光素再生酶復(fù)合結(jié)構(gòu)包括游離態(tài)雙酶以及通過短肽、纖維小體偶聯(lián)的雙酶。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的ATP熒光檢測方法，其特征在于:所述反應(yīng)底物螢火蟲熒光素包括D型螢火蟲熒光素及其衍生物。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的ATP熒光檢測方法，其特征在于:所述半胱氨酸包括D型半胱氨酸及L型半胱胺氨酸。6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的ATP熒光檢測方法，其特征在于:所述溶劑包括純凈水、磷酸緩沖溶液、Tr is-HCl緩沖溶液。7.根據(jù)要求6所述的ATP熒光檢測方法，其特征在于:所述螢火蟲熒光素、螢火蟲熒光素酶與螢火蟲熒光素再生酶復(fù)合結(jié)構(gòu)、鎂離子、半胱氨酸的反應(yīng)濃度為0.0l?1m mol/L、.0.01?10mg/mL、0.01?100m mol/L、0.01?1m mol/L0
【文檔編號】G01N21/76GK106018387SQ201610319763
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月13日
【發(fā)明人】孫曉暉, 方柏山
【申請人】孫曉暉