三黃方制劑成分檢測方法及指紋圖譜構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于藥物分析領(lǐng)域，涉及一種中藥指紋圖譜的測定方法，本發(fā)明公開了一種三黃方制劑成分檢測方法，將供試品溶液注入U(xiǎn)PLC?Q?TOF?MS聯(lián)用儀，以UPLC?Q?TOF?MS法采用梯度洗脫進(jìn)行測定，根據(jù)UPLC?Q?TOF?MS聯(lián)用儀檢測結(jié)果，獲得三黃方制劑的成分。本發(fā)明還公開了利用上述三黃方制劑成分檢測方法，取不同批次的三黃方制劑供試品溶液按上述的方法進(jìn)行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果，標(biāo)定共有峰，建立了三黃方制劑超高效液相色譜?高分辨?飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用指紋圖譜。該方法和指紋圖譜可作為三黃方制劑質(zhì)量控制與分析的有效方法之一。
【專利說明】
三黃方制劑成分檢測方法及指紋圖譜構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于藥物分析領(lǐng)域，涉及中藥指橘綠木霉菌譜的測定方法，尤其涉及一種 三黃方制劑成分檢測方法及超高效液相色譜-高分辨-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用指紋圖譜構(gòu)建方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 中藥指紋圖譜是采用現(xiàn)代分析技術(shù)建立的能反映中藥材或中成藥的某類或幾類 成分的色譜或光譜信息的圖譜，能較全面地反映中藥的整體化學(xué)特征，體現(xiàn)其內(nèi)在的整體 質(zhì)量，可彌補(bǔ)僅用少數(shù)成分來控制中藥質(zhì)量的弊端，已成為國際公認(rèn)的控制中藥或天然藥 物質(zhì)量的有效手段。然而，中藥化學(xué)成分的多樣性和復(fù)雜性以及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的不確定性， 增加了中藥指紋圖譜建立的難度以及指紋圖譜的有效和重復(fù)性。
[0003] 目前，中藥指紋圖譜研究較多的是中藥化學(xué)指紋圖譜，是采用色譜、波譜和其他分 析方法建立的用于表征中藥化學(xué)成分特征的指紋圖譜。高效液相色譜(HPLC)具有分離效能 高、分析速度快、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，以及可配合不同檢測器來分析各種類型樣品的優(yōu)勢，已 成為公認(rèn)的建立中藥指紋圖譜的主導(dǎo)方法。近年來興起的超高效液相色譜技術(shù)(UPLC)具有 超高壓、超高靈敏度、超高分離度等特點(diǎn)，它借助HPLC的理論與原理，采用1.7μπι粒徑的色譜 柱填料，能使一次指紋圖譜的分析時(shí)間由原來的至少1小時(shí)縮短為為l〇min左右，并且色譜 峰容量和穩(wěn)定性也顯著提高，UPLC在中藥及天然產(chǎn)物等復(fù)雜體系的分離分析上具有明顯優(yōu) 勢，為中藥指紋圖譜研究提供了新的分離平臺。
[0004] 紫外(UV)檢測器是目前與液相色譜聯(lián)用進(jìn)行指紋圖譜研究應(yīng)用最廣泛的檢測方 法。然而化學(xué)成分的紫外吸光度有加和性，從而使測定結(jié)果產(chǎn)生偏差，不能真實(shí)反映中藥化 學(xué)成分的含量。而且紫外檢測法只適合具有紫外吸收的中藥化學(xué)成分，對于無紫外吸收或 吸收較弱的成分，難以進(jìn)行有效測定。特別本復(fù)方制劑中君藥黃芪中標(biāo)志性重要化學(xué)成分 三萜皂苷類(如黃芪甲苷IV等）以及佐藥澤瀉中標(biāo)志性重要化學(xué)成分原帖烷三萜類成分(如 澤瀉醇A等)在紫外區(qū)吸收很弱并且干擾較多，不適合用紫外檢測器測定。
[0005] 質(zhì)譜(MS)檢測器可用于中藥中各種化合物的檢測，均可產(chǎn)生較好的響應(yīng)，是一種 高靈敏度的通用檢測器，更重要的是能提供化合物的分子量和分子結(jié)構(gòu)信息（串聯(lián)質(zhì)譜）。 采用質(zhì)譜檢測器，通過確定離子的質(zhì)量掃描范圍，可以使其包含所有目標(biāo)化合物的信息。應(yīng) 用總離子流檢測模式，可以綜合化合物的全部信息；進(jìn)而，通過考查共有色譜峰的質(zhì)譜信 息，可以確定色譜峰的組成情況，保證色譜峰為單一化合物組成，具有較好的科學(xué)性。由于 中藥化學(xué)成分的復(fù)雜性，保證中藥指紋圖譜中的色譜峰為單一化合物峰是很難的或者說幾 乎不可能，而采用質(zhì)譜檢測器，可以從總離子流色譜圖（TIC)中提取特定m/z的離子，建立提 取離子色譜圖（EIC)，從而保證了色譜峰為單一化合物組成。另外，通過對共有峰進(jìn)行質(zhì)譜 定性，建立共有峰的提取離子色譜圖，進(jìn)而通過色譜峰與化合物m/z的一一對應(yīng)關(guān)系，實(shí)現(xiàn) 對各共有峰的準(zhǔn)確定位和測量，從而可彌補(bǔ)其它方法、實(shí)驗(yàn)室之間的重現(xiàn)性差的缺點(diǎn)。
[0006] 飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀(Q-T0F-MS)是高分辨串聯(lián)質(zhì)譜，其顯著特點(diǎn)是高靈敏度、高 選擇性，能得到高質(zhì)量質(zhì)譜圖和化合物精確分子量(質(zhì)量精度<3X 106)，能大大提高化合物 結(jié)構(gòu)鑒定的準(zhǔn)確性。UPLC-Q-TOF-MS結(jié)合了非常優(yōu)良的色譜分離能力和非常靈敏、非常智能 的檢測能力，在中藥化學(xué)指紋圖譜中極具發(fā)展前景和空間，優(yōu)勢突出，特點(diǎn)明顯，必將成為 中藥指紋圖譜的發(fā)展趨勢和方向。
[0007]三黃方為復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院協(xié)定處方，由黃芪、黃連、澤瀉、蒲黃、茵陳配伍而 成，多年來臨床應(yīng)用于治療代謝綜合癥和非酒精性脂肪肝，為中醫(yī)科早期協(xié)定處方益氣散 聚方(專利號：200810034507.3)的精簡方(專利申請?zhí)枺?01511018056.0)，具有益氣散聚功 效，能夠改善患者體征與體內(nèi)胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)、能促進(jìn)氣血精微正常運(yùn)化，糾正機(jī)體代謝異 常，即具有益氣散結(jié)、清熱化痰、祛濕降濁、調(diào)脂化瘀的作用。由于黃芪中重要有效成分如黃 芪皂苷IV等三萜皂苷類以及澤瀉中重要有效成分如澤瀉醇及其酯類等原萜烷三萜類的紫 外吸收較差，一般的紫外檢測器檢測靈敏度較差;蒸發(fā)光散射檢測器靈敏度也比較差，限制 了含這兩種中藥的復(fù)方制劑的指紋圖譜研究。目前為止我們報(bào)道了采用2成分、4個(gè)成分含 量測定方法控制三黃方制劑的含量，但是仍沒有其多成分含量測定以及利用UPLC-Q-TOF-MS進(jìn)行質(zhì)量控制的報(bào)道。本發(fā)明基于《中國藥典》2015版對5種組成中藥的質(zhì)量鑒定所需測 定的種11種化學(xué)成分(黃芪為黃芪甲苷IV、毛蕊異黃酮葡萄糖苷;黃連為表小檗堿、黃連堿、 巴馬汀、小檗堿;澤瀉為23-乙酰澤瀉醇Β;生蒲黃為異鼠李素-3-0-新橙皮苷和香蒲新苷;茵 陳為綠原酸與濱蒿內(nèi)酯）以及國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)品目錄，并參考三黃方制劑血 清化學(xué)研究（18種成分能夠入血），選擇出的23種指紋圖譜測定指標(biāo)除了涵蓋以上化學(xué)成分 并分別針對藥典中對5種中藥特別生蒲黃、澤瀉所需檢測目標(biāo)成分較少的缺點(diǎn)新增了 12種 化學(xué)成分，并經(jīng)10批三黃方溶液指紋圖譜的測定，初步確定共有化學(xué)成分，作為三黃方制劑 質(zhì)量控制的參考方法。
[0008] 本技術(shù)基于高端液相測定技術(shù)，所需設(shè)備尚未在國內(nèi)大量普及，但對于一般綜合 性大學(xué)與大型中藥生產(chǎn)藥企都為必備配備。三黃方制劑目前已基本完成臨床前研究，將初 步作為復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院院內(nèi)開發(fā)制劑，其制劑尚未大規(guī)模生產(chǎn)，目前的指紋圖譜主 要作為參考圖譜，但本測定方法可以作為三黃方制劑的質(zhì)量控制方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，提供一種利用UPLC-Q-TOF-MS簡 單快速進(jìn)行三黃方制劑質(zhì)量控制的方法，以及由此方法所構(gòu)建的三黃方制劑指紋圖譜。 [0010]本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種三黃方制劑成分檢測方法，包括以下步驟：
[0011]步驟1:供試品溶液的制備
[0012]取黃芪、黃連、澤瀉、生蒲黃和茵陳，用水和乙醇提取，定容，得到供試品溶液；
[0013]步驟2:供試品溶液的測定
[0014] 吸取供試品溶液注入U(xiǎn)PLC-Q-TOF-MS聯(lián)用儀，以UPLC-Q-TOF-MS法采用梯度洗脫進(jìn) 行測定，根據(jù)UPLC-Q-TOF-MS聯(lián)用儀檢測結(jié)果，獲得三黃方制劑的成分。
[0015] 優(yōu)選地，上述的步驟1具體包括以下步驟：
[0016] 步驟a:將黃芪、黃連、澤瀉、生蒲黃和茵陳用純化水浸泡后，再加入純化水同煮，然 后濾取藥液并濃縮處理得到濃縮藥液；
[0017] 步驟b:往步驟a得到的濃縮藥液中加入乙醇攪拌均勻后，常溫沉淀24小時(shí)，然后取 上清液回收乙醇并進(jìn)行濃縮處理，再次取上清液回收乙醇并進(jìn)行濃縮處理，得到濃縮液；
[0018] 步驟c:往步驟b得到的濃縮液中加入水?dāng)嚢杈鶆蚝?，沉?4小時(shí)，然后將上清液進(jìn) 行濃縮處理，定容得到供試品溶液。
[0019] 優(yōu)選地，上述的步驟1中按重量比計(jì)算，各組分含量分別為:黃芪1-4份;黃連1份； 澤瀉1 -3份;生蒲黃1 -3份;茵陳1 -3份。
[0020] 優(yōu)選地，上述步驟2中UPLC色譜條件為:流動(dòng)相為0.1 %的甲酸水-0.1 %的甲酸乙 腈;流速0.3-0.5!11171^11;柱溫35-50°(：;進(jìn)樣量1-54匕
[0021] 優(yōu)選地，上述步驟2中UPLC色譜測定方式為正負(fù)離子全掃描，電噴霧(ESI)離子源 檢測模式;掃描質(zhì)量范圍為l〇〇-l〇〇〇Da。
[0022] 優(yōu)選地，上述步驟2中UPLC色譜的色譜柱為ACQUITYUPLC BEH C18色譜柱。
[0023] 優(yōu)選地，上述的ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱的色譜條件為：流速0.4mL/min，柱 溫45-50°C，進(jìn)樣量 l-5yL。
[0024]本發(fā)明的第二個(gè)目的提供一種三黃方制劑指紋圖譜構(gòu)建方法，取不同批次的三黃 方制劑供試品溶液按上述的三黃方制劑成分檢測方法進(jìn)行測定，根據(jù)檢測結(jié)果，標(biāo)定共有 峰，建立三黃方制劑指紋圖譜。
[0025]通過10批三黃方制劑供試品溶液比對，確定了 23種共有成分，并標(biāo)出共有峰。本發(fā) 明檢測條件下樣品中除目的成分外不含有其它干擾成分，結(jié)果顯示本發(fā)明提供的檢測方法 精密度高、更穩(wěn)定、重復(fù)性好，耐用性良好，本發(fā)明的圖譜可用于三黃方制劑的質(zhì)量控制與 分析。
[0026]本發(fā)明利用指紋圖譜從整體上表征三黃方制劑的化學(xué)成分，并通過血清藥物化學(xué) 方法證明該方法可用于測定18個(gè)共有峰均為被吸收入血的成分，可能是三黃方制劑發(fā)揮藥 效的潛在有效成分。
[0027]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0028] (1)本發(fā)明在國內(nèi)外首次采用UPLC-Q-T0F-MS作為分析手段，利用23種容易購買的 標(biāo)準(zhǔn)品(包括《中國藥典》2015版規(guī)定需要測定的5種組成中藥材中共計(jì)11種化學(xué)成分)建立 了三黃方制劑化學(xué)指紋圖譜質(zhì)量控制方法，與現(xiàn)有報(bào)道的HPLC-UV分析方法相比，不僅大大 縮短了分析時(shí)間，提高了分離效率和檢測靈敏度;而且能給各峰賦予分子量的信息，通過建 立離子色譜圖，可準(zhǔn)確計(jì)算各峰的峰面積，并在實(shí)驗(yàn)室間重現(xiàn)時(shí)若保留時(shí)間發(fā)生偏離，可通 過各峰的分子量信息進(jìn)行準(zhǔn)確定位，從而保證了指紋圖譜檢測方法的可復(fù)制性，可用于三 黃方有關(guān)制劑的質(zhì)量控制與分析。
[0029] (2)可以同時(shí)測定三黃方中18個(gè)入血成分，對于進(jìn)一步研究三黃方制劑的血清藥 理學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)、開發(fā)新藥具有比較重要的作用。
[0030] (3)本方案也可用于5種組成中藥材的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)分析。
[0031] (4)本發(fā)明檢測條件下樣品中除目的成分外不含有其它干擾成分，結(jié)果顯示本發(fā) 明提供的檢測方法精密度高、更穩(wěn)定、重復(fù)性好，并且耐用性良好。
【附圖說明】
[0032]圖1為三黃方制劑和5種組成中藥的UPLC-Q-T0F-MS陽離子提取離子色譜圖（HQ = 黃芪，HL =黃連，ZX =澤瀉，PH=蒲黃，YC =茵陳，SHD =三黃方提取液）。
[0033]圖2為三黃方制劑和5種組成中藥的UPLC-Q-T0F-MS陰離子提取離子色譜圖（HQ = 黃芪，HL =黃連，ZX =澤瀉，PH=蒲黃，YC =茵陳，SHD =三黃方提取液）。
[0034]圖3為三黃方制劑的UPLC-Q-T0F-MS指紋圖譜（陽離子模式）。
[0035]圖4為三黃方制劑大鼠含藥血清的UPLC-Q-T0F-MS陽離子提取離子色譜圖。
[0036]圖5為三黃方制劑大鼠含藥血清的UPLC-Q-T0F-MS陰離子提取離子色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)和具體的介紹，以使更好的理解本發(fā)明， 但是下述實(shí)施例并不限制本發(fā)明范圍。
[0038] 實(shí)施例1
[0039]本實(shí)施例為三黃方制劑UPLC-Q-T0F-MS指紋圖譜的測定方法，詳細(xì)方法如下：
[0040] 1.儀器與試劑藥品
[0041] 1丄儀器
[0042] Waters公司AcquityTM Ultra Performance LC system(Waters，Milford，USA)， 系統(tǒng)配備有四元栗，真空脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器，控制軟件為MassLynX(V 4.1)。
[0043] 1.2.試劑藥品
[0044] 乙腈和甲酸為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純；
[0045]黃芪甲苷IV，芒柄花素，毛蕊異黃酮，毛蕊異黃酮-7-0-?Η)-葡萄糖苷，小檗堿，巴 馬汀，藥根堿，23-乙酰澤瀉醇B，綠原酸，東莨菪內(nèi)酯，6,7_二甲氧基香豆素，香蒲新甙，異鼠 李素-3-0-新橙皮苷，異鼠李素，柚皮素，槲皮素，山奈素購自中國食品藥品監(jiān)督管理局;表 小檗堿，黃連堿，澤瀉醇A，澤瀉醇F，24-乙酰澤瀉醇A，6-羥基-7-甲氧基-香豆素購自上海華 壹生物技術(shù)有限公司；5種中藥材購自上海虹橋中藥飲片有限公司。
[0046] 2.供試品溶液的制備
[0047]將符合中藥炮制規(guī)范的30g黃芪、9g黃連、15g澤瀉、15g生蒲黃、15g茵陳稱量、配劑 備用，其中黃芪、黃連、澤瀉、生蒲黃、茵陳的重量比為1-4:1:1-3:1-3:1-3。將以上藥物先浸 泡0.5h，加純化水同煮(其中生蒲黃包煎），提取2次，每次加水8-12倍，煮沸2次，每次lh，濾 取藥液，濃縮生藥，加入1倍量的95%酒精，攪拌均勻，常溫沉淀24小時(shí)，取上清液回收乙醇 并濃縮;再加入5倍量95 %酒精，靜置24小時(shí)，取上清液回收干凈乙醇；加入2倍水（70-80 °C)，攪拌，10-15Γ環(huán)境沉淀24小時(shí)，吸取上清液，并與藥用矯味劑、防腐劑混合均勻后制成 口服溶液，濾除沉淀物，濃縮為20mL溶液(即4.2g中藥/mL溶液）。
[0048] 吸取50yL上述溶液，加入950yL甲醇-乙腈（1:1)溶液，4°C冰箱放置4h，離心（4°C， 20，267g，15min)，取上清，進(jìn)樣量為2yL。
[0049] 3.指紋圖譜檢測條件
[0050] 色譜條件：分析柱為ACQUITY UPLCTM BEH C18column(100mmX2.1mm i.d.，1·7μ m，waters)，柱溫45°C，梯度洗脫【Α為0.1%(v/v)的甲酸溶液，Β為含0.1%(v/v)甲酸的乙腈 溶液，梯度變化情況如下 ：0-0.5min，5%B;0.5-4min，5-20%B;4-6min，20-25%B;6-8min， 25-50%B；8-12.5min,50-85%B； 12.5-13.5min,85-100%B； 13.5-15min,100%B；15-15.5min，100-5%B;15.5-17min，5%B】。
[0051 ] 質(zhì)譜條件：電噴霧(ESI)離子源(Waters Corporation，Mi If ord，MA)，全掃描數(shù)據(jù) 設(shè)置為l〇〇-l〇〇〇Da，間隔時(shí)間為0.02s，掃描秒時(shí)間為0.3s，毛細(xì)管電壓為3000V(陽離子模 式)和2800v(陰離子模式），脫溶劑溫度為350°C，樣品錐電壓為35v(陽離子模式)和50v(陰 離子模式），碰撞能量為4eV，提取錐電壓為4.0V，源溫度為115 °C，錐氣體流速為50L/h，脫溶 劑氣流速為6001711。0.21^/11^亮氨酸腦啡肽溶液(>=10(^171]1；[11)在線校正。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1 和圖2所示。實(shí)施例2
[0052]本實(shí)施例為三黃方制劑指紋圖譜的建立與評價(jià) [0053] 1.1.共有峰的確定
[0054]收集10批三黃方制劑，按實(shí)施例1中的方法操作，按實(shí)施例1的檢測條件進(jìn)行分析。 從檢測結(jié)果來看，有23個(gè)化合物峰是各批供試品共有，因此將這23個(gè)化合物峰作為三黃方 制劑的共有化合物峰，從總離子流色譜圖中獲取這23個(gè)化合物峰的提取離子色譜圖，如圖3 所示。其中巴馬汀的峰面積最大，選為參照峰。
[0055] 飛行時(shí)間質(zhì)譜為高分辨質(zhì)譜，能夠測定離子的精確質(zhì)量，進(jìn)而根據(jù)測量偏差小于 5PPM和同位素?cái)M合度最小的原則計(jì)算各共用峰的分子式。
[0056] 如表1所示，按出峰時(shí)間順序排列，23個(gè)共有峰的質(zhì)核比分別為:化合物2(峰l)，m/ z 354;化合物 11(峰2)，m/z 192;化合物 13(峰3)，m/z 192;化合物 14(峰4)，m/z 770;化合 物 15(峰5)，m/z 446;化合物 18(峰6)，m/z 624;化合物25(峰7)，m/z 206;化合物27(峰8)， m/z 320;化合物30(峰9)，m/z 336;化合物31(峰 10)，m/z 338;化合物33(峰ll)，m/z 302; 化合物34(峰12)，m/z 284;化合物35(峰13)，m/z 336;化合物36(峰14)，m/z 352;化合物37 (峰15)，111/2 272;化合物40(峰16)，111/2 316;化合物41(峰17)，111/2 268;化合物42(峰18)， m/z 784;化合物44(峰 19)，m/z 300;化合物51(峰20)，m/z 488;化合物52(峰21)，m/z 490; 化合物54(峰22)，111/2 532;化合物56(峰23)，111/2 514。
[0057]另外有33個(gè)化學(xué)成分的質(zhì)核比分別為:化合物l，m/z 354;化合物3，m/z 368;
[0058] 化合物4，111/2 594;化合物5，111/2 516;化合物6，111/2 684;化合物7，111/2 342;
[0059] 化合物8，111/2 164;化合物9，111/2 368;化合物10，111/2 464;化合物12，111/2 464;
[0060] 化合物16，111/2 740;化合物17，111/2 594 ;化合物19，111/2 624;化合物20，111/2 286 ;
[0061 ]化合物21，111/2 322;化合物22，111/2 478 ;化合物23，111/2 284;化合物24，111/2 188 ;
[0062] 化合物26，111/2 316;化合物28，111/2 354 ;化合物29，111/2 338;化合物32，111/2 430 ;
[0063] 化合物38，111/2 334;化合物39，111/2 350 ;化合物43，111/2 504;化合物45，111/2 528 ;
[0064] 化合物46，111/2 826;化合物47，111/2 486;化合物48，111/2 826;化合物49，111/2 488;
[0065] 化合物50，111/2 528;化合物53，111/2 532 ;化合物55，111/2 472。
[0066] 另外，三黃方制劑指紋圖譜各共有峰的相對峰面積如表2所示，從表2可以看出不 同批次的供試品共有峰的相對峰面積相似度很高，變異系數(shù)很小，說明本方法用于測定三 黃方制劑含量重復(fù)性高，結(jié)果精準(zhǔn)，可用于三黃方制劑成分含量的測定。
[0067] 表1 UPLC-ESI-Q-T0F-MS所測定的三黃方制劑的化學(xué)成分

[0070]
[0071] a)Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge,b)Coptis chinensis Franch.,c) Alismao rientale(Sam.)Juz.d)Typha angustifolia L.,e)
[0072] Artemisia capillaries Thunb.；
[0073] Glc:β-D-glucose；Rha:rhamnopyrano；Xy1: xylose
[0074] 表2三黃方制劑指紋圖譜各共有峰的相對峰面積

[0077] 實(shí)施例3
[0078]本實(shí)施例為三黃方制劑入血成分的確定，具體步驟如下：
[0079] 取Wistar大鼠（200±20g)，禁食12h，口服三黃方制劑液，給藥后lh用苯巴比妥鈉 生理鹽水液腹腔注射麻醉（濃度100mg/mL，2 . OmL/kg體重），經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，離心 (3000rpm，lOmin，4°C)，取血清200yL，加入800yL甲醇-乙腈（1:1)溶液，4°C冰箱放置4h，離 心(4 °C，20，267g，15min)，取上清，進(jìn)樣量為6yL，按擬定的色譜條件檢測，獲得18個(gè)入血成 分的質(zhì)荷比的提取離子色譜圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4與圖5所示。
[0080] 本實(shí)施例利用指紋圖譜從整體上表征三黃方制劑的化學(xué)成分，并通過血清藥物化 學(xué)方法證明該方法可用于測定18個(gè)共有峰均為被吸收入血的成分，可能是三黃方制劑發(fā)揮 藥效的潛在有效成分。
[0081 ] 實(shí)施例4
[0082] 本實(shí)施例主要選取7個(gè)重要的化學(xué)標(biāo)志性成分并對其同時(shí)定量分析用于對本發(fā)明 的測定方法做進(jìn)一步的驗(yàn)證。
[0083] (1)線性范圍與檢測限、定量限考察：線性與范圍研究通過對7個(gè)選定化學(xué)成分配 制6個(gè)不同濃度的工作液進(jìn)行考察，每個(gè)樣品被測試2次。檢測限與定量限分別為信噪比（S/ N)為3與10的標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度。結(jié)果見表2。
[0084] (2)重復(fù)性考察:同一樣品被重復(fù)分析6次，用于考察方法的重復(fù)性。結(jié)果見表2。
[0085] (3)精密度考察：日內(nèi)精密度通過一天內(nèi)對5個(gè)樣品每間隔一定時(shí)間測定1次，共5 次測定；日間精密度通過連續(xù)5天在同一時(shí)刻測定同一濃度樣品獲得。結(jié)果見表2。
[0086] (4)準(zhǔn)確度考察:通過加樣回收率考察。即向3份已知含量的樣品中分別加入不同 含量(已知含量的80 %、100 %和120 % )的同種標(biāo)準(zhǔn)品，測定所得樣品中目標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品的含量， 并計(jì)算實(shí)際檢測量與理論添加量的差異。計(jì)算公式為：回收率（％ ) = 100 X (檢測量-理論加 入量)/理論加入量;并以相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)表示變異系數(shù)。結(jié)果見表3。
[0087]通過7個(gè)重要的化學(xué)標(biāo)志性成分做為對照對比，進(jìn)一步驗(yàn)證了本發(fā)明的測定方法 準(zhǔn)確度高，重復(fù)性良好。
[0088]表3 7種標(biāo)志性化合物的定量分析
[0090]以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限 制于以上描述的具體實(shí)施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和 替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和 修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種三黃方制劑成分檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟1:供試品溶液的制備 取黃芪、黃連、澤瀉、生蒲黃和茵陳，用水和乙醇進(jìn)行濃縮處理，得到供試品溶液； 步驟2:供試品溶液的測定 吸取供試品溶液注入U(xiǎn)PLC-Q-TOF-MS聯(lián)用儀，以UPLC-Q-TOF-MS法采用梯度洗脫進(jìn)行測 定，根據(jù)UPLC-Q-TOF-MS聯(lián)用儀檢測結(jié)果，獲得三黃方制劑的成分。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三黃方制劑成分檢測方法，其特征在于，所述的步驟1具體包 括以下步驟： 步驟a:將黃芪、黃連、澤瀉、生蒲黃和茵陳用純化水浸泡后，再加入純化水同煮，然后濾 取藥液并濃縮處理得到濃縮藥液； 步驟b:往步驟a得到的濃縮藥液中加入乙醇攪拌均勻后，常溫沉淀24小時(shí)，然后取上清 液回收乙醇并進(jìn)行濃縮處理，再次取上清液回收乙醇并進(jìn)行濃縮處理，得到濃縮液； 步驟c:往步驟b得到的濃縮液中加入水?dāng)嚢杈鶆蚝螅恋?4小時(shí)，然后將上清液進(jìn)行濃 縮處理，定容得到供試品溶液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三黃方制劑成分檢測方法，其特征在于，所述的步驟1中黃芪、 黃連、澤瀉、生蒲黃和茵陳，按重量份計(jì)算，各組分含量分別為:黃芪1-4份;黃連1份;澤瀉1-3份;生蒲黃1_3份;茵陳1-3份。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三黃方制劑成分檢測方法，其特征在于，所述步驟2中UPLC色 譜條件為:流動(dòng)相為0.1 %的甲酸水-0.1 %的甲酸乙腈;流速0.3-0.5mL/min;柱溫35-50°C ; 進(jìn)樣量l-5yL。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三黃方制劑成分檢測方法，其特征在于，所述步驟2中UPLC色 譜測定方式為正負(fù)離子全掃描，電噴霧（ESI)離子源檢測模式；掃描質(zhì)量范圍為100-1000Da〇6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三黃方制劑成分檢測方法，其特征在于，所述步驟2中UPLC色 譜的色譜柱為ACQUITYUPLC BEH C18色譜柱。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的三黃方制劑成分檢測方法，其特征在于，所述的ACQUITYUPLC BEH C18色譜柱的色譜條件為:流速0.4mL/min，柱溫45-50°C，進(jìn)樣量l_5yL。8. -種三黃方制劑指紋圖譜構(gòu)建方法，其特征在于，取不同批次的三黃方制劑供試品 溶液按權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)所述的方法進(jìn)行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果，標(biāo)定共有峰，建立三黃 方制劑指紋圖譜。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的三黃方制劑指紋圖譜在三黃方制劑質(zhì)量控制和分析方法中的 應(yīng)用。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的三黃方制劑指紋圖譜在三黃方制劑入血成分的確定分析方 法中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N30/02GK106018577SQ201610305751
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月10日
【發(fā)明人】劉慶豐, 鐘明康, 焦正, 王文健, 劉毅, 王斌, 施孝金, 李中東
【申請人】復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院