地烏藥材hplc-uv特征圖譜構建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種地烏藥材高效液相色譜(HPLC)特征圖譜建立方法，屬于中藥分析檢測領域，以解決地烏藥材質量控制的問題。所述方法包括以下步驟：(1)對照品溶液的制備；(2)供試品溶液的制備；(3)色譜條件的建立；(4)特征圖譜的構建。本發(fā)明具有操作簡單、精確可靠、重復性好等優(yōu)點，可較全面檢測地烏藥材中多種主要有效成分，從而構建地烏藥材HPLC?UV特征圖譜。
【專利說明】
地烏藥材HPLC-UV特征圖譜構建方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及中藥質量控制領域，特別是涉及中藥地烏特征圖譜的構建方法。
【背景技術】
[0002] 中藥質量控制是指采用必要的分析方法和檢測手段監(jiān)控中藥的質量，以保證中藥 用藥的安全性、有效性、穩(wěn)定性和可控性。由于中藥材種類繁多，化學成分復雜，導致中藥質 量控制的發(fā)展水平一直無法滿足現(xiàn)代中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展?，F(xiàn)行的中藥質量控制模式多借鑒國 外化學藥品質量控制模式建立，只針對某一個或幾個成分進行含量測定，這不能很好地反 映中藥的復雜性和整體性。因此，提升中藥的質量標準，加強質量控制，才能保證中藥用藥 安全，實現(xiàn)中藥的"安全、有效、穩(wěn)定、可控"（徐翔等，上海中醫(yī)藥雜志，2006，40(3): 50-51)。
[0003] 中藥指紋圖譜系指中藥材或中藥制劑經(jīng)適當處理后，采用一定的分析方法得到的 能夠體現(xiàn)中藥材或中藥制劑整體特性的圖譜，并結合數(shù)理統(tǒng)計方法，通過相似度評價中藥 材及其制劑質量的優(yōu)劣，能較全面反映中藥中所含化學成分的種類和數(shù)量，從而反映出中 藥內在質量。中藥指紋圖譜越來越多的應用于中草藥的鑒別和質量控制，世界衛(wèi)生組織 (WH0)、美國食品藥品管理局(FDA)、英國草藥典、德國藥用植物學會等均接受指紋圖譜的質 量控制方法，表明指紋圖譜已成為國際公認的控制中藥及天然藥物質量的有效方法（易倫 朝等，色譜，2008,26(2): 166-171)。
[0004] 2010版《中國藥典》首次建立了HPLC"指紋/特征圖譜"方法，以控制部分中藥品種 的質量，2010版《中國藥典》收載HPLC指紋圖譜共13項，如三七總皂苷、莪術油和積血草總苷 等，收載HPLC特征圖譜共7項，包括人參總皂苷、茵陳提取物和滿山紅油等。2015版《中國藥 典》中，收載HPLC指紋圖譜共22項，在2010版《中國藥典》基礎上添加血脂康片、抗宮炎片、清 開靈注射液等，收載HPLC特征圖譜共38項，在2010版《中國藥典》基礎上添加羌活、沉香、抗 病毒口服液、銀黃片等。指紋圖譜的應用，可有效控制中藥質量，促進中藥現(xiàn)代化。但不同產(chǎn) 地、不同采收季節(jié)、不同制藥企業(yè)藥材加工工藝等導致同一種中藥采用同一個"指紋圖譜" 控制，難度較大。因此，采用"特征圖譜"方法控制中藥質量，只對主要共有特征峰的相對保 留時間做出規(guī)定，忽略峰面積較小的峰，更符合中藥的特點，也是中藥質量控制發(fā)展的主要 方向。
[0005] 地烏為毛茛科銀蓮花屬植物林蔭銀蓮花Anemone flaccida Fr.Schmidt的干燥根 莖，又名黑地雷、金串珠、蜈蚣三七等，其性溫，味辛、微苦，主產(chǎn)于湖北和貴州，此外，四川、 浙江、湖南等地均有分布(南京中醫(yī)藥大學，中藥大辭典(第二版），2005:1115)，具解毒、祛 風濕之功效，臨床用于治療風濕痹痛、跌打損傷等癥，在民間廣泛用于風濕性和類風濕性關 節(jié)炎的治療。
[0006]植物化學及藥理學研究表明，齊墩果烷型三萜皂苷是地烏的主要活性成分(韓林 濤等，中藥材，2009，32(7): 1059-1062)，具有抗炎、抗過敏、抗組織胺和免疫調節(jié)等作用(邴 飛虹等，中國藥科大學學報，2008，39(6): 496-499)。以地烏總皂苷為原料制成的中藥五類 新藥"地烏風濕安膠囊"（邴飛虹等，湖北中醫(yī)雜志，2005,27(1):48-49)，具有良好的抗類風 濕性關節(jié)炎作用，目前正在進行m期臨床研究，具有廣闊的開發(fā)應用前景。
[0007] 目前，對地烏的質量標準研究主要集中在應用紫外-可見分光光度(uv-Vis)法測 定總皂苷含量(王愛民，中國藥房，2007,18(21): 1654-1655)和應用高效液相色譜(HPLC)法 測定地烏中單個化合物含量(趙慧男等，中藥材，2013,36(10): 1632-1634)，而未對地烏中 的特征性化學成分進行研究，缺乏對地烏藥材的整體質量評價。

【發(fā)明內容】

[0008] 基于此，本發(fā)明的目的在于構建一種地烏藥材HPLC-UV特征圖譜的方法，為地烏藥 材的整體質量評價提供有效方法，進一步為地烏風濕安膠囊的質量保證提供物質基礎。
[0009] 本發(fā)明涉及的地烏藥材HPLC-UV特征圖譜的構建方法，采用的具體技術方案如下：
[0010] (1)對照品溶液的制備
[0011] 精密稱取減壓干燥至恒重的anhuienoside E、glycoside St_14a、 hemsgiganoside B、flaccidosideII、hederasaponin B對照品適量，加30%乙臆制成濃度 為0.2~0.5mg ? mL-1的混合對照品溶液，濾過，即得。
[0012] (2)供試品溶液的制備
[0013]取地烏藥材樣品粉末約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50~100%甲 醇，稱重，超聲提取，放冷，補足減失的重量，搖勻，用〇.22mi濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。 [0014] (3)HPLC-UV色譜條件的建立
[0015] 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱;流動相：乙腈-0.01 %三氟乙酸溶液(30: 70); 檢測波長:200~220nm;流速:0 ? 8~1 ? 2mL ? min-1;柱溫:20~50 °C ;進樣量:2~20此。
[0016] (4)特征圖譜的構建
[0017] 分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液，注入高效液相色譜儀進行測定，記錄色 譜圖，采用"中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版)"軟件對所得色譜圖進行處理，得 到地烏藥材的對照特征圖譜，采用計算相對保留時間的方法確定共有峰的辨認。
[0018] 步驟(3)中所應用的高效液相色譜儀為Agilent 1260或Ultimate 3000,色譜柱為 卩]16110111611611^1111&(]18柱，規(guī)格為4.61]1111\25〇1]1111，5_，或(]〇811108；[15(]18-]\ /[3-11柱，規(guī)格為 4.6mmX250mm，5ym，或U11imate XB-Cis柱，規(guī)格為4? 6mmX250mm，5ym。
[0019]上述地烏藥材HPLC-UV特征圖譜構建方法所得到的特征圖譜中有5個特征共有峰， 其中以4號峰f laccidoside II為參照物峰，峰1為anhuienoside E，相對保留時間0.46;峰2 為glycoside St_14a，相對保留時間0.53;峰3為hemsgiganoside B，相對保留時間0.66;峰 4為flaccidosidell，相對保留時間1.00;峰5為hederasaponin B:相對保留時間1.07。各色 譜峰的相對保留時間應在規(guī)定值的± 1 〇 %之內。
[0020] 本發(fā)明是在對地烏進行系統(tǒng)化學成分研究的基礎上，通過HPLC-UV法提供了一種 地烏藥材多指標成分的HPLC-UV特征圖譜的構建方法。本發(fā)明具有操作簡單、精確可靠、重 復性好等優(yōu)點，可較全面檢測地烏藥材中多種主要有效成分，從而構建特征圖譜，為地烏藥 材的整體質量評價提供有效方法，進一步為地烏風濕安膠囊的質量保證提供物質基礎。
【附圖說明】
[0021] 圖1為實施例1中地烏主要化學成分的分離流程圖；圖2為實施例1中的 anhuienoside E的高分辨質譜圖；圖3為實施例1中的anhuienoside E的核磁共振氫譜圖； 圖4為實施例1中的anhuienoside E的DEPT圖與核磁共振碳譜圖；圖5為實施例1中的 glycoside St_14a的高分辨質譜圖；圖6為實施例1中的glycoside St_14a的核磁共振氫譜 圖；圖7為實施例1中的glycoside St-14a的DEPT圖與核磁共振碳譜圖；圖8為實施例1中的 hemsgiganoside B的高分辨質譜圖；圖9為實施例1中的hemsgiganoside B的核磁共振氫譜 圖；圖10為實施例1中的hemsgiganoside B的DEPT圖與核磁共振碳譜圖；圖11為實施例1中 的flaccidoside II的高分辨質譜圖；圖12為實施例1中的f laccidosidell的核磁共振氫譜 圖；圖13為實施例1中的flaccidosidell的DEPT圖與核磁共振碳譜圖；圖14為實施例1中的 hederasaponin B的高分辨質譜圖；圖15為實施例1中的hederasaponin B的核磁共振氫譜 圖；圖16為實施例1中的hederasaponin B的DEPT圖與核磁共振碳譜圖；圖17為實施例2中的 供試品與對照品溶液色譜峰疊加圖；圖18為實施例2中的供試品溶液(A)與混標溶液(B)鏡 像圖及各色譜峰的紫外光譜圖；圖19為實施例2中的供試品溶液(A)與混標溶液(B)鏡像圖 及各色譜峰所對應的結構式；圖20為實施例2中的地烏藥材供試品溶液的總離子流圖；圖21 為實施例2中的17批不同產(chǎn)地地烏藥材特征圖譜匹配圖；圖22為實施例2中的地烏藥材HPLC 對照特征圖譜；
【具體實施方式】
[0022]以下結合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步闡述。
[0023] 供試樣品來源：17批地烏(Anemone flaccida Fr.Schmidt)藥材均采自湖北省長 陽縣，海拔位于1500~1800米，見表1。
[0024] 表1 17批地烏藥材來源
[0027]儀器:Bruker AV-400型核磁共振波譜儀;Agilent 6210ESI/T0F質譜儀;Agilent 1260分析型高效液相色譜儀(G1311C四元栗，G1329B自動進樣器，G1316A柱溫箱，G1314F紫 外檢測器，Agilent色譜工作站）；Agilent 6210LC/MSD T0F質譜儀；電子分析天平(感量： 0. lmg;0.01mg,德國Sartorius公司）；KQ-3000E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公 司，功率300W，頻率40KHz);Dire Ct-Q5型超純水機(美國Millipore公司）；微孔濾膜(天津市 津騰實驗設備有限公司）。
[0028] 試劑:色譜純乙腈(德國Merck公司），色譜純甲醇(德國Merck公司），水為自制超純 水，其他試劑均為分析純。
[0029] 實施例1地烏藥材中主要化學成分的制備、純化和結構鑒定
[0030] 如圖1所示，取地烏總皂苷110g，用300mL水溶解后，上樣于已處理好的MCI小孔樹 脂柱，依次用水、15 %、30 %、50 %、70 %和90 %甲醇洗脫，收集70 %甲醇洗脫部位，減壓濃縮 至干，得干浸膏（39.36g)。浸膏用50 %甲醇溶解，上樣于0DS柱，60 %~95 %甲醇梯度洗脫， 其中60%甲醇洗脫部位經(jīng)56口1^(1611^-20凝膠柱色譜及制備型1^]^分離[&381]1〇8；[15&8-MS- n (20mm X 250mm，5M1)色譜柱，流動相為30 %乙腈-0.01 %三氟乙酸水溶液，流速為 6.0mL ? min-I，得到化合物2(300mg)和3(200mg)，65%甲醇洗脫部位經(jīng)制備型HPLC分離 [Cosmosil5Ci8HVIS-n (20mmX250mm，5iim)色譜柱，流動相為32%乙臆，流速為6.0mL ? min 一M，得到化合物1(32011^)。70%甲醇洗脫部位經(jīng)制備型HPLC分離[Cosmosil 5C18-MS-n (20mm X 250mm, 5_)色譜柱，流動相為45 %乙醇，流速為6 . OmL ? min-M，得到化合物4 (500mg#P5(200mg)。
[0031] 所述制備型HPLC的色譜條件如下：
[0032]色譜柱：Cosmosi 1 5C18-MS- II (20mm X 250mm，5_);柱溫：30。(：；檢測波長：210nm; 流速:6mL ? min-1;進樣量:0.2mL。
[0033]采用波譜學方法鑒定各化合物的結構，各理化數(shù)據(jù)如下：
[0034] 化合物1 :anhuienoside E，無定形白色粉末，其化學結構如下所示：
[0036] HR-ESI-MS m/z 1233.6274[M-H] -，分子式為C6qH98〇26,高分辨質譜圖如圖2所示。
[0037] XH NMR(400MHz,pyridine-d5)8H：6.57(lH,br s,H-r),6.25(lH,d,J = 7.4Hz,H-1"，），5.86(lH，br s，H-l""，），5.43(lH，br s，H-12)，5.01(lH，d，J = 7.2Hz，H-l""），4.96 (lH，d，J = 7.0Hz，H-l，），3.37(lH，dd，J=11.5,3.6Hz，H-3)，1.27(3H，s，H3-23)，1.26(3H， s，H3-27)，1.21(3H，s，H3-24)，1.10(3H，s，H3-26)，0.91(6H，s，H3-29,30)，0.88(3H，s，H 3-25) dnhuienoside E的核磁共振氫譜如圖3所示。
[0038] 13C NMR( 100MHz，pyridine_d5)數(shù)據(jù)見表Saanhuienoside E的核磁共振碳譜如圖4 所示。
[0039] 參考文獻：YE W C，ZHANG Q W，ZHA0 S X，et al .Four New oleanane Saponin from Anemone anhuiensis[J].Chemical and Pharmaceutical Bulletin,2001,49(5)； 632-634.
[0040] 化合物2:glycoside St_14a，白色無定形粉末，其化學結構如下所示：
[0042] HR-ESI-MS m/z 1101.5488[M-H]-，分子式為C54H86〇23，glycoside St-14a的高分 辨質譜圖如圖5所示。
[0043] 1HMffi(400MHz，pyridine-d5)SH:6.07(lH，d，J = 7.6Hz，H-l，，），5.69(lH，brs，H-l，，，，），5.25(lH，br s，H-12)，4.93(lH，d，J = 7.8Hz，H-l"，），4.89(lH，d，J = 7.5Hz，H-l，）， 3.27(lH，dd，J=11.3,3.2Hz，H-3)，1.19(3H，s，H3-23)，1.14(3H，s，H3-27)，0.92(3H，s，H 3-26)，0.88(3H，s，H3-24)，0.79(3H，s，H3-29)，0.76(3H，s，H 3-30)，0.73(3H，s，H3-25)。 glycoside St_14a的核磁共振氫譜如圖6所示。
[0044] 13C NMR(100MHz，pyridine-d5)數(shù)據(jù)見表Saglycoside St_14a的核磁共振碳譜如 圖7所示。
[0045] 參考文獻：韓林濤，黃芳.鵝掌草根莖三萜皂苷類成分研究[J].中藥材，2009，32 (7):1059-1062.
[0046] 化合物3:hemsgiganoside B，白色無定形粉末，其化學結構式如下所示：
[0048] -￡51_]\^111/2 955.4901[]\1-11]-，分子式為〇481176〇19，1161118818311081(16 8的高分辨 質譜圖如圖8所示。
[0049] 1HMffi(400MHz，pyridine-d5)SH:6.20(lH，d，J = 8.1Hz，H-r)，5.36(lH，brs，H-12)，5.02(lH，d，J = 7.7Hz，H-l" '），5.00(lH，d，J = 7.9Hz，H-l'），3.36(lH，dd，J=11.5， 4.0Hz，H-3)，1.28(3H，s，H-23)，1.24(3H，s，H3-27)，1.05(3H，s，H 3-26)，0.97(3H，s，H3-24)， 0 ? 86 (3H，s，H3-29)，0 ? 85 (3H，s，H3-30)，0 ? 82(3H，s H3-25) Aemsgiganoside B的核磁氫譜 數(shù)據(jù)如圖9所示。
[0050] 13C NMR(100MHz，pyridine-d5)數(shù)據(jù)見表Sahemsgiganoside B的核磁碳譜數(shù)據(jù)如 圖10所示。
[0051]參考文獻：CHEN Y，CHIU M H,GU K，et al ? Cucurbitacin and triterpenoid glycosides from Hemsleya giganthy[J].Chinese Chemical Letters，2003，14(5):475-478.
[OO52] 化合物4:flaccidosideII，白色無定形粉末，其化學結構式如下所示：
[0054] HR-ESI-MS m/z 1203.6172[M-H]-，分子式為C59H96〇25，flaccidosideII 的高分辨 質譜圖如圖11所示。
[0055] 1HMffi(400MHz，pyridine-d5)SH:6.55(lH，brs，H-l，，），6.26(lH，d，J = 8.0Hz，H-1"，），5.88(lH，br s，H-l，，，，，），5.39(lH，br s，H-12)，5.01(lH，d，J = 7.8Hz，H-l，，，，），4.84 (lH，d，J = 7.2Hz，H-l，），3.32(lH，dd，J=11.6,3.7Hz，H-3)，1.26(3H，s，H3-23)，1.25(3H， s,H3-27)a.21(3H,s,H3-26)a.ll(3H,s,H3-24),0.90(9H,s,H3-25,29,30)〇flaccidoside II的核磁氫譜數(shù)據(jù)如圖12所示。
[0056] 13C NMR( 100MHz，pyridine_d5)數(shù)據(jù)見表2<^laccidoside II 的核磁碳譜數(shù)據(jù)如圖 13所示。
[0057] 參考文獻：
[0058] [1]范春林，王英，王貴陽，等.從地烏藥材中同時制備WjPW3的方法：中國， 201310488046.8[P],2015-7-1.
[0059] [2]Zhao L,Chen ff M,Fang Q C.Two New Oleanane Saponins from Anemone flaccida[J].Planta Medica,1991,57(6):572-574.
[0060] 化合物5:hederasaponin B，白色無定形粉末，其化學結構式如下所示：
[0062] 151-]\^111/2 1203.6174[]\1-11]-，分子式為〇591196〇25。116(16瓜83口0111118的高分辨 質譜圖如圖14所示。
[0063] 1HNMR(400MHz，pyridine-d5)SH:6.26(lH，d，J = 8.2Hz，H-l，，，），6.13(lH，brs，H-1"），5.87(lH，br s，H-l，，，，，），5.43(lH，br s，H-12)，5.01(lH，d，J = 8.1Hz，H-l，，，，），4.93 (lH，d，J = 5.1Hz，H-l，），3.26(lH，dd，J=12.0,3.6Hz，H-3)，1.27(3H，s，H3-23)，1.19(3H， s，H3-27)，1?12(3H，s，H3-26)，1.09(3H，s，H3-24)，0?92(9H，s，H 3-25，29，30)。 hederasaponin B核磁共振氫譜圖如圖15所示。
[0064] 13C NMR( 100MHz，pyridine_d5)數(shù)據(jù)見表Sahederasaponin B核磁共振碳譜圖如圖 16所示。
[0065] 參考文獻：
[0066] [1]范春林，王英，王貴陽，等.從地烏藥材中同時制備WjPW3的方法：中國， 201310488046.8[P],2015-7-1.
[0067] [2]SAN0 K,SANADA S,IDA Y,et al.Studies on the constituents of the bark of Kalopanax pictus Nakai[J].Chemical and Pharmaceutical Bulletin,1991, 39(4):865-870.
[0068] 表2 化合物 1-5碳譜數(shù)據(jù)（100MHz，pyridine-d5)

[0071]實施例2地烏藥材特征圖譜構建方法 [0072] (1)對照品溶液的制備
[0073] 精密稱取各對照品適量，加30%乙腈分別制成anhuienoside E(0.25mg ? mL-i)、 glycoside St_14a(0?25mg ? mL-1)、hemsgiganoside B(0?25mg ? mL-1)、flaccidosideII (0.5mg ? mL-Ihederasaponin B(0.25mg ? mL-〇的對照品溶液，濾過，即得。
[0074] 表3對照品純度
[0076] 注:S為參照物峰
[0077] (2)供試品溶液的制備
[0078] 取地烏藥材樣品粉末約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇 50mL，稱重，超聲提取，放冷，補足減失的重量，搖勻，用0.22M1濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0079] (3)HPLC_UV色譜條件的建立
[0080] 將步驟(2)的供試品溶液進行高效液相色譜法測定，色譜條件為：
[0081 ] Agilent 1260型高效液相色譜儀；色譜柱：Phenomenex Luna Ci8(4.6mmX250mm,5 _);流動相：乙腈-o ? 01 %三氟乙酸溶液(30:70);檢測波長:210nm;流速：1 ? OmL ? min-1;柱 溫：30°C;進樣量：10此。
[0082] (4)采用對照品對色譜峰進行確認
[0083]采用上述色譜條件檢測地烏藥材供試品溶液和對照品溶液，并采用二極管陣列檢 測器(DAD)在190~400nm處進行全波長掃描，記錄色譜圖，對比供試品溶液和對照品溶液各 色譜峰的保留時間和紫外吸收特征。供試品與對照品溶液主要色譜峰疊加圖如圖17所示， 供試品溶液(A)與混標溶液(B)鏡像圖及各色譜峰的紫外光譜圖如圖18所示。
[0084] 根據(jù)對照品和供試品溶液中各主要色譜峰的紫外吸收特征和保留時間，對各色譜 峰進行化學指認，供試品溶液(A)與混標溶液(B)鏡像圖及各色譜峰所對應的結構式如圖19 所示。
[0085] (5)采用HPLC-ESI -MS技術對色譜峰進行確認
[0086]質譜條件:離子源:ESI (負離子模式）；干燥器溫度:325°C ;干燥氣流速:9L ? mirT1; 毛細管電壓:4.0kV;掃描質核比范圍：100~1500;自動參比離子:119.0363和1033.9881。 [0087]取地烏藥材供試品溶液在上述色譜條件和質譜條件下進行檢測，地烏藥材供試品 溶液的總離子流圖如圖20所示。各共有峰的保留時間和分子式如表4所示。
[0088]表4共有峰的保留時間和分子式
[0090] (6)特征圖譜的建立
[0091] 采用"中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版)"軟件對17批地烏藥材供試品 溶液色譜峰進行分析，采用中位數(shù)法，時間窗〇. 1，以4號峰f laccidoside II為參照物峰，經(jīng) 多點校正自動匹配后生成地烏藥材的HPLC對照特征圖譜。17批不同產(chǎn)地地烏藥材特征圖譜 匹配圖如圖21所示，共確定5個共有特征峰。地烏藥材HPLC對照特征圖譜如圖22所示。
[0092] 實施例3地烏藥材特征圖譜的測定方法
[0093] (1)供試品溶液的制備
[0094]取地烏藥材樣品粉末約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75 %甲醇 50mL，密塞，稱定重量，超聲處理40分鐘，放冷，再次稱定重量，用75%甲醇補足減失的重量， 搖勻，用0.22mi濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。
[0095] (2)高效液相色譜法測定
[0096] 將步驟(1)的供試品溶液進行高效液相色譜法測定，色譜條件為：
[0097] Agilent 1260型高效液相色譜儀；色譜柱：Cosmosil 5Ci8-MS-n (4.6mmX250mm,5 Mi);流動相：乙腈-0.01 %三氟乙酸溶液（30:70);檢測波長:205nm;流速：1. lmL ? min-1;柱 溫：35°C;進樣量:5yL。
[0098] 采用上述方法檢測地烏藥材供試品溶液，得到色譜圖，其他步驟同實施例2。
[0099] 實施例4地烏藥材特征圖譜的測定方法
[0100] (1)供試品溶液的制備
[0101 ]取地烏藥材樣品粉末約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75 %甲醇 50mL，密塞，稱定重量，超聲處理40分鐘，放冷，再次稱定重量，用75%甲醇補足減失的重量， 搖勻，用0.22mi濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。
[0102] (2)高效液相色譜法測定
[0103] 將步驟(1)的供試品溶液進行高效液相色譜法測定，色譜條件為：
[0104] Agilent 1260型高效液相色譜儀；色譜柱：Ultimate XB-Ci8(4.6mmX250mm，5iim); 流動相：乙腈-0.01 %三氟乙酸溶液(30:70);檢測波長:200nm;流速：1.2mL ? min-1;柱溫:40 °C;進樣量：15此。
[0105] 采用上述方法檢測地烏藥材供試品溶液，得到色譜圖，其他步驟同實施例2。
[0106] 實施例5地烏藥材特征圖譜的測定方法
[0107] (1)供試品溶液的制備
[0108] 取地烏藥材樣品粉末約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇 50mL，密塞，稱定重量，超聲處理40分鐘，放冷，再次稱定重量，用75%甲醇補足減失的重量， 搖勻，用0.22mi濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。
[0109] (2)高效液相色譜法測定
[0110] 將步驟(1)的供試品溶液進行高效液相色譜法測定，色譜條件為：
[0111] Ultimate 3000型高效液相色譜儀；色譜柱：Phenomenex Luna Ci8(4.6111111X250111111， 5_);流動相：乙腈-0.01 %三氟乙酸溶液(30:70);檢測波長:215nm;流速:0.8mL ? min-1;柱 溫:20°C;進樣量:20yL。
[0112] 采用上述方法檢測地烏藥材供試品溶液，得到色譜圖，其他步驟同實施例2。
[0113] 實施例6地烏藥材特征圖譜的測定方法
[0114] (1)供試品溶液的制備
[0115] 取地烏藥材樣品粉末約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇 50mL，密塞，稱定重量，超聲處理40分鐘，放冷，再次稱定重量，用75%甲醇補足減失的重量， 搖勻，用0.22mi濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。
[0116] (2)高效液相色譜法測定
[0117] 將步驟(1)的供試品溶液進行高效液相色譜法測定，色譜條件為：
[0118] Ultimate 3000型高效液相色譜儀；色譜柱：Cosmosil 5Ci8-MS-n (4.6111111X250111111， 5_);流動相：乙腈-0.01%三氟乙酸溶液(30:70);檢測波長:220nm;流速:0.9mL.min-S柱 溫:25°C;進樣量:20yL。
[0119] 采用上述方法檢測地烏藥材供試品溶液，得到色譜圖，其他步驟同實施例2。
[0120] 實施例7地烏藥材特征圖譜的測定方法
[0121] (1)供試品溶液的制備
[0122] 取地烏藥材樣品粉末約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇 50mL，密塞，稱定重量，超聲處理40分鐘，放冷，再次稱定重量，用75%甲醇補足減失的重量， 搖勻，用0.22mi濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。
[0123] (2)高效液相色譜法測定
[0124] 將步驟(1)的供試品溶液進行高效液相色譜法測定，色譜條件為：
[0125] Ultimate 3000型高效液相色譜儀；色譜柱：Ultimate XB-Ci8(4.6mmX250mm，5ii m);流動相：乙腈-0.01 %三氟乙酸溶液（30: 70);檢測波長：210nm;流速：1.2mL ? min-1;柱 溫:40°C;進樣量:5yL。
[0126]采用上述方法檢測地烏藥材供試品溶液，得到色譜圖，其他步驟同實施例2。
[0127] 實施例8地烏藥材特征圖譜建立方法的驗證
[0128] 1、儀器精密度試驗
[0129] 取地烏藥材樣品S 2，按實施例2中步驟(2)制備供試品溶液，采用實施例2中步驟 (3)的色譜條件進行檢測，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。以4號峰(flaccidosidell)為參照物 峰(S)，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，結果見表5和表6。
[0130] 表5儀器精密度試驗的相對保留時間計算結果(n = 6)
[0132] 注:S為參照物峰
[0133] 表6儀器精密度試驗的相對峰面積計算結果(n = 6)
[0135] 注:S為參照物峰
[0136] 結果表明，供試品溶液中各共有峰的相對保留時間的RSD值小于0.08%，相對峰面 積的RSD值小于0.61%，表明儀器的精密度良好。以第一次進樣所得的圖譜作為參照，采用 "中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版"軟件進行分析，計算進樣6次所得特征圖譜的 相似度，結果表明，相似度均為1. 〇〇〇，相似度良好，見表7。
[0137] 表7儀器精密度試驗的相似度計算結果(n = 6)
[0139] 2、方法重復性試驗
[0140] 取地烏藥材樣品S2,按實施例2中步驟(2)平行配制地烏藥材供試品溶液6份，采用 實施例2中步驟(3)的色譜條件進行檢測，記錄色譜圖。以4號峰(flaccidosidell)為參照物 峰(S )，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，見表8和表9。
[0141] 表8重復性試驗的相對保留時間計算結果(n = 6)
[0143] 注:S為參照物峰
[0144] 表9重復性試驗的相對峰面積計算結果(n = 6)
[0146] 注:S為參照物峰
[0147] 結果表明，各共有峰的相對保留時間的RSD值小于0.11%，相對峰面積的RSD值小 于1.60%，表明方法的重復性良好。以第一次進樣所得的圖譜作為參照，采用"中藥色譜指 紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版"軟件進行分析，計算6份供試品溶液所得特征圖譜的相似 度，結果表明，相似度均為1.000,相似度良好，見表10。
[0148] 表10重復性試驗的相似度計算結果(n = 6)
[0150] 3、樣品穩(wěn)定性試驗
[0151] 取樣品S2,按實施例2中步驟(2)的方法配制地烏藥材供試品溶液，采用實施例2中 步驟(3)的色譜條件分別于制備后的0、2、4、6、8、12、24、36、48h進行檢測，記錄色譜圖。以4 號峰(flaccidosidell)為參照物峰(S)，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，見表 11和表12。
[0152] 表11穩(wěn)定性試驗的相對保留時間計算結果(n = 9)
[0154] 注:S為參照物峰
[0155] 表12穩(wěn)定性試驗的相對峰面積計算結果(n = 9)
[0157] 注:S為參照物峰
[0158] 結果表明，各共有峰的相對保留時間的RSD值小于0.15%，相對峰面積的RSD值小 于0.36%，表明供試品溶液在48h內穩(wěn)定性良好。以第Oh進樣所得的圖譜作為參照，采用"中 藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版"軟件進行分析，計算供試品溶液所得特征圖譜的 相似度，結果表明，相似度均為1. 〇〇〇，相似度良好，見表13。
[0159] 表13穩(wěn)定性試驗的相似度計算結果(n = 9)
[0161] 實施例9地烏藥材特征圖譜各色譜峰相對保留時間的確定
[0162] 根據(jù)實施例2~實施例7采用不同高效液相色譜儀(Agilent 1260高效液相色譜儀 和Ultimate 3000高效液相色譜儀）和不同色譜柱[Phenomenex Luna Ci8(4.6mmX250mm，5ii m)、Cosmosil 5Ci8-MS_ II (4 ? 6mmX 250mm，5ym)和Ultimate XB_Ci8(4 ? 6mmX 250mm，5_)]所 測定的各色譜峰與參照物峰(flaccidosidell )的相對保留時間值，取平均值作為地烏藥材 特征圖譜中各特征峰與參照物峰(flaccidosidell)之間的相對保留時間值，如表14所示。
[0163] 表14各色譜峰相對保留時間
[0165] 注:S為參照物峰
[0166] 通過對照品和HPLC-MS技術確認了特征圖譜的5個共有峰，以4號峰flaccidoside n為參照物峰(S)，特征峰1~5的相對保留時間分別為0.46(峰1，anhuienoside E)、0.53 (峰2，glycoside St_14a)、0 ? 66(峰3，hemsgiganoside B)、1 ? 00(峰4，flaccidoside II )和 1.07(峰5，116(16抑83口〇11；[1113)，并規(guī)定5個共有峰的相對保留時間應在規(guī)定值的±10%之 內。
[0167] 實施例10地烏藥材特征圖譜相似度的考察
[0168] 1、17批地烏藥材的測定和HPLC特征圖譜的獲得
[0169] 17批地烏藥材均由廣州康和藥業(yè)有限公司提供，按照實施例2中的步驟(2)制備供 試品溶液，采用實施例2中的步驟(3)的色譜條件對17批地烏藥材供試品溶液進行測定，記 錄色譜圖。
[0170] 2、地烏藥材HPLC特征圖譜相似度考察
[0171]采用"中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版"軟件對17批地烏藥材供試品溶 液HPLC色譜圖進行分析，計算每批地烏藥材HPLC特征圖譜的相似度，結果如表15所示。
[0173]由表19可知，17批地烏藥材HPLC特征圖譜與對照特征圖譜的相似度除個別批次 (S4)外，相似度均大于0.94，表明地烏藥材HPLC特征圖譜的建立方法重復性好，相似度高。
【主權項】
1. 地烏藥材HPLC-UV特征圖譜構建方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 對照品溶液的制備 精密稱取減壓干燥至恒重的anhuienoside E、glycoside St_14a、hemsgiganoside B、 :1^1已(3(^(1〇8丨(16 11、116(16瓜8&口〇11；[1113對照品適量，加30%乙臆制成濃度為0.2~0.511^· mL-1 的混合對照品溶液，濾過，即得； (2) 供試品溶液的制備 取地烏藥材樣品粉末約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50~100 %甲醇，稱 重，超聲提取，放冷，補足減失的重量，搖勻，用〇.22μπι濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得； (3) HPLC-UV色譜條件的建立 色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠柱； 流動相：乙腈-0.01 %三氟乙酸溶液(30:70); 檢測波長:200~220nm; 流速:〇 · 8~1 · 2mL · min-1; 柱溫：20~50 °C; 進樣量：2~20yL; (4) 特征圖譜的構建 分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液，注入高效液相色譜儀進行測定，記錄色譜圖， 采用"中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版)"軟件對所得色譜圖進行處理，得到地 烏藥材的對照特征圖譜，采用計算相對保留時間的方法確定共有峰的辨認。2. 根據(jù)權利要求1所述的地烏藥材HPLC-UV特征圖譜構建方法，其特征在于，步驟(3)所 述色譜柱為Phenomenex Luna Cis柱，規(guī)格為4.6mmX250mm，5ym，或Cosmosil 5Ci8-MS-n 柱，規(guī)格為4 · 6mm X 250mm，5μηι，或Ultimate XB-Cis柱，規(guī)格為4 · 6mm X 250mm，5ym〇3. 根據(jù)權利要求1所述的地烏藥材HPLC-UV特征圖譜構建方法，其特征在于，步驟(4)所 述地烏藥材特征圖譜中共有5個共有峰，其中，以4號峰flaccidoside Π 為參照物峰，峰1為 anhuienoside E，相對保留時間0.46;峰2為glycoside St_14a，相對保留時間0.53;峰3為 hemsgiganoside B，相對保留時間0.66;峰4為f Iaccidoside Π ，相對保留時間1.00;峰5為 116(16^83口〇11；[1113:相對保留時間1.07;各色譜峰的相對保留時間應在規(guī)定值的±10%之 內。
【文檔編號】G01N30/88GK105891403SQ201610488312
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年6月24日
【發(fā)明人】范春林, 王英, 楊偉群, 葉文才, 裴紅, 魯展雨
【申請人】廣州康和藥業(yè)有限公司